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Method Article
세포막 창 고 미립자 (의원) 절연 및 병태 생리 학적 효과는 다양한 모델에서 조사 할 수있는 활성 생물학적 소포입니다. 여기에서 우리는 T 림프구 (LMPs)에서 파생 된 의원을 생성하고기도 상피 세포에 자신의 아폽토시스 효과를 입증하는 방법을 설명합니다.
세포 간 통신 세포막 유래 소체의 생물학적 역할에 대한 관심이 최근 증가하고있다. 미세 입자 (의원) 1 ㎛, 0.1 ㎛의 범위에서 직경이, 소체의 하나의 이러한 유형이며, 통상적으로 활성화 또는 사멸을 겪는 진핵 세포의 세포막에서 나타냈다. 여기에서 우리는 D. LMPs는 다단계 차동 원심 분리 과정을 통해 고립되고 유동 세포 계측법하여 특성화 티노 마이신 자극 세포 사멸 CEM T 세포에서 T 림프구에서 유래 미세 입자 (LMPs)의 생성을 설명합니다. 이 프로토콜은 또한 마우스 호흡기 차 기관지 조직 이식편 유래의 기관지 상피 세포에서의 아폽토시스 LMPs 효과를 입증하기위한 인 시츄 세포 사멸 검출 방법을 제안한다. 여기에 설명 된 방법은 체외에서 세포 사멸 림프구에서 LMPs의 풍부한 수량을 분리하기위한 재현 과정을 제공합니다. LMPs 유도이와 같이 각종 질병 모델의 특성을 평가하는 데 사용되며, 약리학 및 독성학 테스트 할 수있다. 기도 상피는 외부 환경과 하부 조직 사이의 보호 물리적 및 기능적 장벽을 제공 감안할 기관지 조직 이식편보다는 불멸화 상피 세포주를 사용기도 관 조직을 요구 수사 효과적인 모델을 제공한다.
Microparticles (MPs) are biologically active submicron membrane vesicles released following cell activation or apoptosis. MPs are derived from both healthy and damaged cells and are implicated in many physiological and pathological processes.1 MPs have been detected not only in human plasma, but also in inflammatory and apoptotic tissue. The biological utility of cell membrane–derived MPs has been demonstrated in various settings, including cell signalling models and as pharmacological tools.2,3 We previously demonstrated that LMPs derived from T lymphocytes following actinomycin D stimulation (to induce apoptosis) suppress angiogenesis and inhibit endothelial cell survival and proliferation.4,5 The antiangiogenic effects of LMPs may vary significantly depending on the stimuli used to activate T lymphocytes in vitro.6
The airway epithelium functions as a protective physical and functional barrier. Increased numbers of T lymphocytes in the airway can contribute to cell damage and airway inflammation.7 We have shown that LMPs induce apoptosis of human bronchial epithelial cells,8 which indicated LMPs may change barrier function of bronchial epithelium in vivo. Apoptotic cells can be identified using the TUNEL method, which detects in situ DNA fragmentation.
The overall goal of this protocol is to illustrate the in vitro production of LMPs from a T lymphocyte cell line, and to demonstrate their proapoptotic effect on airway epithelial cells. In situ cell death detection demonstrated that LMPs strongly induce airway bronchial epithelial cell death, suggesting that LMPs-mediated injury to the airway epithelium may impact barrier function of the damaged epithelium.
참고 : 남성 C57BL / 6 마우스 (5-7주 이전)의 찰스 리버 연구소 인터내셔널 (. 세인트 - 상수, 퀘벡, 캐나다)에서하고 CHU 셍트 - 저스틴 동물 관리위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 조작 할 수 있습니다. 마우스 기관지 조직 절편은 상피 세포에 LMPs의 아폽토시스 효과를 조사하는 차 기관지 상피 세포의 좋은 소스를 제공합니다. 이 프로토콜은 LMPs의 시험 관내 생성뿐만 아니라 LMPs 처리 기관지 조직 이식편에 대한 상피 세포 자멸사를 검출하기위한 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 세 부분으로 구성되어 있습니다.
