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요약

Here we present a protocol that allows one to visualize sites of ice formation and avenues of ice propagation in plants utilizing high resolution infrared thermography (HRIT).

초록

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events often have devastating effects on agricultural production and can also play an important role in shaping community structure in natural populations of plants, especially in alpine, sub-arctic, and arctic ecosystems. Therefore, a better understanding of the freezing process in plants can play an important role in the development of methods of frost protection and understanding mechanisms of freeze avoidance. Here, we describe a protocol to visualize the freezing process in plants using high-resolution infrared thermography (HRIT). The use of this technology allows one to determine the primary sites of ice formation in plants, how ice propagates, and the presence of ice barriers. Furthermore, it allows one to examine the role of extrinsic and intrinsic nucleators in determining the temperature at which plants freeze and evaluate the ability of various compounds to either affect the freezing process or increase freezing tolerance. The use of HRIT allows one to visualize the many adaptations that have evolved in plants, which directly or indirectly impact the freezing process and ultimately enables plants to survive frost events.

서문

식물이 활발하게 성장하는 때 발생하는 온도를 동결하는 것은 식물이 거의 또는 전혀 동결 내성이 경우 특히, 치명적이 될 수 있습니다. 이러한 서리 이벤트는 종종 농업 생산에 파괴적인 영향을 가지고 있으며, 특히 고산, 서브 북극과 북극 생태계 1-6, 식물의 자연 집단에서 사회 구조 형성에 중요한 역할을 할 수있다. 심한 봄 서리의 에피소드는 최근 7-9 년 미국과 남미에서 과일 생산에 큰 영향이 있고 전형적인 평균 저온 다음 따뜻한 날씨의 초기 발병에 의해 악화되고있다. 초기의 따뜻한 날씨는 더 서리 허용 1,3,10-12 매우 작은이 모두 새로운 싹, 잎, 꽃의 성장을 활성화, 휴식 싹을 유도한다. 이러한 불규칙적 인 기상 패턴 지속적인 기후 변화의 직접적인 반사 것으로보고되었으며 FORES위한 공통 날씨 패턴이 될 것으로 예상된다eeable 미래 (13). 증가 된 서리 내성을 제공 할 수있다, 경제적 효과 및 환경 친화적 인 경영 기법이나 농약을 제공하기위한 노력이 이유 호스트의 제한적인 성공이 있었다 그러나이 부분적 내성을 동결 식물 회피 메커니즘을 동결 복잡한 성질에 기인 할 수있다. (14)

식물에서 서리 생존과 관련된 적응 메커니즘은 전통적으로 내성을 동결 방지 동결, 두 가지 범주로 구분하고있다. 전 분류는 식물의 존재와 그 조직에서 얼음의 탈수 효과와 연관된 응력을 견딜 수 있도록하는 유전자의 특정 세트에 의해 조절 생화학 적 메커니즘과 연관된다. 후자는 통상적으로, 그러나 오직, 플랜트 (14)의 구조를 결정 식물의 측면 및 얼음 형성과 연관된 상태. 광고로 동결 방지의 보급에도 불구하고aptive 메커니즘 연구는 거의 기본 메커니즘 및 동결 방지의 규정을 이해하는데 최근에 전념하고있다. 독자는이 주제에 대한 더 자세한 사항은 최근의 리뷰 (15)로 지칭된다.

