CXCR6.Gfp 기자 마우스를 사용하여 건강하고 병에 걸린 간에서 면역 세포의 장기 생체 내에 다중 광자 현미경 이미징

요약

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

초록

부상에 대한 응답으로서 간염은 단핵구, 호중구, T 세포의 서브 세트, B 세포, 자연 살해 (NK) 및 NKT 세포의 구별을 포함한 백혈구 아형의 침입을 수반하는 매우 동적 인 과정이다. 면역 세포의 이동을 모니터링하기위한 생체 내에 간 현미경 인해 시료 전처리 및 고정, 광학 해상도 및 장기 생존 동물에 대한 높은 요구에 특히 도전적이다. 그러나, 염증 과정뿐만 아니라, 셀룰러 상호 작용 연구 역학 잘 염증성 간 질환의 개시, 진행 및 회귀 이해에 중요한 정보를 제공 할 수있다. 따라서, 매우 민감하고 신뢰할 수있는 방법은 집중 치료와 함께 마이그레이션 및 생체 내에 두 광자 레이저 스캐닝 현미경 (TPLSM)에 의해 오랜 기간 (약 6 시간)을 마우스 간에서 다른 면역 세포의 세포 - 세포 상호 작용을 연구하기 위해 설립되었습니다 모니터링. 이비인후과 "> 제공 방법은 부드러운 준비 및 기관의 최소 섭동과 간의 안정적인 고정을 포함하며, 장기간 생체 내에 촬상 추적을 허용하는, 최대 6 시간의 기간 동안 사실상 광표백 또는 광독성 효과 다색 다 광자 현미경을 사용하여 마우스 중요한 매개 변수와 순환, 온도, 가스 교환의 안정화의 광범위한 모니터링에 의한 안정적인 영상 조건, 특정 백혈구 하위 집합.

CXCR6.gfp 간염시 림프구 마이그레이션을 조사하기 위해 넉 - 생쥐 기준선 조건 하에서 사염화탄소 복강 내 주사 발 CCL _(4)에 의해 유도되는 급성 및 만성 간 손상 후 생체 내에 간 촬상을 실시한다.

천연 킬러 (NK) - - 또한 그러한 CD4 T 세포로서 T 림프구 서브 세트했지만 점막 associ CXCR6 주로 자연 살해 T (NKT)에 림프구상에서 발현 케모카인 수용체이며ated의 불변 (MAIT) T 세포 ^하나. 간 손상에 따라 자신의 변화된 행동에 대한 상세한 통찰력과 질병의 진행에 따라서 잠재적 인 참여를 허용 CXCR6.gfp ⁺ 면역 세포의 이주 패턴과 위치에 따라.

서문

세포 및 전체 기관의 세포 기능 또는 전체 유기체의 시각화는 본체 ^(2)의 거의 모든 부분을 포함, 50 년 이상 큰 관심이었다. 따라서 일부 초기 연구는 이미 간 ^3,4의 생체 내에 이미지를 고용했다. 그러나, 다음과 같은 몇 가지 제한 사항이 간 조직의 장기 안정적인 고해상도 영상에 관한 최신 상태로 존재한다.

다이어프램 인해 위장관 ⁵ 밀착 간 해부학 위치로, 미세한 생체 내에 이미징을위한 가장 일반적인 문제는 장관 ^(6)의 낮은 정도, 연동 운동 호흡 때문이며. 고형 장기에 비해, 간 수술 특히 도전적이다. 때문에 조밀 한 미세 혈관 구조에, 수술 조작, 대규모 출혈성 병변 거주자의 장애 미세 ^7도 활성화를 이끌 수 있습니까이러한 쿠퍼 세포 ^(8)과 같은 mmune 세포. 따라서, 조직의 기계적인 고정화 ^-6,9-가 생체 내에 현미경 이미징에 간섭 가능성이 다른 공표.

