다른 잡초 종의 강력한 제초제 저항 테스트를위한 프로토콜

요약

A robust and flexible approach to confirm herbicide resistance in weed populations is presented. This protocol allows the herbicide resistance levels to be inferred and applied to a wide range of weed species and herbicides with minor adaptations.

초록

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented protocols, based on whole-plant bioassays performed in a greenhouse, can be readily adapted to a wide range of weed species and herbicides through appropriate variants. Seed samples from plants that survived a field herbicide treatment are collected and stored dry at low temperature until used. Germination methods differ according to weed species and seed dormancy type. Seedlings at similar growth stage are transplanted and maintained in the greenhouse under appropriate conditions until plants have reached the right growth stage for herbicide treatment. Accuracy is required to prepare the herbicide solution to avoid unverifiable mistakes. Other critical steps such as the application volume and spray speed are also evaluated. The advantages of this protocol, compared to others based on whole plant bioassays using one herbicide dose, are related to the higher reliability and the possibility of inferring the resistance level. Quicker and less expensive in vivo or in vitro diagnostic screening tests have been proposed (Petri dish bioassays, spectrophotometric tests), but they provide only qualitative information and their widespread use is hindered by the laborious set-up that some species may require. For routine resistance testing, the proposed whole plant bioassay can be applied at only one herbicide dose, so reducing the costs.

서문

제초제는 글로벌 식물 보호 시장 ^(1)의 50 %를 차지, 가장 광범위하게 사용 잡초 측정 한 것입니다. 그들은 노동 집약적이고 시간이 많이 소요되는 토양 재배 관행을 방지하고, 궁극적으로 비용 효율적이고 안전하고 유익한 식품 ^생산이 결과, 상대적으로 저렴한 도구입니다. 그러나 함께 제초제 사용에 이상 의존 많은 잡초 종의 큰 생물 계절 및 유전 적 다양성의 존재는, 자주 제초제 저항성 잡초 집단의 선택을 초래한다. 매우 특정한 대사 표적 선택적 제초제 도입 ^3-5 년간 저항 경우의 수를 극적으로 증가하고있다. 현재까지 전 세계적으로 240 잡초 종 (140 dicots 100 외떡잎은) 액션 (SOA) ^4의 다른 제초제 사이트에 대한 저항을 진화했다. 이것은 지속 가능한 작물 생산을위한 주요 잡초 관리를위한 관심과 일반적으로 더 많은 것이다.

자주 온실에서 수행 신뢰성 시험에 기초 e_content "> 저항의 조기 발견, 제초제 내성 잡초를 관리하는 중요한 단계이다. 다른 접근법으로, 목표 정확도, 시간 및 이용 가능한 자원의 요구 수준에 따라 개발되어왔다 잘 ^{6-12 간주} 잡초 종으로. 그러나, 새로운 잡초 생물 형의 저항 상태의 확인이 (필요한 경우 즉,에 속하는 하나 이상의 제초제 생존 할 수있는 능력 등 여러 가지 생리 학적 특성을 공유하는 사람들의 그룹, 일반적으로 이들을 제어 할 도즈 사용 특정 그룹), 견고한 전체 식물 생물 검정법은 제어 된 환경 ^{4, 11에서} 수행 될 필요가있다.

생물 형이 하나의 제초제에 내성이 드물게있다. 각 생물 형 따라서이에 강한 제초제의 특정 저항 패턴, SOA의 즉, 수와 유형을 특징으로, 주어진 저항입니다각 제초제 ¹³ 수준. 간 또는 복수의 저항 ^(5)의 패턴의 조기 판정 및 ^{신뢰성은 14} 필드 저항성 관리에 중요하다.

그것은 그 제초제 저항이 자연의 허용 오차와 아무 상관이 언급 할 가치가 일부 제초제, 예를 들어, ACCase 억제 제초제, 단자엽 종 대 2,4-D 대 쌍자엽 종, 속새 arvense 대 대한 몇 가지 잡초 종 전시 글 리포 세이트.

