실험 척수 부상에서 척수 혈액 흐름의 평가를위한 향상된 초음파 이미징 대비

요약

Contrast Enhanced Ultrasound imaging is a reliable in-vivo tool for quantifying spinal cord blood flow in an experimental rat spinal cord injury model. This paper contains a comprehensive protocol for application of this technique in association with a contusion model of thoracic spinal cord injury.

초록

감소 척수 혈류 (SCBF) (즉, 허혈) 외상성 척수 손상 (SCI) 기전에 중요한 역할을하고 그에 따라 신경 치료를위한 중요한 목표이다. 여러 기술들이 SCBF을 평가하기 위해 설명되었지만, 이들은 모두 상당한 한계가있다. 후자를 극복하기 위해 실시간 콘트라스트 향상 초음파 영상 (CEU)의 사용을 제안한다. 여기에서 우리는 SCI의 쥐 타박상 모델이 기술의 응용 프로그램을 설명합니다. 경정맥 카테터 제 조영제, 육 불화 황 캡슐화 된 마이크로 버블의 염화나트륨 용액의 반복 된 주입 주입된다. 척추 후 맞춤형 3D 프레임으로 안정되고, 척수 경막은 ThIX-ThXII에서 후궁 절제술에 의해 노출된다. 초음파 프로브는 다음 (초음파 젤 코팅) 경막의 후방 측면에 위치한다. 콘트라의 기준 SCBF, 하나의 정맥 주사 (400 μl를) 평가하기세인트 제가 그대로 척수 미세 혈관 통로를 통해 기록에 적용된다. 중량 - 드롭 장치이어서 SCI의 재현성 실험 타박상 모델을 생성하는 데 사용된다. 조영제는 포스트 SCI SCBF 변화를 평가하기 위해 다음의 부상 15 분 재 주입된다. CEU는 실제 시간과 생체 내 SCI 다음 SCBF 변화의 평가를 할 수 있습니다. 손상되지 않은 동물에서, 초음파 영상은 척수 손상을 따라 불균일 혈류를 나타내었다. SCBF가 더 원격 그대로 지역에 보존 남아있는 동안 또한, 15 분 후 SCI는 중요한 허혈은 진원지의 수준에 있었다. 진앙 (주동이와 꼬리 모두)에 인접한 지역에서는 SCBF이 크게 감소 하였다. 이는 앞서 설명한 "허혈성 주변부 영역"에 대응한다. 이 도구는 허혈 및 SCI에 후속 얻어진 조직 괴사를 제한하는 목적으로 치료법의 효과를 평가하기위한 주요 관심사이다.

서문

외상성 척수 손상 (SCI)는 감각 운동에 상당한 손상, 자율 기능에 이르는 엄청난 조건이다. 지금까지 어떤 치료는 환자의 효율성을 입증하지 않았다. 이러한 이유로, 잠재적 인 치료의 평가를 더욱 향상시킬 부상 pathiophysiology ^{1 해명} 할 수있는 새로운 기술을 식별하는 것이 중요하다.

SCI는 주 및 보조 부상 불리는 두 순차적 단계로 구분된다. 주요 부상은 초기 기계적인 모욕에 해당한다. 또한 초기 병변, 조직 손상 때문에 신경 적자 ^2,3의 점진적 확장에 기여하는 보조 부상 그룹 (예 : 염증, 산화 스트레스 및 저산소증 등) 다양한 생물학적 이벤트의 폭포 반면.

