생체 분자 시간적으로 방출 제어용 고분자 전해질 계면 섬유의 복합 공사장 공중 발판

요약

Scaffolds for tissue engineering need to recapitulate the complex biochemical and biophysical microenvironment of the cellular niche. Here, we show the use of interfacial polyelectrolyte complexation fibers as a platform to create composite, multi-component polymeric scaffolds with sustained biochemical release.

초록

Various scaffolds used in tissue engineering require a controlled biochemical environment to mimic the physiological cell niche. Interfacial polyelectrolyte complexation (IPC) fibers can be used for controlled delivery of various biological agents such as small molecule drugs, cells, proteins and growth factors. The simplicity of the methodology in making IPC fibers gives flexibility in its application for controlled biomolecule delivery. Here, we describe a method of incorporating IPC fibers into two different polymeric scaffolds, hydrophilic polysaccharide and hydrophobic polycaprolactone, to create a multi-component composite scaffold. We showed that IPC fibers can be easily embedded into these polymeric structures, enhancing the capability for sustained release and improved preservation of biomolecules. We also created a composite polymeric scaffold with topographical cues and sustained biochemical release that can have synergistic effects on cell behavior. Composite polymeric scaffolds with IPC fibers represent a novel and simple method of recreating the cellular niche.

서문

The extracellular matrix has inherent biochemical and biophysical cues that direct cell behaviors. Mimicking this physiological three-dimensional (3D) microenvironment is a widely explored strategy for regenerative medicine and tissue engineering applications. For example, both naturally-derived and synthetic substrates have been modified with topographical cues as a means to mimic the biophysical cellular environment.¹ For example, polycaprolactone (PCL) scaffolds can be easily patterned by casting on patterned PDMS substrates.² However, most synthetic scaffolds inadequately recapitulate the controlled biochemical environment in vivo. Bulk or surface modification of synthetic materials only present biochemical cues for cell attachment but still lack temporal regulation of biochemical delivery.³ Thus, there is a need for optimal scaffolds that can mimic the temporally regulated biochemical delivery system of the extracellular matrix.

Biochemical delivery systems such as microspheres are plagued by problems of loss of bioactivity and low incorporation efficiency due to the severity and complexity of multi-step synthesis process.^4-6 Alternative methods that use a one-step fabrication and incorporation method were proven to have excellent potential to create a favorable biochemical microenvironment without the accompanying inefficiency in incorporation and loss of bioactivity. One viable solution is the use of interfacial polyelectrolyte complexation (IPC) fibers to deliver and protect biological agents. When two oppositely charged polyelectrolyte aqueous solutions are brought together, IPC fibers can be drawn out from the interface. Virtually any type of hydrophlic biomolecule in aqueous solution can be added into either the negatively- or positively-charged polyelectrolyte solution, thus facilitating the incorporation of useful biomolecules into the IPC fiber during the complexation process. Furthermore, this process only requires aqueous and ambient conditions, thereby decreasing the risk of loss of bioactivity. Using this method, active growth factors^2,7 even cells^8,9 have been successfully delivered. In addition, the simple method of forming IPC fibers allows molding into any shape or orientation. The stability of such fibers has been advantageous in its incorporation into both hydrophobic² and hydrophilic polymers⁷ to create composite scaffolds. These composite scaffolds with IPC fibers are beneficial for creating a physiologically relevant biochemical environment while providing physical anchorage for cells.

In this study, we show a method to incorporate IPC fibers into a hydrophilic and a hydrophobic scaffold with topography for controlled release of active biomolecules. As a proof-of-concept, we incorporate IPC fibers made from chitosan and alginate into the biocompatible, non-immunogenic and non-antigenic pullulan-dextran hydrophilic hydrogel or the biocompatible polycaprolactone hydrophobic scaffold.