이 논문은 제초제 (들)에 의해 가난한 제어가보고되었다 분야에서 샘플링 추정 제초제 저항성 생물 형을 테스트하기위한 강력한 방법을 제공합니다. 관련된 잡초 종과 관련하여 표준 프로토콜에 관련 변형되게됩니다. 페트리 접시 ^(8)에 단 하나의 제초제 용량 ^(15), 또는 치료 씨앗을 사용하거나 전체 공장 생물 검정을 기반으로 다른 기술 / 프로토콜을 통해 장점은 높은 reliab 관련된ility 때문에 실험에서 두 제초제 선량 개재물 저항 레벨을 추정하는 가능성. 그러나, 루틴 저항 테스트를 위해, 동일한 방법이 때문에 비용을 절감 하나만 제초제 용량으로 적용 할 수있다.

뿐만 아니라 저항 상태의 확인을 허용하는대로, 얻어진 정보는 모두 다음의 연구 단계를 최적화 및 / 또는 음향 저항 관리 전략을 고안에 사용될 수있다.

프로토콜

1. 종자 시료 채취 및 보관

1. 불리한 기후 조건 또는 품질이 낮은 제초제 처리로 인해하지 즉 부당한 가난한 제초제 성능을 재배 필드, 모니터링합니다.
2. 한 번에 한 종의 종자 샘플을 수집하고 고유 한 코드를 할당합니다. 성숙한 종자는 일반적으로 제초제 처리 (들)을 살아남은 식물에서 작물 수확하기 전에 수집됩니다. 씨앗이 때 어머니 식물에 의해 성숙 창고 경우 적시에 모니터를 관찰합니다.
3. 종, 수집 날짜, GPS 좌표, 지방 자치 단체, 농부의 이름, 필드 크기, 감염 수준, 작물, 제초제 (들) 시즌 동안 사용 및 필드의 역사적 기록의 할당 된 고유 코드, 이름을 나타내는 각 샘플에 대한 양식을 작성 .
4. 필드 침략의 대표 적어도 30 무작위로 선택된 식물에서 종자를 수집합니다. 종자 샘플이 적어도 5,000 성숙한 씨앗이 포함되어 있는지 확인합니다. 의무적 교잡 잡초 종(예를 들어, 종 Lolium. 또는 Amaranthus 종은.), 5000 ⁽¹¹⁾ 주위에 종자의 수를 유지하면서 10-15 식물의 수를 감소시킨다.
5. 잡초의 패치 (헥타르 이상) 넓은 지역에 흩어져있는 것처럼 다른 제초제 저항성 생물 형을 선택하는 필드를 하위 샘플.
6. 할당 된 고유 코드로 표시된 봉인되지 않은 종이 봉투에 보관 씨앗.
7. 수분이 증발하지만 차 휴면 유도를 방지하기 위해 높은 온도 (즉, 태양 아래 차를 떠나 피) 또는 극단적 인 온도 변화에 씨앗을 노출되지 않도록 할 수 있습니다.
8. (왕겨, 드 선체 씨앗 등을 제거)하고 건조한 장소에 상온에서 보관 청소. 첫 번째 저항 시험을 수행 한 후, 진공 밀봉 된 비닐 봉지에 바람직하게는 4 ° C에서 어두운 방에 오랜 시간 동안 씨앗을 저장합니다. 이러한 방식 씨앗 상당히 긴 시간 동안 그들의 생존을 유지.

2. 휴면 속보 종자

참고 : 종자 휴면 적응과 농업 생태계에 지속 잡초를 할 수있는 유연하고 효율적인 메커니즘을 제공합니다. 종자 발아를 휴면을 중단하고 허용하기 위해 다른 프로토콜 즉 잡초 종, 수면 ^(16)의 종류에 따라 사용할 수있다.
휴면을 제거하는 세 가지 방법이 있습니다 :