SCI의 급성 단계에서, 신경 치료는 보조 부상 병리와 쉬를 줄이는 목표로따라서 신경 학적 결과를 개선 울드. 많은 보조 부상 이벤트 중 허혈은 중요한 역할 ^{4,5을한다.} SCI의 진원지의 수준에서 손상된 실질 미세 혈관 효과적인 척수 혈류 (SCBF을) 방해. 또한, SCBF도 크게 부상 진원지 특히 "허혈성 주변부 구역"으로 알려진 영역을 둘러싼 영역에서 감소된다. SCBF 빨리이 지역 내에서 복원 할 수없는 경우, 허혈 보충 실질 괴사 더욱 신경 조직의 손상을 초래할 수 있습니다. 조금이라도 조직 보존 기능의 상당한 효과를 가질 수있는 바와 같이, 허혈 후 SCI를 줄일 수 및 약물 치료법을 개발하는 주요 관심사이다. 이 현상을 강조하기 위해, 이전의 작품은 유수 축삭의 10 %의 보존을 보여 주었다 것은 이후 SCI ⁶ 고양이의 산책을 허용하기에 충분했다.

여러 기술들이 SCBF,을 평가하는 기술되었지만Y 모두 상당한 한계가있다. 예를 들어, 방사성 미소 ^7,8 및 C14-iodopyrine의 오토 라디오 그래피 ^(9)의 사용은 이후 동물의 희생을 요구하고 나중 포인트에서 반복 될 수 없다. 수소 클리어런스 기술 ^(10)는 척수 손상 될 수 척수 전극의 삽입에 따라 달라진다. 레이저 도플러 이미징, ^14,15 광 혈류 및 생체 내 광학 현미경 ^(16)은 측정 ^11-13 매우 제한된 깊이 / 면적을 가지고 있지만.

우리 팀은 이전에 대비 강화 된 초음파 (CEU) 영상이 실시간으로 평가하는 데 사용할 수있는 것으로 나타하고있다 생체 쥐 척수 실질 ¹⁷ SCBF 변경됩니다. 또한 유사한 기술이 황 동부 등에 의해 도포하는 것이 중요하다. SCI ¹⁸ 돼지 모델. CEU는 그레이 스케일 형태 메신저를 연관시킬 수 있습니다 초음파 영상의 특정 모드를 적용혈액 순환 ^(19)의 공간적 분포 (종래의 B 모드에 의해 수득) 세. SCBF 이미징 및 정량화 에코 - 조영제의 혈관 내 주입에 의존한다. 조영제 (평균 직경 2.5 μm의 직경 미만 갖는 6㎛의 90 %), 황 헥사 플루오 라이드 미세 기포로 구성된다 인지질을 안정화. 마이크로 버블 따라서 혈액 에코 및 혈액 흐름에 따른 조직의 증가 콘트라스트 향상 탐침에 의해 방출 된 초음파 빔을 반영한다. 이 반사 된 신호의 세기에 따른 관심의 주어진 영역에서 혈류를 평가하는 것이 가능하다. 마이크로 버블은 안전하고 임상 적 인간에 적용되었습니다. 육 불화 황 빠르게 클리어 (반감기 12 분을 의미 임) 및 육 불화 황 투여의 80 % 이상은 주입 후 2 분 이내에 호기 공기를 회수한다. 이 프로토콜은 CEU 메신저를 사용하는 간단한 방법을 제공한다쥐 SCBF 변화를 평가하기 위해 노화.

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프로토콜

참고 :이 원고에 기술 된 방법은 의학, 파리, 프랑스 (CEEALV / 2011-08-01)의 Lariboisière 학교의 생명 윤리위원회에 의해 승인되었다.