저온에서 얼음의 형성이 간단한 방법처럼 보일 수도 있지만, 많은 요인은 공장 내에서 확산 식물 조직에있는 얼음 핵이 방법에서 온도를 결정하는 것에 기여한다. 같은 핵형 성제 외적인 얼음의 존재하에, 이종 대 균질 핵 생성 이벤트, 열 이력 (부동액) 단백질, 특정 당 및 다른 osmolytes의 존재, 및 식물의 구조적 측면 호스트로 파라미터 수있는 것은 중요한 플레이 식물 동결 과정에서 역할. 종합적으로, 이러한 매개 변수는 얼음이 시작하고 성장하는 방법 어디 공장이 정지되는 온도에 영향을 미친다. 또한 생성 된 얼음 결정의 형태에 영향을 미칠 수있다.다양한 방법 LTSEM (핵 자기 공명 분광법 (NMR) (16), 자기 공명 영상 (MRI) (17), 크라이 현미경 18-19, 저온 주사 전자 현미경을 포함 실험실 조건 하에서 식물 동결 과정을 연구하기 위해 사용되어왔다 ). 실험실 및 필드 설정에서 전체 식물의 20 냉동 그러나, 주로 열전대로 모니터링하고있다. 동결을 연구하는 열전대의 사용은 물이 액체로부터 고체로 상 변화를 겪는다 열 해방 (융해열)에 기초한다. 동결 후, 발열 이벤트로서 기록된다. 21-23 열전대 식물 동결 공부 선택 전형적인 방법이더라도, 이들의 사용은 이벤트 동안 동결 얻어진 정보의 양을 제한하는 많은 한계가있다. 예를 들어, 열전대와 그것이 어떻게 전파 얼음, 식물에서 개시되는 위치를 결정하는 것은 거의 불가능에 어렵고,그것은 더 속도로 전파하는 경우, 일부 조직은 얼음의 무료 유지합니다.

고해상도 적외선 체열 (HRIT) 24-27의 발전은, 그러나, 상당히 차동 촬상 모드에서 사용될 때, 특히 식물 전체에 동결 과정에 대한 정보를 획득 할 수있는 능력을 증가했다. 28-33을 본 보고서에서는 냉동 과정의 다양한 양태 및 어디에 어떤 온도에서 얼음 식물에서 개시되는 다양한 매개 변수에 영향을 연구하기 위해이 기술의 사용을 설명한다. 프로토콜은 높은, 영하의 온도에서 초본 식물에 동결 개시 외부 핵제 역할을 얼음 핵 활동 (INA) 박테리아의 능력, 슈도모나스 시린 개 (Pseudomonas syringae) (CIT의-7)를 보여 것이다 표시됩니다.

고해상도 적외선 카메라

이 보고서에 설명 된 프로토콜과 예는 적외선 높은 해상도를 사용비디오 복사계. 복사계 (도 1)는 적외선과 가시 광선 이미지 및 온도 데이터의 조합을 제공한다. 카메라의 스펙트럼 응답은 7.5-13.5 μm의 범위 인 640 × 480 화소 해상도를 제공한다. 가시 스펙트럼에 의해 생성 된 이미지 카메라 내장 복잡한 열적 이미지의 해석을 용이하게 실시간에서 IR-이미지로 융합 될 수있다. 카메라 렌즈의 범위는 확대 현미경 관찰을 할 수 있습니다. 카메라는 독립 실행 형 모드로 사용, 또는 인터페이스와 propietary 소프트웨어를 사용하여 노트북을 제어 할 수 있습니다. 소프트웨어가 기록 된 비디오 데이터에 포함 된 열 다양한를 얻기 위해 사용될 수있다. 이는 적외선 복사계의 다양한 시판 것을 주목하는 것이 중요하다. 따라서, 연구자 제품 엔지니어링 지식을 그들의 의도 된 적용을 논의하고 있음을보고 특정 연구자가 임의의 능력을 시험하는 것이 중요C 복사계 필요한 정보를 제공한다. 설명 된 프로토콜에 사용 촬상 복사계는 아크릴 상자 나 스티로폼 N 온난화 및 냉각 프로토콜 동안 축합 노출을 방지하기 위해,로 절연 (도 2)에 배치된다. 이 보호는 모든 카메라 또는 응용 프로그램에 필요하지 않습니다.

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프로토콜

식물 재료의 준비 (1)

  1. 대상 식물 재료 중 하나 잎 또는 전체 식물 (HOSTA 종. 또는 위 Phaseolus 심상)를 사용합니다.

