마우스 차 간세포에서 지방산 산화 및 지방 생성의 결정

요약

드 노보 지방 생성 및 β - 지방산 산화는 간세포의 주요 대사 경로, 지방간 질환 등 여러 가지 대사 장애에 교란되는 경로를 구성한다. 여기에서 우리는 마우스 차 간세포의 분리를 보여와 β-지방산 산화 및 지방 생성의 정량화를 설명합니다.

초록

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid oxidation, or alternatively, synthesize new lipid via de novo lipogenesis. The net sum of these pathways is dictated by a number of factors, which in certain disease states leads to fatty liver disease. Excess hepatic lipid accumulation is associated with whole body insulin resistance and coronary heart disease. Tools to study lipid metabolism in hepatocytes are useful to understand the role of hepatic lipid metabolism in certain metabolic disorders.

In the liver, hepatocytes regulate the breakdown and synthesis of fatty acids via β-fatty oxidation and de novo lipogenesis, respectively. Quantifying metabolism in these pathways provides insight into hepatic lipid handling. Unlike in vitro quantification, using primary hepatocytes, making measurements in vivo is technically challenging and resource intensive. Hence, quantifying β-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis in cultured mouse hepatocytes provides a straight forward method to assess hepatocyte lipid handling.

Here we describe a method for the isolation of primary mouse hepatocytes, and we demonstrate quantification of β-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled substrates.

서문

Non-alcoholic fatty liver disease is one of the leading causes of liver disease in Westernized cultures^1,2. Lipid accumulation within the liver is associated with cell death, fibrosis, and liver failure via yet unknown mechanisms^3-6. In fatty liver disease, hepatocyte-mediated β-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis are important determinants of net lipid accumulation^7,8. This article will, therefore, focus on hepatocyte isolation, followed by quantification of β-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis.

Numerous methodologies have been developed to interrogate hepatocyte lipid metabolism. Though it is possible to measure metabolism of fat in vivo using stable isotopes^9,10, these methods are costly, and require large numbers of animals. Additionally, the ability to investigate the effect of exogenous chemicals is limited due to the nature of in vivo experimentation. In contrast, the isolation of primary hepatocytes from mouse liver provides an affordable avenue to pursue¹¹. Furthermore, studying hepatocytes in culture allows investigators to study the effects of varying chemicals on lipid processing while circumventing the difficulties of in vivo experimentation. Finally, isolated hepatocytes avoid any confounding from varying genetics since they are derived from the liver of a single animal.

Here we isolate and culture of hepatocytes, and we measure β-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled palmitate. The protocol detailed below is straight forward, effective, and reproducible.

프로토콜

모든 동물 실험은 지역 및 연방 규정에 따라 및 기관 IACUC 및 방사선 안전 관리의 승인을 수행해야한다.

1. 준비

1. 몇 일 전에 분석에, 간 다이제스트 중간 (LDM)의 500㎖의 병을 해동하고 50 ML 원뿔 튜브 ~ 35 mL를 분취을 재 냉동. 필요할 때까지 -20 ℃에서 보관하십시오.
2. 어느 날 이전의 분석에, 오토 클레이브에 의해 깨끗한 해부 도구를 미리 소독.
3. 분석 당일, 콜라겐 24- 웰 배양 플레이트의 필요량을 치료.
   1. PBS의 50 부를 3 ㎎ / ㎖ 래트 꼬리 콜라겐 1 부를 섞는다. 24 웰 플레이트의 각 웰에 약 500 μl를 추가하고 실온에서 3 ~ 5 분 (RT) 동안 품어. 콜라겐을 제거하고 판은 후드에서 공기 건조 할 수 있습니다. 적어도 하나의 추가 시간을 반복합니다.
      참고 : 콜라겐 코팅이 광고에 일주까지 수행 할 수 있습니다밴스와 플레이트는 플라스틱 포장에 밀​​봉 4 ℃에서 보관.
4. 37 ° C로 해동 LDM 및 따뜻하고 1 N KOH를 사용하여 7.4으로 산도를 조정합니다 분석을 위해 LDM을 준비합니다. 순환 42 ° C의 물을 욕조에 0.2 μm의 주사기 필터와 장소를 사용하여 필터.
5. 물 목욕을 순환 42 ° C까지 간 관류 중간의 따뜻한 25 ml의.
6. 폴리 비닐 피 롤리 돈의 용액으로 코팅 90 % 콜로 이달 실리카를 준비 : 폴리 비닐 피 롤리 돈으로 코팅 된 콜로 이달 실리카의 9 ml의 10 배 DPBS의 1 ML을 추가합니다. 0.1 N 염산을 사용하여 pH 7.4까지를 조정합니다. 멸균 0.2 μm의 주사기 필터로 필터링. 실온에서 보관하십시오.
7. 37 ° C의 따뜻한 도금 중간.