1. 장비 준비

1. 준비 및 카테터 삽입에 대한 다음과 같은 악기 청소 : 마이크로 포셉, 마이크로 가위, 마이크로 혈관 클램프, 큰 가위, 외과 스레드 (블랙 꼰 실크 4-0)과 14 G 카테터를. 헤파린 용액 (5000 U / mL)로 카테터를 Heparinize.
2. 준비하고 후궁 절제술에 대해 다음 악기 청소 : 큰 가위, 메스와 뼈 커터. 후궁 절제술 (도 1) 중에 척수 손상을주지의 위험을 줄이기위한 주문품 뼈 커터 후궁 절제술을 수행한다.
3. 설정 동물의 위치 및 안정화에 사용되는 3D 프레임을. 주문 제작 프레임은 집게와 관련하여 외고정 호프만 3의 요소로 내장되어 whicH는 동물의 요추를 맞추기 위해 만곡되어있다.
4. 척수 손상 역학적 사용 중량 드롭 장치 (임팩터)를 준비한다.
   주 : 주문품 박힘 장치가 3D 소프트웨어로 디자인 및 3D에 인쇄 하였다.
5. 초음파 기계를 켭니다.
6. 조영제의 재구성을위한 키트를 준비한다.
   주 : 키트는 동결 건조 분말 25 mg을 5 ml의 염화나트륨 및 하나의 미니 스파이크 반송 시스템 (도 2)를 함유 한 프리 필드 실린을 함유 한 유리 병을 포함한다. 조영제의 재구성하는 단계는 (섹션 5에서) 아래에 자세히 설명되어 있습니다.

2. 경정맥 도관 (그림 3)

1. 4 % 이소 플루 란 마취 동물. 앙와위에서 동물을 놓습니다. 발은 집게로 슬쩍 할 때 동물이 응답하지 않도록하여 적절한 마취를 확인합니다. 싶게 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 적용어 마취.
2. 목을 면도와 피부를 청소합니다. 목의 정중선에 절개를합니다. 경정맥을 찾기 위해 sternocleidomastoidian 근육 후퇴. 정맥의 주동이의 부분에 끈을 조입니다.
3. 정맥, 합자 아래 1cm에 미세 혈관 클램프를 적용합니다. 단지 클램프가 해제 될 때 조이 될 준비가 매듭 클램프 아래, 정맥 주위에 다른 스레드를 전달합니다.
4. 클램프와 주동이의 합자 사이의 정맥 (venotomy)의 벽을 엽니 다. 혈관의 내강에 14 G 카테터를 소개하고 심장을 향해 밀어 넣습니다.
5. 이 클램프에 오면, 후자를 해제하고 더 카테터를 밀어 넣습니다. 단단히 내부 카테터와 정맥에 매듭을 조여, 정맥 카테터를 고정합니다.
6. 카테터에 정맥혈을 소량 회수하고이어서 후 헤파린 염수로 그것을 플러싱하여 카테터의 개방성을 평가. 이것은 C의 방해를 방지잠재적 인 혈전에 의해 atheter.
7. 조영제 (마이크로 버블)의 추가 주입 용 카테터에 유연한 튜브를 연결합니다. 이 사용할 준비가 될 때까지 (밀봉)를 닫아 두십시오.

3. 척추 액세스, 후궁 절제술 및 쥐 위치 (3D 프레임에서)