프로토콜

고분자 전해질 솔루션 1. 준비

1. 리아 외에서 설명하는대로, 키토산을 정제. 간략하게, 1 %를 만드는 2 % 키토산 용액 (/ V W) (v / v) 아세트산 함유하고, 진공 필터 (93)가 급 여과지. pH가 10 분 동안 1,200 XG에서 7 원심 침전 된 키토산에 안정화 될 때까지 5M 수산화 나트륨을 사용하여 여과 액을 중화. 뜨는을 가만히 따르다 및 키토산을 씻어 탈 이온수를 추가합니다. 원심 분리 및 세척 단계를 두 번 더 반복합니다. 정제 된 형태를 얻기 위해 -80 ° C 및 동결 건조 O / N에서 석출 키토산 동결. 제습 캐비닛에 정제 된 키토산을 저장합니다.
2. 무균 조직 배양 접시에 정제 키토산 1g을 달아. 생물학적 안전 캐비넷의 UV 램프에 최대한 가깝게 조직 배양 접시에 키토산을 넣고 15 분 동안 UV 광에 노출. 무균 핀셋을 사용하여, 유리 용기에 멸균 키토산 놓는다. 용해 키토산은 0 필터링 사용.0.5 %와 1 % 사이의 최종 농도 15M 아세트산 (W / V).
3. 알긴산 나트륨 0.1 g을 칭량하고 (w / v)의 용액을 1 %를 얻기 위해 탈 (DDI)의 증류수 10ml에 녹인다. 완전한 용해를 보장하기 위해 볼텍스 혼합기에서 적어도 2 시간 동안 알긴산 나트륨 염을 섞는다. 0.2 μm의 주사기 필터를 통해 알지네이트 용액 필터. 4 ° C에서 알지네이트 솔루션을 저장합니다.
4. 제조자가 권장하는 신경 성장 인자 (NGF), - 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 또는 베타 인간 재조합 성장 인자 재구성.

IPC 섬유 2. 도면

1. 유사한 순 전하를 갖는 고분자 전해질 용액의 10 내지 20 μL의 분취 액으로 단백질, 성장 인자 또는 다른 생물 분자를 섞는다. 순 음전하 (예, 소 혈청 알부민 [BSA])와 생물학적 분자 알지네이트 용액을 혼합한다. 양전하 (예 : VEGF)와 생물 분자와 혼합되어야키토산 솔루션입니다.
2. 파라 필름으로 덮여 안정된 평평한 표면에 키토산 및 알긴산의 작은 분취 량 (10 ~ 20 μL)를 놓습니다. 키토산 및 알긴산 액 근접 배치 아니라 서로 접촉한다.
3. 가볍게 키토산과 알긴산 방울에 집게 한 쌍의 각 끝을 찍어. 함께 집게 곤란하여 고분자 전해질의 방울을 가져와. 물방울이 서로 접촉 할 때, 서서히 두 방울 (도 1a)의 인터페이스에서 IPC 섬유 그릴 수직 상방 집게를 당긴다.
4. 이러한주의 깊게 회전 맨드릴 상에 부착되어 플랫 고분자 담체로 집 전체에 겸자에 그려진 IPC 섬유의 단부를 배치했다 (제 3 및 4 참조). 유니폼과 IPC 섬유 beadless 형성 할 수 있도록 10mm / sec의 고정 된 속도로 맨드릴을 돌립니다. Incorporated의 버스트 방출을 일으킬 것이다 비드를 형성 할 것이다 IPC 섬유 드로잉 속도를 증가생화학 및 조기 섬유 종료. ⁽¹⁰⁾
5. 통합의 효율성을 결정하기 위해, 남아있는 모든 액체가 1X 인산염 완충 생리 식염수 500 μL (PBS)으로 희석하여 파라 필름에 남아 수집합니다. BCA의 (BSA에 대한) 분석 (VEGF 및 NGF의 경우) 또는 ELISA 혼입 생체 분자를 검출하기 위해 적절한 분석을 통해 잔사 중의 단백질 또는 성장 인자의 함유량을 측정한다.