1. 춘화
   참고 :. 예를 들어, Amaranthus의 retroflexus, 명아주 앨범, Lolium 종, 귀리 fatua, 폴리 고눔 여뀌 속 : 동시 발아 및 유묘 출현, 일주일에 몇 일에 이르기까지 종자 춘화의 기간을 얻으려면 많은 종에서 생리적 휴면을 제거하기 위해 필요 , Phalaris는 ^{17 ~ 19} paradoxa. 최대 15 일 이상 기간이 Schoenoplectus mucronatus 위해 30 일 개양귀비, 방동사니의 difformis 및 Ammania의 coccinea 필요하고 20.
   1. 플라스틱 접시에 약간의 탈 물을 넣습니다. 초과를 제거, 필터 종이의 두 층을 잘라 물을 흡수. 종이에 공기 건조 씨앗을 놓습니다. 시간이 필요한 기간 동안 4 ° C에서 냉장고에 플라스틱 접시를 전송합니다.
2. 혹평
   주 : 일부 잡초 종 인해 기계적 휴면 즉 종피 특성에 다른 것보다 더 발아 분해성이며, ²¹ 발아 황산을 사용하여 화학적 혹평의 사용을 필요로한다.
   1. 진한 황산 (95~98%)와 비커를 준비합니다. 물이 가득 비커를 준비합니다. 부직포 봉투에 씨앗을 넣습니다.
   2. 진한 황산에 각각 20 분 또는 5 분 동안 예를 들어, Echinochloa 종. 또는 수수 halepense 씨앗을 만끽 해보세요.
   3. 핀셋을 사용하여 비커에서 봉투를 타고 물이 가득 비커에 넣어. 열기봉투, 작은 소쿠리에 씨앗을 넣고 철저하게 흐르는 물을 씻어.
   변종 : A. 질경이-aquatica는 다른 프로토콜을 필요로 ^{22, 23}
   1. 클로로포름의 2 분의 씨앗을 만끽. 탈 이온수와 씨앗을 씻어 흡수 종이를 건조. 5 분 동안 80 % 황산 속에서 종자 덩크.
   2. 작은 소쿠리에 씨앗을 넣고 철저하게 흐르는 물을 씻어.
3. 수확 후 종자의 성숙
   참고 : 다른 잡초 종의 종자에 관계없이 휴면을 중단하는 데 사용되는 방법, 만기 후 몇 개월 동안 전혀 발아하지 않습니다.
   1. RT와 낮은 습도에서 적어도 3~4개월의 기간 동안 씨앗을 저장 한 후 휴면 파괴 (예를 들어, 오리 자 사티 VAR. sylvatica 또는 피 속 rhoeas)에 대해 위의 프로토콜을 따르십시오.

3. 종자 발아

1. 장소 씨는 PLAS에 발아한다0.1 %의 질산 칼륨 (KNO _3)와 0.6 % (M / V) 한천을 포함 TIC 요리 추가 :
   1. 탈 이온수를 사용하여 0.6 % + 0.1 %의 KNO _3에 한천 용액을 준비한다. 전자 레인지에서 용해한.
   2. 플라스틱 접시에 한천 용액을 붓고. 기판을 냉각 한 후 씨앗에 넣어.
   변형 토양은 플라스틱 접시에 기질로서 사용될 수있다. 이 연습은 Echinochloa 종에 특히 효율적입니다., S. halepense 및 Lolium 종.
2. 각각의 잡초 종을위한 최적의 조건에 따라 빛과 온도 조건을 일주일 정도 발아 캐비닛에 플라스틱 접시를 놓습니다. 가장 겨울 종의 경우, 온도 범위는 25분의 15 ° C의 밤 / 낮의 15-30 μmol m ^-2 초 ^-1의 광합성 광자 플럭스 밀도 (PPFD)을 제공하는 네온 튜브 12 시간 광주 기이다. 여름 많은 종의 경우, 온도 범위는 15/30 ° C의 밤 / 일이다.
   변형 : S이러한 S. 등 오메 종, halepense, 열처리가 필요합니다. S의 따라서 혹평 후, 씨앗 정상적인 조건에서 다음 삼일 발아 캐비닛에 사흘 동안 24 ° C에서 45 ° C와 20 시간에서 4 시간의주기를, 그리고 : halepense는 다음과 같은 조건을 실시한다.