얼음 핵 활동 (INA) 박테리아를 함유하는 물 솔루션 2. 준비

  1. 문화는 INA 세균, 슈도모나스 시린 개 (Pseudomonas syringae)는 25 ° C 슈도모나스에 한천 (F)에서 배양 접시에 (주 CIT의-7) 제조업체의 방향을 100 % 글리세롤의 10g / ℓ로 준비했다.
  2. 배양은 4 ℃에서 충분히 성장한 후 장소 필요하지만 얼음 핵 활성의 수준을 높일 이전 이틀 동안 4 ℃에서 유지 될 때까지.
  3. 일회용 플라스틱과 한천의 표면으로부터 하나의 플레이트로부터 긁어 박테리아 또는 재사용 가능한 금속 주걱을 사용하여 장소시 탈 이온수 10 내지 15 ㎖에 25 ㎖ 일회용 큐벳에서. · 농도는 1 × 107 1 × 109의 범위 내에 있어야 ml의 -1. 이 솔루션은 흐린 나타납니다. 농도가 단지 근사 될 필요성 혈구 또는 분광 광도계 농도를 확인할 필요는 없다.
  4. 박테리아를 분배하는 10 초 이상 동안 큐벳을 소용돌이.
    주의 : 수득 INA 혼합물의 특정한 농도는 중요하지 않으며 기술 된 프로토콜은 얼음 핵 활동의보다 적절한 레벨을 제공 할 것이다. INA 박테리아와 물의 혼합물은 핵 실험에서 나중에 사용될 것이다.

3. 냉동 실험 설정하기

  1. 보호 아크릴 상자 안에 고해상도 적외선 카메라 (SC-660)를 올려되도록 상자 전면의 개구부를 통해 렌즈 프로젝트 및 박스의 후방 개구를 통하여 랩탑 또는 기록 장치 출구에 카메라를 연결하는 와이어 . 상자의 뚜껑을 고정하고있는 위치에 환경 챔버 또는 냉장고 내부의 상자를 배치 할 모든 것아야 대상 식물 재료를 볼 수 있습니다.
    1. 반사 된 적외선 에너지로부터의 간섭을 방지하기 위해 흑색 도화지와 챔버의 벽을 라이닝 식물 물질 주위의 어두운 배경을 제공한다.
    2. 가시 파장에서의 화상 기록이 요구 될 때 광원으로부터의 가열을 최소화하기 위해 LED 조명 챔버를 장착한다. 식물이 카메라로 표시하는 등의 배터리로 작동 옷장 빛 또는 다른 작은 LED 장치로 조명 만 최소가 필요합니다.
      1. 대상 식물 재료의 볼 이미지가 촬영되면, LED 조명을 끄십시오. 포트 또는 챔버 내의 다른 개구부를 통해 카메라에 모든 외부 유선 연결 (컴퓨터 FireWire 연결, 전원 코드 등)를 분배.
    3. 피하거나 챔버 내에서 온도 기울기를 감소시키기 위해 발포 단열재와 포트 또는 개구에 여분의 공간을 채우기. 1 ° C에서 챔버의 초기 온도를 설정합니다.
  2. 식물 재료는 카메라의 시야에 있고, 식물 재료가 원격보기 화면 또는 선택된 소프트웨어 내에 표시되도록 식물 또는 식물 파트를 정렬.
  3. 식물 전에 동결 제어 실험을 시작으로, 식물 재료의 크기에 따라 1 시간 30 분 동안 0 ° C에서 평형을 허용. 이 실험은 동결 시작되면 식물의 온도가 몇도만큼 공기 온도 뒤쳐하지 않을 것을 보장한다. 식물 재료의 온도는 대기 온도의 0.5 ° C 내에있을 때 평형이 달성된다.
    1. 화분에 심은 식물을 사용하는 경우 화분의 흙 위에 스티로폼 단열재의 층을 놓습니다. 식물이 평형 한 후, 챔버의 냉각 개시.
      주 : 냄비의 토양 표면에 절연 층이 식물 주변 공기 포트로부터 계속 열 손실의 양을 감소시키고, FRE으로부터 뿌리를 방지ezing이 전형적으로 인해 토양에 잔류 열 존재의 대규모 저수지에 자연 서리 이벤트 기간 동안 발생하지 않을 것입니다.
  4. 3.4.1-3.4.4에서 논의 된 바와 같이, 원하는 카메라 매개 변수 (색상 팔레트, 온도 범위, 관심의 특정 영역 등)을 설정합니다.
    1. 라이브 영상을 보는 동안 온도 변화를 표시하는 무지개 색상 표를 선택합니다.
    2. 단지 소프트웨어의 이미지 아래에있는 온도 막대를 조정하여 5 ° C의 온도 범위를 설정합니다.
    3. 선택된 팔레트 (무지개)에 의해 정의 된 거짓 컬러 화상에 적외선 데이터를 변환하기위한 리니어 스케일 (알고리즘)를 선택하고, 5 ℃까지 온도 범위를 설정하고, 화상에 기초하여 자동으로 추적. 실험을 수행하는 동안 또는 수동으로 설정 범위를 조정합니다.
      1. 소프트웨어가 제공하는 관심의 정의 된 영역 내에서 특정 지점의 온도 또​​는 평균 온도를 사용하여이다. . 기록 된 비디오 시퀀스로부터 혹은 이미지 파일에 포함 된 정보로부터 모든 화소의 온도 데이터를 검색 ResearchIR 3 소프트웨어 내에서 일반적인 화면을 보여준다.
    4. 관심의 특정 지점을 나타내는 식물 조직의 위치에 커서를 놓습니다. 포인트 (1-3 사이즈 화소), 박스, 선, 타원, 또는 원으로 관심 영역을 정의. 점 또는 도형의 여러 조합이 이미지 위에 위치 될 수있다.
  5. 비디오 시퀀스 녹화
    1. 60 Hz에서와 촬영 수동으로 중지 할 기록하기 위해 카메라를 설정합니다.
    2. 녹화 된 비디오 파일이 배치 될 컴퓨터 또는 외부 드라이브의 위치를​​ 나타냅니다.
    3. 녹화 시작.
      참고 : 큰 비디오 파일이 생성되기 때문에 외장 하드 드라이브에 기록하는 것이 좋습니다. 녹화 된 비디오 파일은 나중에 NE 함유 부분만을 포함하도록 편집 될 수cessary 정보. 이것은 크게 파일 크기를 감소시킬 것이다.
    4. 0.5 -1.0 ° C에 의해 점진적으로 챔버의 온도를 낮 춥니 다. 식물 온도가 대기 온도와 평형을 때까지 기다린 후 0.5 ~ 1.0 ° C로 다시 온도를 낮 춥니 다. 식물 관찰되는 조직과 형태의 질량에 따라, 평형은 10 분 (15)에 걸릴 수 있습니다. 따라서, 약 4 ° C / 시간의 냉각 속도를 제공.
    5. 식물 얼과 관측이 완료 될 때까지 이러한 방식으로 계속. 냉동 처리가 완료되면, 기록 종료.
      참고 : 그들은 동일한 온도에서 때문에 식물 재료 및 배경이 동색 인 경우에 식물 조직은 공기 온도로 평형화 하였다. 배경 온도 및 식물 조직의 온도가 동일하게되어 있기 때문에, 다시 온도를 낮추고 식물 조직과 간의 온도 차이가있을 때까지 식물 재료를 시각화하기 어려울 수있다IR 온도.