1. LMPs 생산 및 특성
참고 : 오염을 방지이 실험에 사용 된 모든 재료는 멸균 또는 멸균되어 있는지 확인하십시오. 달리 언급하지 않는 한, 무균 조건에서 생물 안전 캐비닛에 실온에서 모든 단계를 수행합니다.
1.1) 자극과 의원의 컬렉션9
FACS 분석 (4)를 통해 의원 1.2) 특성
MP P 1.3) 결정rotein 농도 (브래드 포드 분석)
2. 기관지 조직 외식 및 LMPs 치료
참고 : 멸균 작업 환경에 특별한주의를 지불하고, 무균 실험을 다음에 사용되는 솔루션과 매체를 준비합니다. , 완전한 치유 미디어를 준비 100ml의 조직 치유 중간 (얼음 해동) 혈청과 조직 치유 중간 보충 교재의 1를 가하여 잘 혼합합니다.
기관지 조직 외식 2.1) 준비
2.2) LMPs 치료
3. 조직 병리학 적 검사
3.1) 다음 단계로 진행하기 전에 다음 솔루션을 준비
3.3) 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E) 염색
3.4) 현장 세포 죽음 검출 : TUNEL 분석 실험
LMPs 형광 활성화 셀 (FACS) 분석을 정렬 및 의원 (≤1 μm의)의 97 %가 넥신-V-Cy5에 긍정적 된 1 μm의 구슬 사용 정문에 의해 넥신 V 염색 (10) 특성화되었다 (그림 1A 및 1B). 일반적 LMPs 약 2.5 mg을이 프로토콜 다음 얻었다. C57BL 기관지 조직 이식편은 / 6 마우스는 비히클 및 LMPs 처리를 실시 하였다. 기관지 섹션의 조직 병리학 적 분석은 기관지 상피 세포의 구조적 무결성에 LMPs의 효...
의원 간 크로스 토크의 활성 매개체 및 그들의 연구는 과학의 많은 분야에서 유망된다. (11)이 연구는 사멸의 T 세포주의 시험 관내 LMPs 대규모 생성을위한 상세한 프로토콜을 제시 하였다. 이러한 의원 림프구 분자의 큰 레퍼토리를 발현과 생물학적 세포 및 조직의 항상성 조절에 연루되어있다. 그러나, 서로 다른 소스에서 파생 된 LMPs 생물학적 다를 수 있습니다. 4,9,12,13
저자가 공개하는 게 없다.
비전 건강 연구 네트워크 -이 작품은 건강 연구 (178918), 퐁 드 공들인 엉 상테 퀘벡의 캐나다 연구소에서 보조금에 의해 지원됩니다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
LMPs production and characterization | |||
CEM T cells | ATCC | CCL-119 | |
X-VIVO 15 medium | Cambrex, Walkersville | 04-744Q | |
Flask T75 | Sarstedt | 83.1813.502 | |
Flask T175 | Sarstedt | 83.1812.502 | |
Actinomycin D | Sigma Chemical Co. | A9415-2mg | |
PBS | Lifetechnologies | 14190-144 | |
0.22 µm filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
Annexin-VCy5 | BD Pharmagen | 559933 | |
FACS flow solution | BD Bio-sciences | 342003 | |
Fluorescent microbeads (1 µm) | Molecular Probes | T8880 | |
Polysterene counting beads (7 µm) | Bangs laboratories | PS06N/6994 | |
Polypropylene FACS tubes | Falcon | 352058 | |
1 ml pipet | Fisher | 13-678-11B | |
5 ml pipet | Falcon | 357543 | |
25 ml pipet | Ultident | DL-357551 | |
1.5 ml conical polypropylene micro tube | Sarstedt | 72.690 | |
15 ml conical polypropylene tube | Sarstedt | 62.554.205 | |
50 ml conical polypropylene tube | Sarstedt | 62.547.205 | |
50 ml high speed polypropylene copolymer tube | Nalgene | 3119-0050 | |
250 ml high speed polypropylene bottle | Beckman | 356011 | |
Protein assay (Bradford assay) | Bio-Rad Laboratories | 500-0006 | |
Protein assay standard II | Bio-Rad Laboratories | 500-0007 | |
Test tube 16 x 100 | VWR | 47729-576 | |
Test tube 12 x 75 | Ultident | 170-14100005B | |
Cell incubator | Mandel | Heracell 150 | |
Low speed centrifuge | IEC | Centra8R | |
High speed centrifuge | Beckman | Avanti J8 | |
High speed rotor for 250ml bottle | Beckman | JLA16.250 | |