4. 모종 이식과 성장

1. 이식 표준 포팅 믹스로 가득 플라스틱 트레이 (325 X 265 X 95mm)에 15-20 모종 (60 % 미사 질 양토, 15 % 모래, 15 % agriperlite 10 % 이탄 - 부피).
   주 : 이식 대신 직접 파종, 제초제 처리의 성능을 최적화하는 중요한 전제 조건 인, 동일한 성장 단계에서 식물의 균일 스탠드 얻을 수있다.
2. 수와 진보적 인 트레이 번호를 복제, 인구 코드, 제초제가 테스트중인 <: 고유 식별에 대한 모든 정보를 포함하는 바코드 각 트레이를 식별합니다./ 리>
3. 또는 필드의 용량이 거의 기판을 유지하기 위해 가열 된 물을 식물, 온실에서 찾는 트레이.
   주 : 성장 온도가 잡초 종류에 따라 달라집니다. 종종 시험은 가을 / 겨울 / 봄에 완료, 그래서 빛이 약 150 μmol 분 ^-2 초 PPFD을 제공하는 400 W 메탈 할라이드 램프, ^-1과 12 시간의 광주 ^{(24), (19).} 여름 잡초 종을 사용하여 보충 C ₄ 광합성주기는 일반적으로 더 높은 빛의 강도를 필요로하기 때문에 시험은 늦은 봄 - 여름에서 수행하거나 보충 빛의 세기가 약 400 μmol 분 ^-2 초 ^-1 14 시간의 광주에있다된다.
4. 패 디 쌀, 예를 들어, A를 감염시키고 일부 잡초 종에 대해 서로 다른 프로토콜을 사용하여 질경이-aquatica, S. mucronatus와 C ^22에 기술 된 바와 같이 difformis.
   1. 24 라운드 세포 (55mm 직경, 64mm 깊이) FIL와 폴리스티렌 트레이에 모종을 이식60 % 미사 질 양토, 30 %의 모래와 (부피 기준) 10 % 이탄으로 이끌었다.
   2. 12cm의 트레이 깊은 플라스틱 용기는 물이 가득하고 (그림 1) 부동 방지하기 위해 나사 스테인리스 봉에 의해 아래로 battened을 설정합니다.
   3. 토양 표면의 레벨 아래 1~2cm에서 용기의 수위를 유지하고 조류의 증식을 방지하기 (10 ~ 12 L의 물을 포함)은 각 컨테이너에 황산구리 1.5 g을 추가한다.