기본 마우스 간세포 2. 분리

1. 연동 펌프, 튜브 및 해부 테이블을 설정 : 멸균 물 10ml에 의해 증류수에 5 ml의 70 % 에탄올로 세척하여 튜브를 소독. 채우기 위해 간 관류 중간에 튜브 및 실행 펌프를 배치튜브의 전체 길이.
2. 제도적으로 승인 된 방법으로 마우스를 희생.
3. 복강을 오픈 해부 : 70 % 에탄올로 자유롭게 마우스 복부를 스프레이. 무딘 엔드 가위를 사용하여 진피를 통해 복부의 길이를 중간 선 절개를하고 옆으로 반영합니다. 내장을 노출 복막에 비슷한 절개를합니다.
   1. 부드럽게 장을 대체, 둔기를 사용하면 복부 혈관이 복부 하대 정맥 (IVC)을 찾아 신장 정맥에 말초 혈관 아래에 봉합을 배치 노출
4. 말초 봉합사로 봉합의 수준을 넘어 그것을 발전, IVC에 바늘과 카테터를 배치합니다. 아직도 그 자리에 바늘로, 제자리에 고정하기 위해 카테터 주위의 봉합을 묶어. 조심스럽게 바늘을 제거합니다. 경우는 카테터를 통해 흐름을 제대로 혈액을 수행.
5. 피펫을 사용하여, 보장, 관류 매체와 카테터의 나머지 영역을 채우아무 공기는 존재하지 않는다. 큰 관심과 함께, 카테터에 튜브를 연결합니다.
6. 폐의 구멍을 개방 해부 : 부드럽게 다이어프램을 노출 우수한 간 로브를 반영합니다. 조심스럽게 다음, 날카로운 팁 가위로 진동판에 구멍 담낭 및 흉막 혈관을 피하기 위해주의하면서, 흉강을 노출하는 측면 절개를합니다. 간정맥 단지 근위 흉부 하대 정맥 주위 불독 클램프를 놓습니다.
7. 포털 정맥을 잘라 3에서 펌프를 켜십시오 - / 분 4 ml의. 관류 매체의 약 20 ㎖을 사용하여 5 분 간 관류 매체 간을 관류.
   참고 : 간은 즉시 갈색 / 회색 빨간색에서 변경해야합니다. 간 부를 레드 남아 있으면,이 가능성이 불량한 관류를 나타내며, 성공적인 분리의 가능성이 크게 감소된다. 관류하는 동안 밖으로 실행되지 않습니다 매체를 보장하기 위해주의와 기포가 튜브를 입력 없다.
8. 5 분 배양을 따르면, 중지펌프 및 간 다이제스트 중간에 튜브를 전송합니다. (매체가 소진 될 때까지) 15 분 - 펌프를 다시 시작하고 또 다른 10 간을 관류.
9. 관류 펌프를 멈춘다. 간은 분홍빛이 도는 색상이 다소 확대 나타납니다. 주의 절개하여 간을 절제. 담낭을 제거하고 10cm 조직 배양 접시에 간장을 전송합니다.
10. 바이오 안전성 캐비닛에서 간으로 도금 중간 10 ㎖ (표 1)를 추가합니다. 조심스럽게 간세포를 제거하거나 집게 또는 메스를 사용하여 간을 긁어. 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 100 ㎛ 세포 스트레이너 및 전달을 이용하여 현탁액을 필터. 50 ML 원뿔 튜브에 추가로 10 도금 중간 ㎖의 풀과 접시를 씻으십시오.
11. 350 XG, 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리하여 세포 펠렛.
12. 90 % 콜로이드 실리카 10ml를 PO 코팅 대기음 매체 도금 10 ml의 배지에 재현 탁 펠릿 및 추가lyvinylpyrrolidone. 단계 2.11에서와 같이 부드럽게 원심 분리기 섞는다. 생균이 아래쪽으로 펠렛 것이다 동안 원심 분리 후, 사균의 층은, 혼합물의 상부에 부유한다.
13. 기음 죽은 세포와 매체. 도금 중간, 2.11에서와 같이 원심 분리기 20 ㎖로 2 회 반복한다.
14. 도금 중간 10ml에 재현 탁 세포. 혈구와 세포를 계산하고 콜라겐 처리 된 24 웰 배양 접시에 9 × ¹⁰⁴ 세포 / 웰 놓습니다. 2 시간 동안 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 품어. 각 플레이트는 지방산 산화 분석 OR 지방 생성 분석법 중 하나에 사용될 수있다.
15. 선택적으로, 37 ° C에서 유지 보수 매체 (표 1)과 문화에 우물을 변경합니다. 분석 결과에 영향을주지 않으면 서 3 일 - 2 세포를 배양 할 수있다.

