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요약

이 프로토콜은 적게 10 μL의 혈청 샘플에서 세포 외 소체 (전기 자동차), 셀로부터 방출 멤브레인 작은 입자를 분리하는 방법을 자세히 설명. 이 접근법은, 초 원심 분리의 필요성을 회피 분석 시간의 몇 분을 필요로하고, 제한된 양의 시료로부터 전기차의 분리를 가능하게한다.

초록

세포 외 소포 (전기 자동차), 각종 세포에서 방출 막의 입자는, 임상 적용을위한 할 수있는 잠재력을 가지고 있습니다. 그들은 핵산과 단백질화물을 포함 점점 진핵​​ 생물과 원핵 세포 모두에 의해 사용되는 세포 간 의사 소통의 수단으로 인식하고 있습니다. 그러나, 작은 크기로, 전기 자동차의 분리를위한 현재의 프로토콜은 종종 시간이 소요, 복잡하고, 이러한 초 원심 분리기와 같은 큰 샘플 볼륨과 고가의 장비를 필요로합니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 쉽게 효율적이고, 10 μL로 낮은 샘플 볼륨을 필요 전기차의 서브 그룹들을 분리하기위한 종이 기반 면역 플랫폼을 개발했다. 생물학적 시료는 화학적으로 특정한 EV 표면 마커에 높은 친 화성을 가지고 포획 분자로 변성 된 종이 테스트 존에 직접 피펫 팅 될 수있다. 우리는 주사 전자 현미경 (SEM)을 사용하여 분석의 유효성을 확인, 종이 기반 효소 결합 immunosorbent 분석 (P-ELISA)과 전 사체 분석. 이 종이 기반의 디바이스는 건강과 질병에 EV 기능에 대한 우리의 이해를 발전하기 위해 병원과 연구 환경에서 전기 자동차의 연구를 가능하게 할 것이다.

서문

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membranous particles that range in size from 40 nm to 5,000 nm and are released actively by many cell types via different biogenesis routes1-9. They contain unique and selected subsets of DNA, RNA, proteins, and surface markers from parental cells. Their involvement in a variety of cellular processes, such as intercellular communication10, immunity modulation11, angiogenesis12, metastasis12, chemoresistance13, and the development of eye diseases9, is increasingly recognized and has spurred a great interest in their utility in diagnostic, prognostic, therapeutic, and basic biology applications.

EVs can be classically categorized as exosomes, microvesicles, apoptotic bodies, oncosomes, ectosomes, microparticles, telerosomes, prostatosomes, cardiosomes, and vexosomes, etc., based on their biogenesis or cellular origin. For example, exosomes are formed in multivesicular bodies, whereas microvesicles are generated by budding directly from plasma membrane and apoptotic vesicles are from apoptotic or necrotic cells. However, the nomenclature is still under refined, partly due to a lack of thorough understanding and characterization of EVs. Several methods have been developed to purify EVs, including ultracentrifugation14, ultrafiltration15, magnetic beads16, polymeric precipitation17-19, and microfluidic techniques20-22. The most common procedure to purify EVs involves a series of centrifugations and/or filtration to remove large debris and other cellular contaminants, followed by a final high-speed ultracentrifugation, a process that is expensive, tedious, and nonspecific14,23,24. Unfortunately, technological need for rapid and reliable isolation of EVs with satisfactory purity and efficiency is not yet met.

We have developed a paper-based immunoaffinity device that provides a simple, time- and cost-saving, yet efficient way to isolate and characterize subgroups of EVs22. Cellulose paper cut into a defined shape can be arranged and laminated using two plastic sheets with registered through-holes. In contrast to the general strategy to define the fluid boundary in paper-based devices by printing hydrophobic wax or polymers25-27, these laminated paper patterns are resistant to many organic liquids, including ethanol. Paper test zones are chemically modified to provide stable and dense coverage of capture molecules (e.g., target-specific antibodies) that have high affinity to specific surface markers on EV subgroups. Biological samples can be pipetted directly onto the paper test zones, and purified EVs are retained after rinse steps. Characterization of isolated EVs can be performed by SEM, ELISA, and transcriptomic analysis.