5. 제초제 트리트먼트

1. 사전 출현 제초제와 치료 :
   1. 발아 캐비닛에 3 일 정도는 3 장에서 설명한대로 한 후, 위에 설명 된 기판을 포함하는 플라스틱 트레이에 발아 씨앗을 이식 및 토양의 층 (약 1cm) 커버. 이 모종 제초제 효과보다는 과도한 매몰 깊이로 인해 나타날되지 않도록하기 위해서 중요한 공정이다.
   2. 필드 CAPA에 기판을 가지고물이 가득 접시에, 바닥에 약간의 구멍이 트레이를 배치하여 도시.
   3. 어느 날 이식 후 사전 출현 제초제 ⁽²⁵⁾ 트레이를 취급합니다.
   4. 접시에서 모세관 현상에 의해 위와​​ 아래 모두에 필요한 물을 첨가하여 상기 기판 또는 근접장 용량을 유지. 이 절차는 좋은 치료 효과에 대한 (즉, 발아 씨앗이있는 곳) 적절한 깊이에 제초제의 영속성을 선호한다.
2. 포스트 출현 제초제와 치료 :
   1. 그들은 2-3 잎 단계에 도달 할 때 식물 스프레이 (즉, 성장 단계 확장 BBCH 성장 규모 ^(26)의 12 ~ 13).
   2. 치료 다음 날부터 시작, 잡초 종의 물 요구 사항 및 Echinochloa 종의 계절 (예에 따라 관개 시스템을 설정합니다.이 9 오전 9 시부 터 일정한 간격으로, 3 분 동안 하루에 4 번 물을 제공합니다 PM). 물은 DIS입니다자동 스프링클러 관개 시스템을 사용하여 tributed.
      변종 : 제초제는 식물 무대 BBCH 14-21에 적용됩니다.
3. 제초제 준비 및 배포.
   주 : (전후 출현) 모든 제초제 두 용량으로 권장 활성제로 상업적 제제로서 적용되어 추천 필드 도즈 (1X) 및 세 배 (3X)있다.
   1. 필요한 경우, 라벨 지시에 따라 대량의 계면 활성제 용액을 제조 하였다; 최종 농도는 일반적으로 최종 부피의 백분율 (예를 들어, 0.3 %)로 표현하거나 볼륨으로 단위 면적 (예를 들면, 1 L의 ^HA-1)별로 분배 될.
   2. 활성 성분의 적절한 농도를 유지하기 위하여 제초제 (용질) 용액 용 용매로서 계면 활성제 용액을 사용한다. 첫 번째 제초제 솔루션을 준비합니다 (3 배). 상업적 제품의 수량이 계면 활성제 용액에 용해 (또는 경우 탈 이온수으로 계산할계면 활성제는 다음의 방정식을 사용하여)가 필요하지 않다 :
      용량 _허브 = [(용량 _필드 X 선량 _최대) × V _핀] / V _델
      여기서 용량 _허브 = 제초제 용량 (㎖), 용량 _필드 = 제초제 필드 용량 (하 ^㎖를-1), 용량 _최대 = 최대 용량 제공, V _{지느러미는} = 솔루션 (L)의 최종 부피는 V _델은에 의해 전달 볼륨을 = 벤치 분무기 (L 하 ^-1).
   3. 덜 집중 하나 (1 배)을 제조 : (1, V / V 2) 제초제 솔루션 배 희석. 이 절차는 계량 또는 제초제를 피펫 팅 할 때 실수의 가능성을 감소시킨다. 볼륨 단위 영역 (L 헥타르 ^-1) 당 분산로서 제초제 용액 농도가 발현된다.
   4. 낮은 제초제 량 (1X) 치료의 순서를 시작합니다. 이러한 방식으로 동일한 두 제초제먼트 사이 분무 캐비넷 세척 할 필요가 없다.
   5. 제초제 solutio 배포N 세 평면 팬 (확장 범위) 유압 노즐 장착 붐 215 kPa의 압력에서 300 L의 ^HA-1 (± 1 %), 전달 정밀도 벤치 분무기, 0.75 m 초 ^-1의 속도를 사용하여 .
   6. 제초제는 표백제를 1 %를 사용하여 변경 될 때 두 번 분사 캐비닛을 씻으 (v / v)의 다음 씻어.
      변종 : 글 리포 세이트 200 L 하 ^{-1 (27)의} 스프레이 볼륨에 적용됩니다.
      참고 : 특별한 관심이 높은 생물 제초제가, 같은 설 포닐 우레아의 sulfometuron 또는 flazasulfuron가 사용되는 경우 지불해야합니다. 후자의 경우에는 암모니아로 한 표백제 용액으로 세척하고 다른 작업을 수행 (2.5 % v / v)의 물로 조심 린스.

6. 수집 및 데이터 분석

1. 각 트레이를 자동 식별 바코드 판독기를 통해, 치료뿐만 아니라 비주얼 기준 매스 (VEB)을 생존 식물의 수를 기록한다. 식물은 엉덩이입니다그들이 상관없이 색상이나 다른 모양의 활성 증가를 보여 경우 죽은 것으로 ESSID와.
   1. 테스트 제초제에 따라 세 사주 치료 (와트) 후 평가를 (예를 들어, ACCase 억제제 세 와트 및 루게릭 병 억제제 또는 글 리포 세이트에 대한 네 와트).
   2. 즉, 취약 인구 (S 확인) 모든 실험에서, 결코 또는 드물게 제초제로 처리하지 않는 사이트에서 수집 된 인구를 포함하여 일반적으로 치료 효과를 평가합니다.
   3. 처리 된 식물들의 수의 비율로 익스프레스 식물 생존율, (두 반복 실험의 평균값) 다만 제초제 처리 전의 계산하고, 평균값에 따라 표준 에러 (SE)를 계산한다.
   4. 처리와 같은 인구 ^{(25), (28)의} 확인을 처리하지 사이에 VEB 식물 바이오 매스를 시각적으로 비교를 통해 얻을 수있다. 점수를, 0 (하지 처리 검사에 비해) 제초제의 영향을받지 않는 식물 (10)에 이르기까지 언제식물이 명확하게 죽은, 각 처리 트레이로 제공됩니다.
2. S 생존자 이상 제초제 도즈 1X, R에서 20 %로 5 % 내지 원거리 때 식물의 5 % 미만이 제초제 도즈 1X, SR 살아남은 두 제초제 투여 량으로 치료에서 얻어진 결과에 기초하여 네 가지 범주로 돌리다 개체군 생존자 제초제 도즈 1X에서 20 % 이상 및 제초제 도즈 3X ^17에서 10 % 이상이있는 경우 식물의 20 % 제초제 도즈 1X 및 RR 살아 남았다.