3. 지방산 산화 분석

경고 : 방사능의 사용은 위험 할 수 있습니다. 모든 구매, 저장, 취급, 및 디방사성 물질의 폐기에이 기관, 주, 연방 정부의 규정 및 지침에 따라 수행되어야한다.

1. 16-20 시간 이전에 분석에, 따뜻한 PBS로 세포를 2 회 반복한다. 20 나노 글루카곤과 혈청 혈청 기아 중간 (표 1)에 세포를 변경하고 하룻밤에 37 ° C를 품어.
   참고 : 소 태아 혈청이 신진 대사 호르몬의 알 수없는 농도 (예를 들면 인슐린, 글루카곤)가 포함되어 있기 때문에, 혈청이 분석에 가질 수있는 혼란 효과를 제거하기 위해 세포를 굶어. 세포는> 24 시간 동안 혈청 기아 배지에서 생존이다. 글루카곤 처리는 간세포에서 지방산 산화를 자극하는 데 사용된다.
2. 분석의 아침, 사전 인큐베이션 미디어를 준비 : 10 분 동안 70 ℃로 100 mM의 용액 및 열을 초순수 팔미틴산 나트륨 적당량 재현 탁. 한편, 필요한 양 (24- 웰 플레이트의 웰 당 0.5 ml)로 준비25 mM의 HEPES, 1 % BSA 분수 V, 20 nM의 글루카곤과 DMEM의. 37 ° C까지 가열한다.
   1. 가용화 후, 배지를 250 μM의 최종 농도 팔미 테이트를 추가한다. 중간 배양을 사전 2 시간 동안 37 ° C에서 부화하는 간세포를 변경합니다. 나중에 사용하기 위해 37 ° C에서 일부 사전 부화 매체를 보유합니다.
3. 배양 중에, 질소 가스 하에서 증발에 의해 ¹⁴ C-팔미틴산 적당량 (0.5 μCi를 / 웰)을 건조.
   1. 예를 들어, 24 웰 플레이트에 24 샘플을 측정하는 1.5 ㎖의 튜브에 0.1 μCi를 / ml의 ¹⁴ C-팔미틴산 120 μL를 전송. 천천히 흄 후드 3-5 cm의 거리에서 솔루션을 통해 질소 가스를 불어 에탄올 용매를 증발. 상기 튜브의 하단에 건식 ¹⁴ C-팔미두고 40 분 - 용매 약 30 증발한다.
4. 약 15 분의 배양이 종료되기 전에, ¹⁴ 재현 탁0.1 N 수산화 나트륨의 C-팔미 테이트 (12.5 μL / μCi를). 10 분 동안 70 ℃에서 배양한다. 따뜻한 사전 부화 중간의 세 권을 추가로 pipetting 아래로 섞는다.
5. 희석 ⁽¹⁴⁾ C-팔미 테이트의 25 μL 잘 각 스파이크. 부드럽게 판을 흔들어 혼합하고 90 분 동안 37 ° C에서 품어. 이것은 분석 플레이트이다.
6. 배양하는 동안, 필터 종이 접시 (그림 1)을 준비합니다.
   1. 멸균 24 웰 플레이트에서 커버를 제거합니다. 각 웰의 바닥에 종이 필터 중 하나 2cm X 2cm 조각을 놓습니다. 4 "X 7"파라 필름의 조각으로 접시를 오버레이.
   2. 이러한 micropipettor 팁 박스로, 큰 직사각형의 물체를 사용하여, 웰 구멍에 관통하고 파라 필름을 플레이트의 나머지 위에 시일을 만들 웰에 파라 필름을 발라. 이제 우물을 덮고 파라 필름의 천공 원을 제거합니다. 플레이트는 지금 단단히 잘 O를 제외한 모든 지역에서 파라 필름으로 덮여해야한다penings.