1. 평면 경향이 수평 위치에 동물을 놓습니다. 면도 및 동물의 뒷면 (가슴 부분)을 청소합니다.
2. 촉진 (그림 4)에 의해 마지막 리브 (쥐의 XIIIth)를 확인합니다. 이것은 하나가 XIIIth 흉추 (ThXIII)의 위치를​​ 추정 할 수 있습니다.
3. ThXIII을 중심으로 중간 선에 4cm의 피부 절개를합니다. 피부 절개뿐만 아니라 기본 점액낭을 엽니 다. 등 근육의 건막뿐만 아니라 척추 등뼈 프로세스 팁을 관찰한다.
4. 조심스럽게 XIIIth 갈비를 palpating에 의해 ThXIII의 척추 프로세스를 현지화.
   참고 : XIIIth 리브 따라서 ThXIII에 연결되어 삶을에 쉽게를 나타냅니다ThXIII의 식별을위한 테 해부학 적 랜드 마크. 이 단계는 ThXII의 현지화가 극돌기뿐만 아니라 L1 및 L2 (제 1 및 제 2 요추는 척추를) ThIX 할 수 있습니다.
5. 근육 건막을 잘라 및 L2에 ThIX에서 가시 돌기, 박편 및 패싯 관절을 노출 양쪽에있는 근육을 분리합니다. 가로 과정에서 근육을 분리하여 L1과 L2의 측면 측면을 노출.
6. 위치 (그림 5)를 확보 할 수있는 3D 프레임에 동물의 앞니 치아 후크. 수정 된 집게로 L1과 L2는 척추를 클램프. 동물을 안정화하기 위해 3D 프레임에 수정 된 집게를 연결합니다.
7. 부드럽게 전체 척추를 강화하고 벤치에서 가슴을 상승하기 위해 꼬리 쪽 척추를 들고 집게를 잡아 당깁니다.
   참고 : 설명 구성에 동물이 호흡 할 수 있어야한다. 또한, 갈비뼈, 척추와 척추의 호흡 운동에도 불구하고코드는 움직이지 남아 있어야한다.
8. ThIX에서 ThXII에 가시 processess를 제거합니다. 부드럽게 ThXII의 좌측 박판 아래 뼈 커터 열등한 블레이드를 삽입하고 박판 (도 6)를 절단하기 위해 커터 뼈를 닫는다.
9. 오른쪽 얇은 판에 같은 기동을 반복하여 연속적으로 후방 아치를 제거합니다. 4 레벨 후궁 절제술을 달성하기 위해 ThIX으로는 척추의 ThXI위한 이전 단계를 반복한다. 각각의 척추 모두 패싯 관절을 제거합니다.
   참고 : 절차 전반에 걸쳐, 지역 출혈에서 수술 현장을 청소합니다. 이를 위해, 미지근한 식염수로 면봉과 관개를 사용합니다. 지혈 체계적으로 분 이내에 발생합니다.

4. CEU 프로브 위치

1. 초음파 젤 뇌경막을 커버. 이 프로브 및 척수 (도 7) 사이에 초음파의 효과적인 전송을 허용한다.
2. 초음파 프로브 재치를 안정이어서 다 관절 아암에 의해 3D 프레임에 접속 될 수 HA 클램프. 수동 프로브를 배치합니다. 프로브가 경사 종 시상 조각을 얻기 위해 지향되어 있는지 확인합니다. 정확한 위치에, 척수 이미지에 엄격히 수평 및 척수의 중심 관은 척수의 전체 세그먼트를 따라 볼 수있다.
   주 : 위치는 초음파 장치의 화면에 표시되는 실시간 B 모드 영상에 안내한다. 초음파 프로브의 초점 거리가 척수의 중심 관과 정렬되어야한다. 이때, 척수의 후방 측면은 궁극적 임팩터의 위치 허용되는 접근이다.
3. 때 최적의 위치를​​ 안정 관절 팔을 잠급니다.