건강한 간에서, 총 혈액량 10~15 %가 간 혈관 내에 존재하고, 기관은 순환의 변화 (예를 들면, 혈압 변동에 매우 민감 장기 렌더링 전체 심 박출량 ^(10)의 약 25 %를 ). 따라서, 과도한 조직 처리 또는 중앙 집중식 순환에 의해 예를 들면, 전단 응력, 변위, 부상으로 간 혈액 흐름의 중단뿐만 아니라 간 면역 반응에 영향을 미치는, 백혈구 철새 행동의 인공 변경, 손상된 간 산소 때문에 더 간 손상으로 이어질 것 장기 보존과 동물의 전체 수명 등.

초기 현미경 연구는 생체 내에 표면 형광 마일 기반으로했다croscopy 있으나, 이러한 포토 블리치 낮은 침투 깊이와 같은 여러 기술적 인 제약은 장기 간 촬상 ^4,11,12 본 기술의 사용을 제한한다. 이 새로운 방법은 실생활 ^13-15에서 거의 모든 장기에 영상 연구를 수행 할 기술적으로 가능했다으로 1990 년대에 다 광자 현미경의 발달과 함께, 사진 표백 또는 침투 깊이의 한계는 주로 해결되었다. 그러나, 간 영상에 대하여 주 남은 과제였다 : 몇 시간 이상 ¹⁶ 시간 동안 사인 곡선의 불변 간 혈류, 특히 안정된 촬상 확보 호흡 운동, 간 조직의자가 형광이.

여러 연구는 간에서 ¹⁷ 예, NKT 세포 ^{18-20, 21, 22} T 세포, 대 식세포 간 ^23,24 또는 ²⁵ 호중구, 장기 광자 m 함수를 다양한 백혈구의 이동을 해결되지만icroscopy 영상은 아직 성공적으로 인해 추가 손상 ^(26)에 대한 기존의 손상 때문에 더 높은 감수성에 작업이 훨씬 더 도전 급성 또는 만성 간 질환 동물에서 설립되지 않았다. 그러나, 실시간으로 간에서 백혈구의 철새 행동과 세포 기능을 모니터링 간 항상성과 질병 ^{(27)에서의} 특정 역할에 새로운 통찰력을 할 수 있습니다.

케모카인 수용체 CXCR6 자연 킬러 (NK) 세포, NKT 세포 및 일부 T 세포를 포함한 여러 ^18,28 개체군 림프구 서브 세트 상에 발현된다. 마우스에서의 연구는 이전 CXCR6와 동족 리간드 CXCL16 항상성 동안 간 정​​현파에 NKT 세포의 순찰을 제어 할 수 있음을 나타내었다. 결과적으로, (CXCR6 궤적에 녹색 형광 단백질 [GFP]의 노크에 들고) CXCR6.gfp 마우스의 사용은 뇌 ²⁹ 등의 각종 장기에 림프구의 이동을 조사 설명 하였지만또한 간 ^{(18, 20)는,} 염증에 CXCR6.gfp 세포의 침윤을 증가 게재.

본 연구에서 제공된 방법에 안정화 된 조건 하에서 장기간에 걸쳐 이러한 프로세스를 수행 할 수 있었다. 생체 내에 광자 기반의 절차는 동물과 기관의 최소한의 교란과 높은 재현성했다 이미징을 허용; 호흡과 순환의 가까운 제어 다음에 광범위한 모니터링하여 장기 동물의 생존을 위해 최적화; 매우 유연하고 쉽게는 신장이나 비장 등의 실질 장기로도 채택한다.

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프로토콜

참고 : 실험 (NIH 간행물, 8 판, 2011) '관리 및 사용 실험 동물의를위한 안내서'다음 동물 연구에 적용되는 독일 법규에 따라 수행하고, 동물의 보호에 관한 지침 63분의 2,010 / EU 과학적인 목적 (유럽 연합의 공식 저널, 2010)에 사용됩니다. 공식 권한은 정부의 동물 관리 및 사용 사무실 (LANUV 노르 트라 인베스트 팔렌, 레 클링 하우젠, 독일)에서 수여되었다.