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프로토콜

작업 절차의 일반 다이어그램 그림 1에 제공됩니다. 윤리 실천을 사용하여, 우리는 (정상인의 혈액 샘플을 수집하고, IRB는 프로토콜을 승인 대만에서 타이 재향 군인 병원 (TCVGH), 타이 통해 환자의 방수 샘플을 얻을 IRB TCVGH 번호 CF11213-1).

종이 장치 1. 제작

  1. 96- 웰 마이크로 타이 터 플레이트와 같은 레이아웃을 제공하도록 직경 5mm의 원으로 크로마토 종이 잘라. 등록 관통 구멍, 라미네이트 두 폴리스티렌 시트 이러한 종이 조각을 샌드위치.
  2. 다음 28 단계에서 설명한 화학적 컨쥬 게이션 방법을 사용하여 용지를 수정 장치.
    1. 플라즈마 챔버에서의 산소 플라즈마 (100 mW의 1 % 산소, 30 초)와 함께 종이 취급 장치.
      주의 : 3- 머 캅토 프로필 트리 메 톡시 실란 및 N -γ 말레이 미도 숙신이 미드로 작업 할 때 특별한주의를 기울여야합니다에스테르 (GMBS), 그들은 모두 습기에 민감하고 독성이 있기 때문이다. 보호 장갑을 착용하고 흡입을 피하거나 피부 및 눈에 접촉. 밀폐하여 주식 병을 유지하고 결로를 방지하기 위해 열기 전에 RT 평형 수 있습니다. 또한, 질소 충전 장갑 가방이나 상자 안에 주식 병을 엽니 다. 작은 튜브로 나누어지는 주식 병을 자주 개방을 방지 할 수 있습니다.
    2. 바로 30 분 동안 에탄올 (200 증명)에 3- 머 캅토 프로필 트리 메 톡시 실란의 4 % (v / v)의 용액에 용지 처리 장치를 배양한다.
    3. 에탄올로 종이 장치를 씻어 15 분간 에탄올에 0.01 μmol / ㎖ GMBS으로 그들을 품어.
    4. 에탄올 (200 증명) 헹군 후 4 ℃에서 1 시간 동안 인산염 완충 식염수 (PBS)에 10 ㎍ / ml의 아비딘 용액을 종이 장치를 품어. 4 ° C에서 보관이 필요한 경우, 4 주 이내에 사용한다.
  3. (BSA를 PBS 10 μL가 소 혈청 알부민 (/ V W) 1 %를 함유하는 각 용지 테스트 존 적셔) 3 × 10 분 동안 캡처 분자를 바이오틴 10 μl를 안보 전에 3 × 10 분. 또는 아 넥신 V (1:20 넥신 V 결합 버퍼에 v / v)의 항 CD63 항체를 사용하여 (PBS는 w / v)의 BSA와 0.09 % (/ v)의 아 지드 화 나트륨 w (1 %를 포함하는 20 μg의는 / ㎖) 포획 분자.
  4. PBS는 각각 3 × 1 분간 완충액 결합 BSA 또는 아 넥신 V (/ V W) 1 %를 함유하는 상응하는 10 μl를 이용하여 결합되지 않은 항 CD63 항체 또는 아 넥신 V 분자를 씻어.

2. 혈청 및 방수 샘플 수집 및 처리

  1. 혈청 수집.
    1. 혈청 분리 튜브에 정맥 천자에 의해 말초 혈액 10 ㎖를 수집하고 부드럽게 튜브 다섯 번 반전. 수직으로 튜브를 설정하고 30 분 동안 기다립니다.
    2. 15 분 동안 1,200 × g에서 원심 분리기. 30 분 동안 3,000 × g에서 다시 깨끗한 튜브 가기 층에서 혈청, 원심 분리기를 전송합니다.
    3. 0.8 μm의 FIL 통해 뜨는을 전달터. 사용할 때까지 -80 ° C에서 샘플을 보관하십시오.
  2. 수성 유머 컬렉션 : 사용할 때까지 -80 ° C에서 직접 절차 및 샘플을 저장 침략을 통해 안과 의사에 의해 진단 된 환자에서 방수 샘플을 수집합니다.