조영제 5. 준비 - 마이크로 버블에서 재구성

1. 재구성 상업용 키트의 내용물을 이용하여 TIG를 조임으로써 플런저로드를 연결htly 주사기 (시계 방향)으로. 이송 시스템 물집을 열고 주사기 팁 캡을 제거합니다. 반송 시스템 캡을 열고 반송 시스템에 주사기를 연결 (단단히 고정).
2. 유리 병에서 보호 디스크를 제거합니다. 의 투명 슬리브에 유리 병을 밀어
3. 전송 시스템과 키를 눌러 제자리에 단단히 병을 고정합니다.
4. 플런저로드 밀어서 바이알에 주사기의 내용을 비운다. 유백색 균질 액을 얻었다 바이알에있는 모든 콘텐츠를 혼합하여 20 초 동안 격렬하게 흔들어.
5. 시스템을 전환하고 신중 주사기로 조영제를 철회. 반송 시스템에서 주사기를 푼다. (지시 한) 재구성 한 후, 얻어진 분산액을 1 ㎖ 마이크로 버블 8 μL 설퍼 헥사 플루오 라이드를 포함한다. 100 ML의 주사기에 마이크로 버블의 정지를 그립니다. 전기 펌프에 100 ML의 주사기를 삽입합니다. 뚜껑을 닫습니다.
6. 다시 일정 교반을 시작합니다편성 된 미세 기포. 마이크로 버블 서스펜션을 유지 주사기의 느린 회전에 의해 획득 일정한 교반. 유연한 튜브를 통해 경정맥 카테터에 펌프를 연결합니다. "고조파 모드"에 초음파 기계를 설정합니다.
   주 : 마이크로 버블은 특히 감지 및 가시화 할 수있는 모드로 후자에 해당한다. 이 모드는 B 모드 반대로 미세 기포를 파괴하지 않는 낮은 기계적 지수를 갖는다.
7. 조영제의 투여 제 (400 μL)을 주입하여 카테터를 제거. 이 첫 번째 주입하는 동안, 마이크로 버블은 초음파 화면에 표시 할 것을 확인합니다. 이것은 (쥐의 혈관에 주사기에서) 전체 회로가 손상 및 열려 있는지 확인합니다.
8. 척수 실질과 혈류에 남아있는 몇 안되는 미세 기포의 파괴를 시각화하기 위해 "B 모드"에 초음파 기계를 설정합니다. "B 모드"의 고주파 트란고장을 가능하게하는 미세 기포에 SMITS 높은 에너지.
9. 동물이 약 30 분 동안 계속 누워 보자. 이 기간은 혈역학 적 매개 변수의 안정화 수 있습니다.

그대로 척수에서 SCBF 6. 평가

1. "고조파 모드"에 초음파 기계를 설정합니다. 조영제 (400 μL) 및 (2)의 크로 동시에 (1) 주입을 시작합니다.
   주 : 주입 동안 혈류에 미세 기포의 농도가 척수 (도 8)의 콘트라스트 상상 가능하게 증가한다. 미세 기포를 신속하게 파괴되기 때문에, 미세 기포의 혈중 농도는 주입 척수의 콘트라스트 시각화 점진적인 감소를 발생시키는 감소 완료되면 시작한다.
2. 1 분, 선택 (보도) 초음파 기계의 "클립 저장"버튼 후. 이 연구의 1 분을 저장을 가능하게 할 것이다AW 초음파 데이터 기록 촬상 화상 (즉, 이전에 초음파 화면에 표시 하였다).
3. "B 모드"에 초음파 기계를 설정합니다. 이것은 잔류 마이크로 버블을 제거한다.

7. 실험 SCI

1. THX와 ThXI 사이의 교차점에, 임팩터의 팁 (척수의 중간 선에) 경막과 접촉되도록, 무게 드롭의 충돌 장치의 위치를 3D 프레임에 연결된 미세 조작기를 사용하여 (그림 9) .
   주 :이 단계는 초음파 장치 관찰 척수 분절의 중간에 해당한다. 스트라이커와 임팩터 바디의 직경이 8mm이다. 부상을 생성합니다 임팩터의 끝은, 직경 3mm이다.
2. 10cm 높이의 위치에 매복 장치의 스트라이커를 놓습니다. 매복 장치의 스트라이커를 해제함으로써 실험적 SCI를 유도한다. 스트라이커 폭포 해제 일전자 충격기, 척수 부상. 주문품 박힘이 10g 중량에 영향 당량 10cm의 높이에서 떨어 전달한다.

SCBF 5 분 후 SCI 8. 평가

1. 제 6 조 (SCBF의 평가)에 설명 된 단계를 반복합니다. 마이크로 버블은 (그림 10) 어두운 남아 손상된 미세 혈관과 부상 진원지를 통과 할 수 없습니다.

9. 동물 희생

1. 펜토 바르 비탈의 복강 내 주사 치사량 (100 mg)을 가진 동물을 안락사.