주 : 단기 촬상 생략 할 수있는 단계는 제조 시간을 단축하고 수술 프로토콜을 간단하게 별표 (*)로 표시된다 (예를 들면도 촬영, 3-D 스택 또는 짧은 기간 경과 현미경 스냅). 그러나 필요한 생존 시간이 현저히 감소 될 경우 이미징 또한 광범위한 모니터링 및 제어를 순환시키지 않고 수행 될 수있다.

1. 현미경의 설치 및 사전 수술 준비 (5 ~ 10 마일N)

1. (현미경, 전력 연구소, 레이저, 전기 패드, 기후 챔버, 웹 캠, 주사기 펌프 장치, 인공 호흡기)에 스위치 시스템.
2. 1.5 부피 %에 O ₂ 아이소 플루 란 증기를 공급하고 설정 아이소 플루 란 수준을 연결합니다 (V는 / V), 작은 동물 인공 호흡기에 연결합니다.
   1. 단기 이미징, 초기 IP 마취 유도 후 이소 플루 란을 이용하여 마취를 유지한다 (단계 2.2 참조). 이어서 안정 간 미세 순환을 보장하는 2 부피 % (v / v)의 아이소 플루 란을 사용하고, 2 시간 미만 촬상 시간을 유지한다.
3. 150 ~ 200 μL의 볼륨 120-140 호흡 사이클 / 분에 호흡을 설정합니다.
4. 마우스 아가로 오스 단계를 설정합니다. 40 °의 각도에서 접시 (약 10cm X 15cm베이스)로 쏟아져, 3 % (w / v) 아가로 오스 100 ㎖를 준비한다.
5. 필요한 장비를 수집하는 수술 작업 영역을 설정합니다. 미생물 감염을 방지하기 위해, Sekusept 포르테 S의 1 % 용액 (사용 악기를 9.9 % / V w 소독), Glutaral V / w 9.8 %, 실험 (그림 1A 전에 5 분 동안 포름 알데히드).
6. 나머지 구성 요소를 얻 피부 소독제 (예를 들면, 10 %, 포비돈 요오드 용액), 간 스테이지 (스택 및 다리), 아가로 오스 용액 (3 % (w / v)의 PBS)에서 5 %, 주사기 펌프 (W / V) 포도당 용액을 마취 용액 I (케타민 0.1 ㎎ / ㎖, 크 실라 0.5 ㎎ / ㎖, 펜타닐 5 ㎍ / ㎖), 면봉, N- 부틸 -2- Cyanoacrylat, 1X PBS와 함께 (G-5), 시린지 펌프. 예열 배양 챔버에 아가로 오스 단계 접시를 넣어.

2. 기관 절개술 (10 ~ 15 분)