복합 하이드로 겔 풀루 란 - 덱스 트란의 비계 (PD) 다당류 및 IPC 섬유 3. 제작

1. IPC 섬유 수집을 위해 희생 풀루 란 프레임 제조
   1. 풀루 란 다당류를 달아 (W / V) 수용액을 20 %를 만드는 증류 탈 (DDI) 물과 혼합. 균일 성을 보장하기 위해 풀루 란 솔루션 O / N을 섞는다.
   2. 10cm 직경의 조직 문화 폴리스티렌 (FPC 기판) 접시에 풀루 란 용액 15g 캐스트. 37 ° C에서 풀루 란 솔루션 O / N을 건조. 7에 풀루 란 영화를 잘라MM은 7mm 사각 프레임을 X.
2. 풀루 덱스 트란 폴리 사카 라이드 용액을 제조
   1. 30 %를 만들기 다당류의 솔루션 풀루 란과 덱스 트란 (/ V W) : DDI 물 (3 1 비율). 폴리 사카 라이드 용액의 균질성을 확인하기 위해 O / N 섞는다. 천천히 20 %의 최종 농도를 달성하기 위해 다당류 용액에 중탄산 나트륨으로 추가 (W / V). 용액의 균일 성을 보장하기 위해 O / N을 섞는다. 4 ° C에서 다당류 솔루션을 저장합니다.
3. 풀루 란 프레임 IPC 섬유를 수집
   1. 악어 클립을 사용하여 희생 풀루 란 프레임 (3.1)를 붙입니다. 플라스틱 코팅 된 접착 테이프를 사용하여 회전 맨드릴의 끝에 악어 클립 및 풀루 란 프레임을 스틱. 10mm / sec의 일정한 속도로 부착 된 프레임 맨드릴을 돌립니다. 풀루 프레임은 원하는 방향으로 회전 맨드릴 상에 부착 될 수있다.
4. 집게 쌍 (1 절)와 ATTAC을 사용하여 IPC 섬유 그리기H 회전 풀루 란 프레임 상에 IPC 섬유의 그린 끝. 일정 속도로 IPC 섬유를 그린다. IPC 섬유의 말단부에 도달 한 후, RT에서 N / 섬유 - 온 - 프레임 구조의 O를 건조.
5. PD 하이드로 겔 지지체에 IPC 섬유의 포함
6. . (/ V W) 나트륨 수용액 및 100 μL의 10M 수산화 나트륨을 트리 메타 11 %, 100 ㎕를 추가 풀루 덱스 트란 용액의 각 그램 가교 ⁷ 1 ~ 2 분 동안 stirplate를 이용하여 60 rpm으로 용액을 혼합하기. 트리 메타 포스페이트 나트륨과 수산화 나트륨을 첨가 한 후, 폴리 사카 라이드 용액을 거의 즉시 가교 것이다. IPC 섬유를 완전히를 포함하는 섬유 - 온 - 프레임 구조에 점성 다당류 용액을 붓고. 화학적으로 가교 결합 된 복합체 지지체 (도 1b)를 형성하기 위해 30 분 동안 60 ° C에 결합 된 덱스 트란, 풀루 란 - IPC 섬유 (PD-IPC)를 부화.
7. 주의 : 흄 후드 단계 3.3.2을 수행하고 적절한 보호 동등를 사용아세트산 등의 pment 부식성 및 인화성이다.
8. PD-IPC 지지체의 기공 형성을 유도하기 위하여, 20 분에 20 % (w / v)의 아세트산 전체 골격 잠수함.
9. 100 rpm으로 흔들어 섞으면 서 5 분간 1X PBS에 세척 PD-IPC 골격에 의해 미 반응 시약을 제거합니다. 이 단계를 2 번 반복합니다.
10. 초과 PBS를 제거하고 즉시 -80 ° CO / N의 PD-IPC 발판을 동결. 비계 어떤 제어 방출 또는 생체 활성 분석에 사용하기 전에 적어도 24 시간을 동결 건조.

PCL 및 IPC 섬유의 복합 비계 4. 제작

주의 : 디클로로 메탄은 위험한 물질이다. 디클로로 메탄을 처리 할 때 흄 후드 및 개인 보호 장비를 사용합니다.

1. 깨끗한과 패턴 PDMS 기판 만들기
   1. 소프트 리소그래피 공정을 이용하여 원하는 치수의 FPC 기판의 일부를 사용하여 깨끗한 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 탄성 기판 만든다. patte 만들기원하는 템플릿 지형 폴리 (메틸 메타 크릴 레이트)에 표준 소프트 리소그래피 방법을 사용하여 rned PDMS 기판. ⁽¹²⁾
2. IPC 섬유 수집을 위해 희생 PCL 프레임 제조
   1. PCL을 달아 (W / V) 솔루션을 0.9 %를 만들 디클로로 메탄에 용해. PDMS 기판의 모든 1cm ² 지역의 경우, 0.9 % PCL 용액 500 μl를 놓습니다. 완전히 흄 후드에서 증발 디클로로 메탄 용매를 모두 허용합니다. 원하는 두께로 필름을 두껍게 0.9 % PCL 주조의 과정을 반복합니다. PDMS 기판에서 건조 PCL 필름을 제거합니다. 적절한 크기의 구멍을 뚫는을 사용하여 PCL 프레임에 구멍을 만듭니다. ⁽²⁾
3. PCL 프레임 IPC 섬유를 수집
   1. 악어 클립 (4.2.1)에서 구멍 희생 PCL 프레임을 부착합니다. 플라스틱 코팅 된 접착 테이프를 사용하여 회전 맨드릴에 악어 클립 스틱. PCL의 FRAM에 IPC 섬유의 그린 끝을 연결합니다10mm / 초 (제 2)의 일정 속도로 회전을 시작하기 전에 전자. IPC 섬유 드로잉 종료 후, 섬유에 프레임 구조의 O / N에서 4 ℃에서 건조.
4. 섬유에 프레임이 패턴 PCL 기판으로 구성 퍼가기
   1. 필요에 따라, 깨끗한 또는 패턴 PCL 기반을 만들기 위해 PDMS 기판에 0.9 % PCL 용액 500 μl를 삭제합니다. 원하는 두께와 발판을 얻었다 0.9 % PCL 용액 다층 캐스트. 완전히 흄 후드에서 증발 디클로로 메탄 용매를 모두 허용합니다.
   2. PCL베이스의 상단에있는 섬유에 프레임 구조 (섹션 4.3.1)을 놓습니다. 원하는 두께를 얻기 위해 섬유의 프레임 구성을 여러 번에 0.9 % PCL 솔루션을 추가하고 완전히 PCL-IPC 복합 지지체 (그림 1C을) 제조, IPC 섬유를 포함.