결과

추정 내성 인구의 저항 상태를 평가하기 위해, 제초제의 효과를 확인하기 위해 분석에서 감수성 검사를 포함하는 기본이다. P. 실시 스크리닝 테스트 결과 속 rhoeas 집단은, 밀 필드를 감염시키고 잡초는, 감수성 검사 (09-36)에와 의심에 강한 하나 (10-91)에 사 후 출현 제초제의 효능에 나타난 그림 2에보고됩니다. 인구 09-36 완전히 하나의 식물, 플로라와 tribenuron 메틸 ...

토론

1) 종자가 성숙 제초제 처리 (들)을 살아남은 식물에서 수집되어야한다 : 프로토콜 내에서 몇 가지 단계가 인구에 제초제 저항의 성공적인 평가를 위해 중요하다. 어머니 식물 종자의 성숙 나중에 종자 발아에 어려움을 피하기 위해 매우 중요하다; 2) 씨의 적절한 보관은 발아를 방지 할 수 금형의 확산을 방지하는 것이 좋습니다; 제초제 패키지의 라벨에보고 3) 묘목은 오른쪽 성장 단계에서 처리?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paper bags	Celcar SAS
Plastic dishes	ISI plast S.p.A.	SO600	Transparent plastic
Sulfuric acid 95-98%	Sigma-Aldrich	320501
Non-woven fabric	Carretta Tessitura	Art.TNT17	Weight 17 g m-2
Chloroform >99.5%	Sigma-Aldrich	C2432
Agar	Sigma-Aldrich	A1296
Potassium nitrate >99.0%	Sigma-Aldrich	P8394
Plastic containers	Giganplast	1875/M	600 x 400 x 110 mm
Plastic trays	Piber plast	G1210A	325 x 265 x 95 mm
Polystyrene trays	Plastisavio	S24	537 x 328 x 72 mm, 24 round cells (6x4)
Copper sulfate	Sigma-Aldrich	451657
Agriperlite	Blu Agroingross sas	AGRI100
Peat	Blu Agroingross sas	TORBA250
Germination cabinet	KW	W87R
Nozzles	Teejet	XR11002-VK, TP11001-VH	The second type of nozzles are used only for glyphosate
Barcode generator	Toshiba TEC	SX4
Labels with barcode	Felga	TT20200	Stick-in labels with rounded corners
Barcode reader	Cipherlab	8300-L	Portable data terminal
Bench sprayer			Built in house
Herbicides included in the results:
Commercial product	Active ingredient	Company	Comments
Altorex	imazamox	BASF
Azimut	florasulam	Dow AgroSciences
Biopower		Bayer Crop Science	Surfact to be used with Hussar WG
Dash		BASF	Surfact to be used with Altorex
Granstar	tribenuron-methyl	Dupont
Gulliver	azimsulfuron	Dupont
Hussar WG	iodosulfuron	Bayer Crop Science
Nominee	bispyribac-Na	Bayer Crop Science
Roundup	glyphosate	Monsanto
Trend		Dupont	Surfact to be used with Granstar and Gulliver
Viper	penoxsulam	Dow AgroSciences
Weedone LV4	2,4-D	Isagro