1. 25-28g 무게 하우스 사육에서 C57BL / 6 마​​우스를 사용합니다. 하우스 12 시간 조명 / 12 시간 어두운주기와 온도 -에서 FELASA의 지침에 따라, 습도 제어 환경에서 무균 조건 하에서 마우스. 동물에게 표준 마우스 다이어트 (냄새를 맡아 표준 설치류 다이어트)와 물을 자유 섭취에 무료로 액세스 할 수 있습니다.
2. 초기화하여 마우스를 마취원점이라 복강 내 마취 솔루션 II 250 μL (케타민 0.1 ㎎ / ㎖, 크 실라 1 ㎎ / ㎖, 부 프레 놀핀 10 ㎍ / ml)에의 (IP) 주입.
   1. * 생체 내에 촬상 동안 유지비를 들어, 연속적으로 연속 IP 주입하여 마취 용액 I를 관리 (케타민 0.1 ㎎ / ㎖, 크 실라 0.5 ㎎ / ㎖, 펜타닐 5 ㎍ / mL)을 0.2 ㎖ / hr의 유량으로 주사기 펌프 장치를 이용 inhalative 이소 플루 란 0.5 부피 % 조합 (v / v)로.
   2. , 기관 절개술을 위해 피부를 소독, 5 분 (집게로 예를 들어 핀치 발 패드) 후 반사를 확인 마우스가 수술 허용 마취 상태에있는 경우 준비를 시작합니다.
   3. (그림 1B)를 건조로부터 각막을 방지하기 위해 눈 보호 크림 (예를 들어, Dexpanthenol 50 ㎎ / g)을 적용합니다.
3. 사지에 대한 접착 테이프를 사용하여 복부 측면을 노출 준비 테이블에 마우스를 흥분시키는; 부드럽게,이 위치에 고정하세요 예. 목을 잡아 늘, 고무 밴드를 사용하여 t을 푹앞니 오.
   1. 면봉으로 소독을 적용하여, 포비돈 요오드 용액을 이용하여 피부와 모피를 소독.
4. 직접 턱 아래에 초기 피부 인하 (0.5 cm 길이)을 수행 (그림 1C)
   1. 조심스럽게 침샘 (그림 1D) 사이의 결합 조직을 해부하다.
   2. 조심스럽게 개방 근육 튜브 주위 기관 (그림 1E, F)를 눈물.
5. 나중에 환기 튜브 고정 (그림 1G)에 대한 기관 아래 수술 스레드를 놓습니다.
   1. T 자형 절개를 수행 연골 고리 사이에 마이크로 가위로 열기 기관 (그림 1H)
6. 절개 (~ 0.5 cm)를 통해 기관에 환기 튜브를 놓습니다. 앞으로 튜브를 밀어 작은 해부 집게로 꼬리 끝을 잡고 부드럽게 기관지에 튜브를 사전에 (그림 1I)
7. 수술 스레드와 튜브를 흥분시키는 (예 : , 5-0) 단계 2.5 기관 내부 튜브 주위에 매듭을 묶는에 배치; 실수로 depositioning (그림 1J, K)을 방지하기 위해 피부에 튜브의 두 번째 두개골 고정을 수행합니다.
8. 조직 접착제 (예를 들면, n- 부틸 -2- Cyanoacrylat) (그림 1L)와 인감 잘라.
9. 접착 테이프를 사용하여 머리에 튜브를 흥분시키는.

3. Laparatomy (15 ~ 20 분)

1. 저체온증을 방지하기 위해 가열 패드에 마우스를 놓습니다. 복부를 면도 조심스럽게 피부에서 머리를 제거합니다. 포비돈 요오드 용액을 사용하여 면도 모피 소독.
2. 수술 가위 (그림 2A)를 사용하여 흉골 아래로 잘라 작은 피부를 수행합니다. 출혈을 방지하기 위해 모든 눈에 보이는 혈관을 소작, 측면 양쪽에 갈비뼈 아래 컷을 확장합니다.
3. 조심스럽게 복막 (그림 2B)를 열고, 흉골 아래의 원격 교육 알바에 작은 상처를 수행합니다. cauteriz를 사용하여 양쪽에 상처를 확장ATION (그림 2C, D)를 출혈 방지합니다.
4. 아가로 오스 단계 접시 (그림 2E)에 마우스를 놓습니다. 마우스 (일반적으로 12 ~ 14 커버 슬립) (그림 2 층)의 양쪽에 적절한 높이의 스택을 놓습니다.
5. 호흡과 현미경을 동기화하는 등 위쪽 아래 호흡 트리거 센서를 놓습니다. 트리거 장치 (그림 2G)를 활성화합니다.
6. 리브 (그림 2I)을 철회 흉골을 통해 수술 스레드 (5-0) 놓습니다.
7. 조심스럽게 곡선 수술 가위를 사용하여 간, 다이어프램 (낫 모양의 인대)를 연결하는 인대뿐만 아니라 간, 위장관를 잘라. 대동맥 (그림 2J)까지 낫 모양의 인대를 잘라.