High speed rotor for 50ml tube | Beckman | JA30.50 | |
Fow cytometry | BD Bio-sciences | FACS Calibur | |
Spectrophotometer | Beckman | Series 600 | |
Bronchial tissue explants and sections | |||
C57BL/6 mice (5-7 weeks old) | Charles River Laboratories, Inc. | ||
Mouse Airway PrimaCell™ System: | CHI Scientific, Inc. | 2-82001 | |
Rib-Back Carbon Steel Scalpel Blades | Becton Dickinson AcuteCare | 371310 | #10 |
Scalpel Handle | Fine Science Tools Inc. | 10003-12 | #7 |
phase-contrast inverted microscope | Olympus Optical CO., LTD. | CK2 | |
high O2 gas mixture | VitalAire Canada Inc. | ||
modular incubator chamber | Billups-Rothenberg Inc. | MIC-101 | |
MaxQ 4000 incubated orbital shaker | Barnstead Lab-Line, | SHKA4000-7 | |
12-well tissue culture plate | Becton Dickinson and Company | 353043 | |
Plastic tissue culture dishes (100 mm) | Sarstedt, Inc. | 83.1802 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools Inc. | 14060-09 | Straight, sharp, 9cm longth |
Half-curved Graefe forceps | Fine Science Tools Inc. | 11052-10 | |
humidified CO2 incubator | Mandel Scientific Company Inc. | SVH-51023421 | |
Histopathological examination | |||
formalin formaldehyde | Sigma-Aldrich, Inc. | HT5011 | |
paraffin | Fisher scientific International, Inc. | T555 | |
ethyl alcohol | Merck KGaA, Darmstadt | EX0278-1 | |
glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Inc. | G6403 | |
Cacodylate | Sigma-Aldrich, Inc. | 31533 | |
microscope slides | VWR Scientific Inc. | 48300-025 | 25x75 mm |
Xylene | Fisher scientific International, Inc. | X5-4 | |
Mayer's hematoxylin | Sigma-Aldrich, Inc. | MHS16 | Funnel with filter paper |
HCl | Fisher scientific International, Inc. | A144s-500 | |
eosin | Sigma-Aldrich, Inc. | HT110116 | Funnel with filter paper |
Permount™ Mounting Medium | Thermo Fisher Scientific Inc. | SP15-100 | |
glass coverslip | surgipath medical industries, Inc. | 84503 | 24×24 #1 |
TUNEL detection kit | In Situ Cell Death Detection, POD | 11 684 817 910 | |
oven | Despatch Industries Inc. | LEB-1-20 | |
rotary Microtome | Leica Microsystems Inc. | RM2145 | |
filter paper | Whatman International Ltd. | 1003150 | #3 |
Microscope | Nikon Imaging Japan Inc. | E800 | |
staining dish complete | Wheaton Industries, Inc. | 900200 | including dish, rack, cover |
1.5 ml eppendorf tube | Sarstedt Inc. | 72.69 | 39x10 mm |
Orbital and Reciprocating Water Bath | ExpotechUSA | ORS200 | |
phosphate buffered saline | GIBCO | 14190-144 | |
fume hood | Nicram RD Service | 3707E |
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