세포 외 소포 3. 분리

  1. 5 μL / 분의 속도로 각각의 용지 상에 테스트 존 순간 표본.
  2. BSA 또는 넥신 V 각각 항 CD63 항체 또는 아 넥신 V 분자로 기능화 된 종이 장치의 3 × 1 분간 완충액 바인딩 (/ V는 W) PBS 1 % 함유 대응 10 μL와 언 바운드 전기차 헹구어. 다음과 같은 다운 스트림 분석을 수행합니다.

4. 다운 스트림 분석 예 1 : 스캔 Electromicrographs

  1. 10 분 동안 10 μL 0.5 × Karnovsky의 정착을 사용하여 작용 종이 테스트 존에서 캡처 한 전기 자동차를 수정합니다.
  2. 2 × 5 분 동안 충분한 PBS로 샘플을 씻어.
  3. 탈수10 분, 2 × 10 분, 50 % 에탄올, 2 × 10 분, 70 % 에탄올, 2 × 10 분, 95 % 에탄올, 4 × 10 분 동안 100 % 에탄올 이후 35 % 에탄올로 샘플.
  4. 건조 및 코트에게 긴급 팔라듐 / 금으로 샘플을 스퍼터링하고, 저 전자 가속 전압에서 작동 사형 전자 현미경을 사용하여 검사 (~ 5 kV로).

5. 다운 스트림 분석 예 2 : 종이 기반의 ELISA

  1. 1 항 CD9 차 항체를 함유하는 5 μL 솔루션을 추가 : 1000 희석 PBS에서 캡처 전기 자동차를 포함하는 각 시험 영역에. 1 분을 기다립니다.
  2. PBS가 30 초 동안 100 rpm으로 진탕 ml의 30 샘플을 씻어.
  3. 5 μL 솔루션을 포함하는 고추 냉이 과산화 효소 (HRP)를 1 차 항체를 -linked 추가 PBS 1,000 희석하고 1 분을 기다립니다.
  4. PBS가 30 초 동안 100 rpm으로 진탕 ml의 30 샘플을 씻어.
  5. 과산화수소의 부피비 1 : 1를 함유하는 5 μL 비색 기질 추가D의 3,3 ', 5,5'- 테트라 메틸 벤지딘 (TMB)와 데스크탑 스캐너를 사용하여 스캔.

6. 다운 스트림 분석의 예 3 : RNA 분리

  1. 캡처 된 전기 자동차를 용해하는 버퍼를 바인딩 / 폴리 비닐 피 롤리 돈 기반 RNA 분리 원조의 35 μL와 용해의 265 μL에 샘플을 담가. 소용돌이 적극적으로.
  2. 해물에 격리 키트에 30 μL 균질를 추가합니다. 소용돌이는 적극적으로 10 분 동안 얼음에 넣어.
  3. 다음 단계에 설명 된 산 페놀 - 클로로포름 분리를 사용하여 RNA를 추출합니다.
    1. 병의 바닥 층에서 페놀 - 클로로포름 330 μl를 타고 균질 / 해물을 추가 할 수 있습니다. 소용돌이 적극적으로.
    2. 5 분 동안 10,000 XG에 원심 분리기. 깨끗한 튜브로 수성 (위)의 위상을 전송하고 제거 볼륨을 확인합니다.
  4. 이전 단계에서 제거 및 CO 성상의 1.25 배 부피 100 부피 % 에탄올 총 RNA를 침전95 ° C로 예열 용출 용액에서 RNA를 llect.
  5. 농축시키고, 상기의 제조 프로토콜에 따라 RNA 정리 키트를 사용하여 RNA를 정제.

