자식 작용의 분석에<em&gt; 페니 chrysogenum</em&gt; 형광 현미경과 조합 기아 패드를 사용하여

요약

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

초록

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular ‘self-eating’) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called ‘starvation pads’ for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

서문

사상균은 발달 과정의 연구를위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 그들은 싼 재배, 자손 유전 적 접근성의 높은 번호와 같은 몇 가지 실험적인 혜택을 제공합니다. 마지막 포인트는 다양한 세포 메커니즘에 대한 이제까지의지지 않은 유전자의 중요성을 조사 허용 형질 전환 체의 건설을위한 특별한 관련이있다. 사상 균류는 잉여 및 / 또는 장애 세포 구성 요소의 제거를 위해 미토콘드리아 무결성과 자식 작용을 유지하고 유지하기위한 몇 가지 요소와 비정상적인 단백질, 미토콘드리아 역학의 분해 단백질 분해 효소 활동 등 셀룰러 품질 관리 경로의 메커니즘의 해명을위한 수단이되었습니다 기아 ^1,2,3 번에서 세포 생존 능력.

사상 균류 ² 자식 작용의 연구에 사용할 수있는 여러 가지 실험 기법이있다 : 공포의 (ⅰ) 조사 전프로테아제는 투과 전자 현미경 ^(4)에 의해 억제 될 때 F 이들은 치밀 포식 체를 포함하는, (II)의 형광 염료 monodansyl의 카다를 이용하여 형광 현미경 ^5,6- 산성화 autophagosomal 구조 (III) 검출을 통해 GFP-Atg8 병소 모니터링함으로써 autophagosomes 가시화 ^7.

여기에, 자식 작용의 연구에 페니 chrysogenum 성장의 새로운 방법을 제시한다. 주요 요소는 단순히 아가 살균 수돗물에 용해 된 1 %로 구성 '기아 패드'이다. 추가 화합물 (예, 스트레스는, 스 캐빈 저는, 자식 작용 변조기)만큼 그들은 자동 형광 표시되지 않는 패드에 첨가 될 수있다. 패드는 얕은 중앙 캐비티를 포함 현미경 슬라이드에 있습니다. 포자 현탁액 또는 작은 균사체 파편 중 하나 접종에이 패드. 관심의 변형이 sporulat하지 않았을 경우에는, 후자는 것이 좋습니다효율적 전자 (예를 들어, Δ의 atg1 균주 ^8). 슬라이드는 샘플의 탈수를 방지하기 위해 (이들 용이 빈 피펫 팁 박스를 사용하여 구성 될 수있다)하고, 실온에서 배양 습윤 챔버에 위치된다. P. chrysogenum 이러한 조건 하에서 몇일 성장할 수있다. 자식 작용은 곰팡이 자식 작용에 대한 긍정적 인 마커 액포 확대하여 현미경으로 관찰 할 수있다. 이 기여, P.에서 chrysogenum 변형 (위스콘신 54-1255)는 자사의 C 말단 'SKL'순서 ⁹ 퍼 옥시 솜를 대상으로 녹색 형광 단백질을 형성하는 데 사용됩니다. 그러므로 페 록시의 열화를 모니터링하는 것이 가능하다. 이는 적절한 위치 파악 신호를 이용하여도 셀 (예를 들면, 미토콘드리아)의 다른 구획에 라벨 그들의 열화를 분석 가능하다. P. 데이터 있지만 chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL)는 확실히 가능하고, 여기에 제시다른 진균에 대해서도 '기아 패드'방법을 사용하려면 (예를 들어, 뉴로 crassa의, Sordaria의 macrospora, 아스 페르 길 루스 종 등).

프로토콜

P. 1. 준비 chrysogenum 기아 실험에 대한

1. P. 경우 관심 chrysogenum 변형이 쌀 ( '녹색 쌀')에 보관되어, 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 균사체를 포자 덮여 2-3 쌀 곡물을 배치합니다. 500 μL의 YGG (10g / L의 KCl, 20g / ℓ의 포도당 10g / L 효모 질소베이스, 5g / ℓ K ₂ HPO _4, 20g / ℓ 효모 추출물)로 채 웁니다.
   1. 포자 효율적 벼에서 분리 할 수​​ 있도록 30 초 동안 와동 튜브.
   2. 실온에서 1 날 (예를 들어, 20 내지 25 °의 C)에 대해 튜브를 부화.
   3. 멸균 수돗물이 포자 현탁액의 1/50 희석을 준비, 잘 섞는다.
2. P. 경우 관심 chrysogenum 균주 한천 플레이트 (예 YGG 한천 플레이트)에 보관하고, 400 μL 무균 수돗물 약 100 mg을 GL을 함유하는 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브에 균사체의 작은 조각을 전송할멸균 된 이쑤시개 또는 피펫 팁을 사용하여 엉덩이 구슬.
   1. 소용돌이는 2 분 동안 튜브되도록 균사체 단편화된다. 즉시 튜브의 내용을 사용합니다.