오프라인 분석에 의한 SCBF 10. 정량

1. (초음파 기계에) 정량에 사용되는 울트라 확장 소프트웨어를 시작합니다. "파일"을 선택하고 이전에 저장 한 원시 데이터를 선택하고 관련 파일을 엽니 다. (선택) "치 Q"버튼을 눌러서 "정량화 모드"활성화. 실리CT "SET 투자 수익 (ROI)"(버튼)과 원형을 선택합니다.
2. "투자 수익 (ROI)을 그립니다"를 선택 (버튼)와 척수 (그림 11)에 관심을 칠 인접한 원형 영역 (ROI)을 그립니다. "피팅"메뉴를 열고 기능 "커브 값"을 선택합니다. 각 ROI 내부에 미세 기포의 농도 변화에 대응하여, 여러 가지 곡선을 표시 소프트웨어를 관찰한다.
   참고 : 각각의 곡선은 "관류 - deperfusion"프로필을 가지고있다. 곡선의 첫 번째 단계는 평면이며, 마이크로 버블의 도착 전 기간에 상당한다. 두 번째 단계에서, 미세 기포의 농도를 신속하게 주입의 결과로 증가한다. 그들은 혈류 disintegratse으로 주입이 완료되면 시작 세 번째 단계에서, 미세 기포의 농도는 점차 감소한다.
3. C의 두 번째 단계의 시작 부분에 제 1 수직 선을 배치urve 및 "SET"를 선택합니다. 이 분석을 시작하기 위해 소프트웨어를 알려줍니다.
4. "SET"을 선택하면 다시 레코딩의 끝에서 두 번째 수직 라인을 놓고. 이 분석을 막을 수있는 소프트웨어를 알려줍니다.
5. "이력서"메뉴 봐 분석 "곡선 아래 영역"에 해당하는 "AUC"값을 기록한다. 이 값은 해당 ROI 내부 SCBF에 비례한다.

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결과

프로토콜은 상술, 그것은 길이 척수 시상 세그먼트 따라 SCBF를 매핑 할 수있다.

그대로 척수에서, 실질 (그림 12) 내에서 SCBF 부정이있을 나타납니다. 이는 다른 하나의 동물로부터 radiculo-수질 동맥의 가변 분포 (RMA)에 의해 설명 될 수있다. RMA는 전방 척추 동맥 (ASA)에 도달하므로 척수 실질 조직에 혈액 공급을 제공 동맥 분절을 지칭한다. 대조적으로, 동맥 radicular...

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토론

우리 래트 SCI 타박상 CEU 모델을 사용하는 방법을 설명 하였지만,이 프로토콜은 다른 실험 목적 또는 SCI 모델에 맞게 수정 될 수있다. 그러나 우리는 시간 지점의 수와 SCBF 측정치 사이의 지연이 다른 연구의 요구를 만족하도록 구성 될 수있다, (부상 및 15 분 후 - SCI 전에) 두 시점에서 SCBF를 측정하기 위해 선택했다. 예를 들어, 우리의 이전 연구 ^(17)에서, 우리는 첫 번째 시간에 걸쳐 후 SCI ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
External Fixator Hoffman 3	Stryker, Kalamazoo, USA		Modular system used to build the custom made 3D frame and the jointed arm holding the ultrasound probe
Toshiba Applio	Toshiba, Tokyo, Japan		Ultrasound machine
Sonovue	Bracco, Milan, Italy		Contrast agent : microbubbles
Vueject pump	Bracco, Milan, Italy		Electric pump for infusion of microbubbles bolus
Aquasonic Ultrasound Gel	Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA		Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves
Isovet	Piramal Healthcare, Mumbai, India		Isoflurane used for anesthesia
Ultra Extend	Toshiba, Tokyo, Japan		Software used for quantification of spinal cord blood flow
Mastercraft Five-piece Mini-pliers Set, Product #58-4788-6	Canadian Tire, Toronto, Canada		Set of pliers for Do-it-yourself job