복합 IPC 공사장 공중 발판에서 생물학 작용제의 릴리스 5. 측정

1. 배치 합성 PD IPC-또는PCL-IPC 골격 및 독립 실행 형 IPC 섬유를 별도로 24 웰 플레이트에.
2. 발판을 담그고 독립형 IPC 섬유를 1X PBS 500 μL와 함께. 37 ° C에서 샘플을 품어. 다양한 시점 (릴리스 미디어)에서 PBS를 수집하고 1X PBS 500 μL로 교체합니다.
3. 통합 생체 분자 누적 방출 프로파일을 계산하는 BCA 분석 (BSA), ELISA (VEGF 및 NGF) 또는 다른 적절한 분석을 이용하여 분리 배지에서 단백질 또는 증식 인자의 양을 측정한다.

합성 IPC 공사장 공중 발판에서 세포의 6. 시드 출시 생물 제의 생체 활성 테스트하는

1. 적어도 20 분 동안 생물학적 안전 캐비넷에 UV 광을 사용하여 동결 건조 PD-IPC 또는 PCL-IPC 복합 지지체 멸균.
2. 200 ㎕의 성장 배지에 2 × ¹⁰⁵ 세포의 세포 현탁액을 수득 표준 세포 배양 기술을 사용한다. 복합체 지지체 상 농축 세포 현탁액을 시드. AfteR 20 분, 완전히 비계 잠수함하는 성장 미디어의 최고 최대 볼륨을 설정합니다.
3. 이러한하는, Alamar 블루 대사 활동 분석, PC12의 신경 돌기 가지 분석 또는 면역와 같은 표준 기술을 통해 세포 활성을 측정합니다.

결과

이 글에서, 우리는 다양한 생체 분자의 서방에 대한 IPC 섬유와 복합 발판을 만드는 노력했다. 본 연구에서 사용 된 생체 분자의 특성을 표 1에서 발견된다. IPC 섬유는 제 PD-IPC 복합체 지지체 (도 1B)를 만들기 위해 PD 친수성 하이드로 겔에 포함 하였다. 모델 분자 BSA 먼저 제어 생체 릴리스 복합체 지지체를 사용하는 타당성을 결정하기 위하여 시험 하였다. BSA는 45 ± 0.97 %의...