P.의 재배 2. 준비 단계 기아 패드에 chrysogenum

1. 가열 접시에 전환하고 약 60 ° C로 설정합니다.
2. 전자 레인지 용액을 요리 수돗물 100 ㎖의 아가 2g을 녹인. 이 솔루션은 가열 후 완전히 명확주의하십시오. 그렇지 않은 경우, 아가 로스가 완전히 용해 될 때까지, 다시 조리. 아가로 오스 솔루션은 사용하기 전에 약 60 ° C로 냉각 보자.
3. 400 μL 멸균 탭 각 (추가 화합물이 첨가되지) 물이나와 (샘플의 수에 따라 2-4)를 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 채우기 400-X μL (단계 2.5 화합물 용액 ㎕의 x를 추가)하고이를 배치 적어도 1 분 동안 가열 플레이트 상으로되도록 와트어 내부에 따뜻한 가져옵니다.
4. 적어도 1 분 동안 가열 접시에 중앙 캐비티를 포함하는 현미경 슬라이드를 놓습니다.
5. 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브와 소용돌이 짧게에서 솔루션에 아가로 오스 400 μL 2 %를 추가합니다. 원하는 경우이 단계 후에, 추가 화합물 (즉, 1 μM 라파 마이신)를 추가합니다. 이 작업을 수행 할 경우, 소용돌이 각각의 추가 물질은 튜브에 피펫되어 잠시 후. 조기 고화를 방지하기 위해, 가열 테이블에 다시 넣어 튜브.
   주 : microcentrifuge 관의 총 부피는 800 ㎕를해야한다.

기아 패드를 포함하는 현미경 슬라이드 3. 준비

1. (정지 가열판에 위치) 현미경 슬라이드의 공동 내로 아가 용액 140 μL 피펫. 가능하면 거품을 피하기 위해보십시오.
2. 즉시 아가로 오스 솔루션 상에 커버 슬립을 배치합니다.
   참고 :이 평평한 표면에 발생합니다.
3. 마이크로 넣어약 4 분의 실험실 벤치 위에 범위 슬라이드 아가로 오스 패드를 응고시킬 것입니다.
4. 조심스럽게 엄지 또는 검지의 도움으로 그것을 떨어져 밀어 아가로 오스 패드에서 커버 슬립을 제거 (오염을 방지하기 위해 장갑을 착용!).
5. 탈수를 방지하기 위해 젖은 챔버로 패드 현미경 슬라이드를 놓습니다. 권장 사항 : 여전히 피펫 팁을 유지하기위한 삽입을 가진 빈 팁 상자를 사용합니다. 바닥이 적용되도록 상자에 멸균 물을 추가합니다. 삽입에 현미경 슬라이드를 놓고 상자를 닫습니다.

4. P.와 기아 패드를 접종 chrysogenum 및 배양

1. 1/50 포자 (문화 쌀 재배 된 경우) 희석 또는 기아 패드의 중심에 (문화 agar 접시에 성장 된 경우) 균사체 단편을 포함하는 원액의 5 μL의 피펫 5 μL.
2. 이 역할 (습식 챔버를 닫고 비닐 봉지에 포장기아 패드의 탈수에 대한 추가 보호). 너무 많은 그렇지 않으면 접종 방울을 방해하기 때문에 상자를 이동하지 않도록주의하십시오.
3. 샘플을 분석하기 전에 적어도 20 시간 동안 실온에서 포장 상자를 보관하십시오.

샘플 5. 현미경 분석

1. 배양 20 시간 후 샘플을 현미경 분석을위한 준비; 드라이 티슈에 현미경 슬라이드를 넣어 (바닥에 물기가 경향).
2. 기아 패드 위에 물을 소량 (약 50 μL)를 피펫. 패드에 커버 슬립을 넣고 여분의 물을 짜 낸다. 티슈로 여분의 물을 제거합니다.
3. 형광 현미경의 관찰 테이블에 현미경 슬라이드를 넣습니다. 균사체 성장의 개요를 얻으려면, 20 배 목표를 사용합니다. 균사에서 GFP의 지역화 연구를위한 사용 63X 또는 100X 목표. 샘플에 대한 분석을하지 않는 샘플의 점진적인 탈수를 방지하기 위해,15 분 이상 습식 챔버에 다시 놓기 전에.
4. (40 시간과 성장의 60 시간 후, 예를 들면) 일정한 간격으로 5.3를 반복합니다.
   참고 : 샘플은 습식 챔버에 다시 넣을 수 있습니다. 그것은 균사체 생장에 영향을주지 않는 커버 슬립을 제거 할 필요가 없다.

결과

P.에 퍼 옥시 저하 위에 설명 된 프로토콜의 유틸리티를 설명하기 위해 chrysogenum 변형 Ws54-1255 (GFP-SKL)을 분석 하였다. 이 변형에서 GFP-SKL은 일반적으로 퍼 옥시 솜 ^(9)로 가져옵니다. 시료를 형광 현미경을 통해 분석 될 때 여러 구형의 모양을 초래한다. 자식 작용이 발생하는 경우, 액포는 확대. GFP-SKL은 자식 작용 (pexophagy)에 의해 공포에 통합된다. 인해 GFP는 액포 프로테아제 ?...

토론

여기에 제시된 방법은 P.에서 자식 작용의 편리하고 재현성 연구를 할 수 있습니다 chrysogenum. 예를 들면, 곰팡이는이 아닌지의 자식 작용 반응을 조절할 수있는 여부를 다양한 화합물의 효능의 스크리닝에 사용될 수있다. 라파 마이신과 결과는 TOR 신호 전달의 억제는 P.에서 자식 작용의 뚜렷한 유도에 이르게 입증 chrysogenum 다른 생물 ^(11)에 대한 입증 된.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope slides with central cavity	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	H884.1	These can be used multiple times after cleaning.
Glass beads	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	A553.1	Diameter: 0.25 - 0.50 mm