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결과

전기차의 하위 그룹을 분리하는 종이 장치의 기능을 효율적으로 EV 표면 마커의 민감하고 특이 인식에 의존한다. 포획 분자와 종이 섬유의 안정한 다른 변형 28-30 바와 같이 아비딘 - 비오틴 화학 제를 사용함으로써 달성된다. 물리적 흡착 방법의 화학적 결합의 효과와 그 형광 기반의 판독을 사용하여 평가한다. 종이 시험 영역은 단계 1.3에서 20 ㎍ / ml의 형광 단의 R 피코 에리 트린 - 복합 ...

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토론

세포 외 소포의 하위 그룹의 성공적인 분리를위한 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 용지 1) 좋은 선택; 종이 섬유의 표면 상에 포획 분자의 2)에 따르면 안정적이고 높은; 3) 시료의 적절한 처리; 4) 일반 실험실 위생 기준.

다공성 물질은 많은 저렴하고 장비가없는 분석에 사용되어왔다. 이들은 가변 공경, 다목적 기능, 저가 및 높은 표면 대 부피 비율 유체의 수동적 위킹?...

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공개

저자는 그들이 더 경쟁 금융 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 말

이 작품은 대만 국립 과학위원회 grants- NSC 99-2320-B-007-005-MY2 (CC) 및 NSC 101-2628-E-007-011-MY3 (CMC) 및 재향 군인의 일반에 의해 부분적으로 지원 병원과 대만의 공동 연구 프로그램의 대학 시스템 (CC).

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Chromatography PaperGE Healthcare Life Sciences3001-861Whatman® Grade 1 cellulose paper
(3-Mercaptopropyl) trimethoxysilaneSigma Aldrich175617This chemical reacts with water and moisture and should be applied inside a nitrogen-filled glove bag. Avoid eye and skin contact. Do not breathe fumes or inhale vapors.
EthanolFisher ScientificBP2818Absolute, 200 Proof, molecular biology grade
Bovine serum albumin (BSA)BioShop Canada Inc.ALB001Often referred to as Cohn fraction V.
N-γ-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS)Pierce Biotechnology22309GMBS is an amine-to-sulfhydryl crosslinker. GMBS is moisture-sensitive.
AvidinPierce Biotechnology31000NeutrAvidin has 4 binding sites for biotin and its pI value is 6.3, which is more neutral than native avidin
Biotinylated mouse anti-human anti-CD63Ancell215-030clone AHN16.1/46-4-5
biotinylated annexin VBD Biosciences556418Annxin V has a high affinity for phosphatidylserine (PS)
Primary anti-CD9 and secondary antibodySystem BiosciencesEXOAB-CD9A-1The secondary antibody is horseradish peroxidise-conjugated
Serum separation tubesBD Biosciences367991Clot activator and gel for serum separation
Annexin V binding bufferBD Biosciences55645410x; dilute to 1x prior to use.
TMB substrate reagent setBD Biosciences555214The set contains hydrogen peroxide and 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB)
[header]
RNA isolation kitLife TechnologiesAM1560MirVana RNA isolation kit
Polyvinylpyrrolidone-based RNA isolation aidLife TechnologiesAM9690Plant RNA isolation aid contains polyvinylpyrrolidone (PVP) that binds to polysaccharides.
RNA cleanup kitQiagen Inc.74004MinElute RNA cleanup kit is designed for purification of up to 45 μg RNA.
Plasma chamberMarch InstrumentsPX-250
Scanning electron microscopeHitachi Ltd.S-4300
Desktop scannerHewlett-Packard CompanyPhotosmart B1108-bit color images were captured. Cameras and smart phones may be also used.
Image-record systemJ&H Technology CoGeneSys G:BOX Chemi-XX816-bit fluroscence images were captured. Fluroscence microscopes may be also used.

참고문헌

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