7. 10 분 배양이 끝나기 전에, 여과지 모든 액체를 흡수 확인한 여과지 플레이트의 각 웰을 3 N NaOH를 200 μL를 추가한다.
   1. 동결에 선택적으로 이전, 새로운 24 웰 플레이트에 매체를 전송합니다. PBS로 한번 세척 한 후, 0.1 N 염산의 나머지 세포 용균 및 BCA 분석으로 단백질 함량을 계산한다.
8. 인큐베이션의 끝에, 액체 질소에서 플레이트 분석법 스냅 동결. 완전히 진행하기 전에 동결은 물론 각 보장하기 위해주의해야합니다.
9. 분석 플레이트의 각 웰에 70 % 과염소산 100 ㎕를 추가한다. 즉시 필터 종이 접시 커버. 2 시간 동안 실온에서 80 RPM의 궤도 속도로 궤도 흔드는과 바위에 판을 놓습니다.
10. 배양 후, 샘플 처리 :
    1. 섬광에 4 ㎖의 액체 섬광 유체 여과지 사각형을 전송, CO ₂ 분획을 측정유리 병 및 측정 ⁽¹⁴⁾ C 신호.
    2. , 산 용해성 물질을 측정 1.5 mL의 미세 원심 분리 튜브에 매체의 400 μl를 전송합니다. 10 분 동안 최대 속도로 원심 분리기. 간단히 1 클로로포름 - 메탄올 (V / V)와 소용돌이 : 2의 500 μL에 상층 액 100 μl를 추가합니다.
       1. 다시 혼합물에 물을 250 μl를 추가하고, 소용돌이. 3,000 X g에서 10 분 동안 원심 분리기 샘플. 전사 섬광 바이알에 4 ㎖의 액체 섬광 유체 상에 상부 200 ㎕의 ¹⁴ 및 C 신호를 측정한다.

4. 지방 생성 분석

1. 저녁 전에 분석을 시작으로, 따뜻한 PBS로 세포를 2 회 반복한다. 100 nM의 인슐린과 혈청 기아 중간에 간세포를 변경합니다. 37 ° C에서 밤새 품어.
   참고 : 소 태아 혈청이 신진 대사 호르몬의 알 수없는 농도 (예를 들면 인슐린가 포함되어 있기 때문에, 글루카곤을), 혈청이 검정에 가질 수있는 교란의 효과를 제거하기 위해 세포를 굶. 세포는> 24 시간 동안 혈청 기아 배지에서 생존이다. 인슐린 지방 형성을 촉진하기 위해이 분석에서 사용된다.
2. 100 nM의 인슐린, 10 μm의 차가운 아세테이트 0.5 μCi를 ³ H-아세테이트 당 잘 혈청 기아 매체 : 지방 생성 중간합니다. 지방 생성 중간에 세포를 변경하고 2 시간 동안 37 ° C에서 품어. 관심의 화합물을 테스트 할 포함합니다.
3. 잠복기 후, PBS로 세포를 2 회 반복한다. 0.1 N 염산 120 μL에 긁어를 Lyse 세포. 보호구 10 단백질 분석 용 μL (BCA 분석으로 평가) 및 전송 1.5ml의 미세 원심 분리 튜브에 100 μL.
4. (2) 500 μL를 첨가하여 추출 지질 : 1 클로로포름 - 메탄올 (v / v)로. 소용돌이는 간단히 5 분 동안 실온에서 품어. 물, 소용돌이의 250 μl를 추가하고 추가로 5 분 동안 실온에서 품어. 샘플을 원심 분리기 3000 XG, RT에서 10 분. 주의하여섬광 유리 병에 4 ml의 액체 섬광 유체에 낮은 위상을 전송하고 ³ H 활성을 측정한다.