4. 샘플 설정 (10 ~ 15 분)

1. 큰 간 엽에 쉽게 액세스 할 수 있도록 45 °의 각도로 오른쪽 마우스를 놓습니다.
2. 복부를 덮고, 갈비뼈 아래 준비 브리지 추가공동. 예리한 에지 (도 2K)을 덮도록 접착 테이프 코팅 표준 커버 슬립을 사용하여 다리 제조.
3. 무대에서 큰 간 로브를 놓습니다. 조심스럽게 이중 볼 스타일러스 프로브 또는 간 아래 패딩 주걱을 미끄러 젖은 면봉이나 물티슈를 사용하여 기관의 상단을 누르고 있습니다. 슬라이드에 로브를 들어 올리고 부드러운 드래그을 적용합니다. 로브가 휘거나 접을 수 있습니다. 간 (그림 2L) 만 부드러운 조작에 각별한주의를 제공합니다.
4. 예를 들어, 작은 커버 슬립 (20mm X 20mm), 옆에있는 간 엽의 거의 동일한 높이의 더미 커버 슬립을 지원하기 위해 측면 지원 지분을 놓습니다.
5. 간 엽에 큰 커버 슬립 (24mm × 50 mm)를 놓습니다. 그 커버 슬립을 확인하는 것은 가능합니다 (그림 2M)으로 수평으로 배향된다.
   주 : 커버 슬립을 압박하지 않고 조직과 접촉해야한다. 장애인 혈액의 흐름 (흰색 조직)의 흔적이 없는지 확인합니다. microcirc 경우위험률이 중단되고, 추가로 지분을 지원하고 추가 할 수 있습니다.
6. * 장기 마취 및 G-5 응용 프로그램에 대 한 장소 두 개의 독립적 인 복강 내 카테터 (그림 2N). 다음 뒷다리로 하복부에 횡 방향으로 카테터를 설치합니다.
   참고 : 복강 내 카테터는 자체 제작 유연한 실리콘 튜브 (그림 3)과 27 G 바늘을 연결하여 할 수 있습니다.
7. * 피부에 5-0 수술 스레드의 루프를 흥분시키는 바늘 실수 변위를 방지 할 수 있습니다.
8. * I 1 카테터 마취 용액과 주사기 펌프를 장착, 0.2 ㎖ / 시간으로 설정 유량; 0.1 ㎖ / 시간에 카테터 2 G-5 주사기 펌프, 설정 유량을 연결합니다.

5. 마우스 모니터링

1. * 장소 ECG 전면에 전극과 뒷다리 사지 (그림 4A).
2. * ₂ 레벨 센서를 공동 만료 튜브를 연결합니다.
3. (그림 4C 열 패드에 연결된 외부 온도 센서를 추가).

6. 임베딩 및 조직 고정 (5 ~ 10 분)

1. 3 % 1X PBS에서 (w / v) 아가로 오스 100 ㎖를 준비합니다. 온도가 5 ML의 주사기와 18 G 바늘 (그림 5A)를 사용하여 41 ° C 일 때 간을 포함합니다.
2. 커버 슬립에 마우스 (그림 5B, C)의 주위에 남아있는 아가로 오스를 붓고. 아가로 오스가 완전히 호화 때까지 기다립니다.
3. 준비 간 엽 (그림 5D, E)를 스캔하기에 충분한 viewfield 큰 준비, 하이 데르 주걱을 사용하여 초과 아가로 오스를 제거합니다.

7. 영상

1. 현미경 기후 챔버에 마우스를 전송합니다.
2. 1X PBS의 50 ~ 100 ML을 추가 (37 ° C에 예열).
3. 증발 (그림 5 층)을 방지하기 위해 샘플 접시를 커버.
4. * 0.5 권 %로 inhalative 이소 플루 란을 감소 (v / v)로.
5. *, ECG 모니터링 소프트웨어, 심박수 및 호기 CO _{2 녹화를} 시작.
6. 영상을 시작합니다 라 열산이 셔터는 관심보기 필드를 식별 Z-스택에 대한 상부 및 하부 경계를 정의하고, 시간 경과 녹화를 시작합니다. Z-드리프트를 해결하기 위해 필요한 경우 (Z-스택을 다시 조정 예. 때문에 혈액의 압력 또는 온도 변화, 그림 (5 세대)의 변화.
   주 : 동물의 순환 또는 마취 영상주기의 경우 또는 완성이 불안정하게되면 (마취로부터 각성)없이 경추 탈구하여 쥐를 희생.