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결과

얼음 + 박테리아의 얼음 핵 활동, 슈도모나스 시린 개 (Pseudomonas syringae) (주 CIT의-7)

10 μL의 물 방울과 피를 포함하는 물 10 μL syringae (CIT의-7) hosta 리프의 배축 표면에 배치했다 (HOSTA 종.) (그림 4). 도시 된 바와 같이, INA 박테리아 함유 물 방울과 제 동결 잎 표면에 물이 얼지 드롭 유지하면서 동결 잎을 유도 할 책임이었다.

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토론

물 우물 0 ° C 이하의 온도와 물이 상당히 가변적 일 수 동결되는 온도로 과냉각하는 기능을 갖는다. 순수 과냉각 36 내열 온도는 약 -40 ° C이며 균질 핵 생성 지점으로 정의된다. 따뜻한 온도에서 물이 동결보다 -40 ° C는 다음 얼음 형성과 성장을위한 촉매 역할을하는 형성하는 작은 얼음 배아를 사용하는 것이 핵형 성제 이종의 존재에 의해 초래됩니다. (37) 자연 속에서 분자의 다?...

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공개

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계 나 이해 관계의 충돌이 없습니다.

감사의 말

P23681-B16 :이 연구는 오스트리아 과학 기금 (FWF)에 의해 투자되었다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Infrared CameraFLIRSC-660Many models available depending on application
Infrared Analytical SoftwareFLIRResearchIR 4.10.2.5$3,500
Pseudomonas syringae (strain Cit-7)Kindly provided by Dr. Steven Lindow, University of California  Berkeley icelab@berkeley.edu
Pseudomonas Agar FFisher ScientificDF0448-17-1

참고문헌

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