토론

IPC 섬유 개의 반대로 대전 된 고분자 전해질의 상호 작용에 의해 형성된다. 프로세스는 안정된 섬유 형성을위한 자기 조립 공정을 용이하게 고분자 전해질의 계면에서의 복잡한 추출을 이용한다. IPC 섬유 형성의 메카니즘은 유사 대전이 고분자 전해질 복합체 과정에서 혼입 될 수있는 생리 활성 물질로 첨가되도록. ^10,11는 반대로, 반대로 대전 된 고분자 전해질로 생리 활성 물질의 첨가?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pullulan	Hayashibara Inc Okayama Japan		Molecular weight (MW) 200 kDa. This material is pharmaceutical grade pullulan used to make pullulan frames and PD-IPC scaffolds.
Dextran	Sigma Aldrich	D1037	MW 500 kDa. This material is no longer being produced by Sigma Aldrich. Alternative suggested is catalog number 31392 (Sigma Aldrich). This material is used to make PD-IPC scaffolds.
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761	Sodium bicarbonate must be slowly added to the pullulan-dextran polysaccharide solution. Rapid addition of sodium bicarbonate will result in precipitation.
Sodium Trimetaphosphate	Sigma Aldrich	T5508	This chemical is hygroscopic and must be stored in the dehumidifying cabinet. Aqueous solution of sodium trimetaphosphate must always be made fresh.
Sodium Hydroxide	Sigma Aldrich	S5881	This material is hazardous and must be handled with proper protective equipment such as nitrile gloves.
Chitosan	Sigma Aldrich	448877	MW 190-310 kDa. Acetylation degree of 75% to 85%. Purification of chitosan is required to create stable IPC fibers.
Acetic Acid	Merck		This can be replaced by another brand type. This material is corrosive and flammable. Protective equipment such as face shield, nitrile gloves, lab coat and shoe cover must be worn when handling this chemical in the fume hood.
Alginic acid sodium salt from brown algae, low viscosity	Sigma Aldrich	A2158	Dissolve in water overnight. Filter through sterile 0.2 µm syringe filter before use. Store at 4 °C.
Bovine Serum Albumin	Sinopharm Chemical Reagent		Dissolve in sterile PBS and filter using 0.2 µm syringe filter before use.
BCA assay kit	Pierce	23225	This kit was used to measure BSA release from PD-IPC scaffolds.
Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor	R&D systems	293-VE	Dissolve growth factor in 0.2% heparin solution to a final concentration of 5 mg/ml.
Heparin Sodium Salt From Porcine	Sigma Aldrich	H3393	This can be replaced by another brand type. Dissolve heparin salt in sterile water at a final concentration of 1% and filter through 0.2 µm syringe filter before use.
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)	Lonza	C2517A	This primary cell type was used in the assay to determine VEGF bioactivity after release from PD-IPC scaffolds.
Alamar blue	Life Technologies	DAL1025	This is used to measure cell metabolic activity. Incubate Alamar blue with cells and maintain in standard cell culture conditions for 2 to 4 hours. Measure absorbance at 570 nm to determine Alamar blue percent reduction, which is correlated to the cell activity.
ScanVac Coolsafe Lyophilizer	Labogene	7.001.200.060	This is a non-programmable freeze dryer that operates at -105 to -110 °C. This can be replaced by other standard lab lyophilizers.
Polycaprolactone (PCL)	Sigma Aldrich	181609	MW 65 kDa. This is no longer being manufactured by Sigma Aldrich. This can be replaced by Sigma Aldrich catalog number 704105.
Dichloromethane	Sigma Aldrich	V800151	This can be replaced by another brand type. This material is hazardous and must be handled in the fume hood. Protective equipment must be worn at all times when handling this chemical.
Polydimethylsiloxane (PDMS; 184 Silicone Elastomer Kit)	Dow Corning	(240)4019862	The elastomer kit comes with polymer base and crosslinker. Mixing the polymer base and crosslinker in different ratios will result in different stiffness of the PDMS.
Human Recombinant Beta-Nerve Growth Factor (NGF)	R&D systems	256-GF	Reconstituted in sterile DI water to a final concentration of 100 µg⁠/⁠ml. Aliquot and store in -20 °C until use.
Human Mesenchymal Stem Cells (hMSC)	Cambrex		This cell type was used in the assay to determine synergistic effect of NGF and nanotopography.
Rat PC12 Pheochromocytoma Cells	ATCC		This cell type was used in the neurite outgrowth assay to determine bioactivity of NGF. After exposure to release media with NGF, measure number of cells with neurite extensions and normalize to total number of cells.
Grade 93 filter paper	Whatman	Z699675	This is used for the purification of chitosan after its precipitation with sodium hydroxide at pH 7.
Swing bucket centrifuge	Eppendorf	5810R	To be used during the purification of chitosan using 1,200 x g speed.
Motor with mandrel rotating at constant speed	Rhymebus	RM5E	The motor is used for the fabrication of IPC fibers on pullulan or PCL frame.
Phosphate buffered saline	FirstBase		Sterilize through filtration (0.2 µm filter) and autoclave.
10-mm diameter Tissue Culture Polystyrene Dish (TCPS)	Greiner		The TCPS dish is used for casting of pullulan frame.
Human VEGF ELISA kit	R&D systems	DVE00	The ELISA kit is used for detection of VEGF in the release medium.
Human NGF ELISA kit	R&D systems	DY256	The ELISA kit is used for detection of NGF in the release medium.
Plastic Coated Adhesive Tape	Bel-Art	9040336	The adhesive tape is used to securely stick the alligator clip to the rotating mandrel