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결과

우리의 생체 내에 TPLSM 접근 방식의 유효성을 확인하기 위해, 우리는 생체 내에 TPLSM 이미징에 CXCR6의 ^{GFP / +} 마우스를 실시. 마우스를 어느 기준선 대조군으로 방치 또는 급성 간 손상 유도 ²⁰ 사염화탄소 단일 복강 내 주사 _{(사염화탄소)을} 실시 하였다.

녹색 형광 인해 비디오 시퀀스는 2-5 시간의 기간 동안 수행 한 후, 세포는 시간이 지남에 따라 추적 ?...

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토론

본 연구의 목적은 간 생체 내에 TPLSM 이미징 높은 표준화 안정적이고 재현성있는 방법을 개발하는 것이었다. 일반적으로 생체 내에 이미징은 원점 복귀 및 개발, 항상성과 질병에 다른 백혈구 인구의 상호 작용 다음과 같은 실제 생활 조건에서 세포의 행동에 대한 가치있는 통찰력을 부여하고있다. 그러나, 직접적으로 고형 장기에 비해 간뿐만 아니라 높은 취약성으로 인해 전송되는 호흡기 및 장...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetics
Buprenorphine	Essex Pharma	997.00.00	Analgeticum, 0.1 mg/kg
Fentanyl	Rotex Medica	charge: 30819
Fluovac anesthesia system	Harvard Apparatus	34-1030
Glucose 5%	Braun
ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser	Eickemeyer	4802885
Isoflurane	Forene Abbott	B 506
Isotonic (0.9%) NaCl solution	DeltaSelect GmbH	PZN 00765145
Ketamin 10%	ceva	Charge: 36217/09
Xylazin 2%	medistar	Charge: 04-03-9338/23
Consumable supplies
20 ml Syringe	BD Plastipak
250 ml Erlenmeyer flask	Schott Duran	21 226 36
25 ml Beaker 2x	Schott Duran	50-1150
2 ml syringe	BD Plastipak
4-0 Vicryl suture	Ethicon	V7980
Agarose	commercially available
Bepanthen Eye and Nose ointment	Bayer Vital GmbH	6029009.00.00
Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit	Fine Science Tools Inc.	18010-00
Cotton Gauze swabs	Fuhrmann GmbH	32014
Cover Slip 24x50 mm	ROTH	1871
Durapore silk tape	3M	1538-1
Feather disposable scalpel	Feather	02.001.30.011
Fine Bore Polythene Tubing 0.58 mm ID	Smiths medical	800/100/200
Histoacryl	Braun	1050052	5x 0.5 ml
Leukoplast	BSN Medical Inc.
Microscope Slides	ROTH	1879
Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum	Antiseptica GmbH	72PAH200
Sterican needle 18 G x 1	B. Braun	304622
Sterican needle 27 3/4 G x 1	B. Braun	4657705
Tissue paper	commercially available
Surgical Instruments
Amalgam burnisher 3PL	Gatz	0110?
Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2	Storz&Klein	S-01134
Dumont No.7 forceps	Fine Science Tools Inc.	91197-00
Graefe forceps curved x1	Fine Science Tools Inc.	11151-10
Graefe forceps straight x2	Fine Science Tools Inc.	11050-10
Heidemann spatula HD2	Stoma	2030.00
Needle holder Mathieu	Fine Science Tools Inc.	12010-14
Scissor	Fine Science Tools Inc.	14074-11
Semken forceps	Fine Science Tools Inc.	11008-13
Small surgical scissors curved	Fine Science Tools Inc.	14029-10
Small surgical scissors straight	Fine Science Tools Inc.	14028-10
Standard pattern forceps	Fine Science Tools Inc.	11000-12
Vannas spring scissors	Fine Science Tools Inc.	15000-08
Equipment
ECG Trigger Unit	Rapid Biomedical	3000003686
MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer	AD Instruments
Minivent Typ 845	Harvard Apparatus	73-0043
Multiphoton microscope Trimscope I	LaVision
Perfusor Compact	B. Braun
PowerLab 8/30 8 channel recorder	AD Instruments	PL3508
Temperature controlled heating pad	Sygonix	26857617
Temperature sensor	comercially available
Temperature controlled System for Microscopes -Cube&Box	Life Imaging Services