결과

3 × 10 ⁷ 총 세포 - 간세포 아이솔레이션는 일반적으로 1을 초래한다. 밤새 배양 한 후, 세포는 (그림 2) 이핵됩니다 많은 육각형를 나타납니다. 건강한 세포는 세포 죽음을 나타내는 있습니다 과립 또는 소포,없는해야한다.

일반적으로, 지방산 산화 분석은 시험 화합물 당 ​​3-4 회 반복 실행됩니다. CO ₂ 샘플 카운트 산 용해성 물질 유래의 약 1/5이...

토론

관류에 희생에서 시간은 이상적인 관류 및 간 콜라게나 소화 미만 3 분이어야합니다. 관류 매체 관류가 시작되면, 간은 즉시 빨간색은 엷은에서에 모양을 변경해야합니다. LDM과 부화의 약 10 분 후, 간은 부어 핑크 나타납니다. 관류이 불충분하다는 경우, 간은 이러한 변화를 나타내지 않으며, 이는 일반적으로 낮은 수율 간세포 초래할 것이다.

세척 단계 후, 절연 간세포 전에...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Liver Perfusion Medium	Life Technologies	17701038
Liver Digest Medium	Life Technologies	17703034	Aliquot and store at -20 °C
PBS	Corning	21-040-CV
10X DPBS	Corning	46-013-CM
DMEM	Corning	10-017-CV
FBS	Life Technologies	26140079
Collagen	Life Technologies	A1048301
Colloidal silica coated with polyvinylpyrrolidone	GE Life Sciences	17-0891-01
Sodium Pyruvate	Cellgro	25-000-CI
Penicillin / Streptomycin	Cellgro	30-001-CI
Insulin	Sigma	I0516-5ML
Dexamethasone	Sigma	D2915-100MG
Albumin (BSA), Fraction V	MP Biomedicals	103703
24-Well Culture Dish	Corning Falcon	353047
Tygon S3 Tubing	Cole Parmer	06460-34
Male Leur Lock to 200 Barb Connectors	Cole Parmer	45518-00
24 G x 3/4" Catheter	SurFlo	SROX2419CA
Perma-Hand Silk Suture	Ethicon	683G
Cell Strainer	Corning Falcon	08-771-2
IsoTemp 3013HD Recirculating Water Bath	Fisher	13-874-3
MasterFlex C/L Peristaltic Pump	MasterFlex	HV-77122-24
Microclamp	Roboz	RS-7438	Pre-sterilize in autoclave
5” Straight, Blunt-Blunt Operating Scissors	Roboz	RS-6810	Pre-sterilize in autoclave
24 mm Blade Straight, Sharp-point Microdissecting Scissors	Roboz	RS-5912	Pre-sterilize in autoclave
4” 0.8 mm Tip Microdissecting Forceps	Roboz	RS-5130	Pre-sterilize in autoclave
4” 0.8 mm Tip Full Curve Microdissecting Forceps	Roboz	RS-5137	Pre-sterilize in autoclave
60 ml Syringe	Becton Dickinson	309653
50 ml conical tubes	Corning Falcon	352070
BCA Protein Assay	Thermo Scientific	23225
Biosafety Cabinet
CO2 Incubator
Serological pipets
1,000, 200, 20 μl pipet and tips