마이크로 전극 배열에 3D 엔지니어링의 연결을 문화의 인터페이스 : 혁신을<em&gt; 체외</em&gt; 실험 모델

요약

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

초록

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 µm in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

서문

마이크로 전극 배열 (다자간)에 결합 된 생체 외 2 차원 신경망에서 신경 역학과 기본 연결 사이의 상호 작용을 연구하기 위해 채택 금 표준 실험 모델을 arethe. 개발하는 동안, 신경이 잘 표시 복잡한 네트워크를 다시 definedspatio-temporalpatternsof 활동 ^{1, 2} (즉, 버스트, 네트워크 버스트, 임의의 급상승 활동). MEA의 네트워크 레벨에서 표현의 상세한 역학 조사를 허용 많은 위치에서 (수십 마이크로 전극으로부터 수천) 전기 생리 활성을 기록한다. 또한, 해리 배양의 사용은 설계 - 네트워크를 설계 할 possibile 만든다. 이것은 이런 식으로 이해하기 쉽게 기록 전기 생리 활성 간의 기능적 관계 및 셀 밀도 ^{3, 4, 5의} 모듈화 정도, 이종 신경 팝의 존재 등의 네트워크 조직의 파라미터등 ulations ^{6 그러나,} 배양 된 세포에 해리 된 모든 시험 관내 시험은 2D 신경 네트워크에 기초한다. ⁽⁷⁾ 모든 방향으로 확대 할 수 평탄화되어 2D 모델 인 somata 성장 콘 (I) 및 축색 돌기 - 생장이 방법은 생체 내 (본질적으로 3 차원, 3D) 시스템에 대해 oversimplifications 리드. (II) 2D 체외 네트워크 전시는 네트워크 ^(8)의 신경 세포의 대부분을 포함하는 활동을 파열에 의해 지배 전기 생리 역학에 박힌.

최근, 다른 솔루션은 3D는 신경 네트워크를 해리 체외의 구성을 허용하도록 개발되었다. 일반적인 생각은 신경 세포는 3D 방식으로 성장할 수있는 발판을 만드는 구성되어 있습니다. 이러한 지지체는 고분자 겔 및 고체 다공성 매트릭스 ^9-13로 실현 될 수있다. 중합체의 기계적 특성을 이용함으로써, 내부 살전 세포를 포함 할 수있다neurosphere를 ^11의 3D 문화의 균일 한 블록을 정의하여 전자 구조. 이 방법의 주요 특징은 neurosphere를 ^9,12-의 강성, 기계적 특성이다. 그러나, 이들 물질은 기공률이 제한되어, 그들은 매트릭스 내부 세포 이동을 보장하지 않는다. 이러한 단점을 극복하기 위해, 가능한 해결책은 '단위'모듈로 매트릭스를 슬라이스로 구성되어 있습니다. 불행히도, 입자의 크기 및 형상은 다양 정규 층상 구조로 포장을 방해 할 수있다. ^7에서 컬린과 동료 생리 활성 세포 외 기질 기반의 발판 내에서 뉴런 및 / 또는 성상 세포로 이루어진 3 차원의 연결 구조를 설계했다. 이러한 설계 신경 조직은 3 차원 미세 환경 내에서 신경 생물학적 반응을 연구하고 조작하는 체외 조사에있었습니다. 이 모델은 세포 외 기질 (ECM) 및 / 또는 하이드로 겔 지지체 (500-600 μm의 두께)에 걸쳐 분산 뉴런 및 아교 세포로 구성되었다. 이 공동으로/ mm ³ 5,000 세포 - ndition, 최적의 세포 생존율 (90 % 이상)은 약 3,750의 최종 밀도로 세포를 플레이 팅에 의해 발견되었다. 그러한 밀도 값은 마우스 뇌 피질의 세포 밀도는 약 90,000 세포 / ¹⁴ mm ³ 인 생체 조건에서 하나보다 훨씬 낮다는 것을 주목해야한다. 이러한 제한을 극복 Pautot ^15은 셀 밀도와 네트워크 연결이 네트워크의 실시간 영상을 가능하게하면서 생체 조건에서 비슷하게 제어되는 3D 관내 시스템을 실현 동료에게. 실제로,이 방법은 배양 된 신경 세포는 실리카 마이크로 비드에 성장 할 수있는 해리 개념을 기반으로합니다. 이 구슬을 준수하는 신경 세포 기관 및 성숙, 성장, 확장, 다른 뉴런 시냅스 연락처를 정의하는 그들의 arborizations만큼 큰 성장 표면을 제공한다. 이 방법은 FO하는 단 분산 비드의 자발적인 조립 성질을 이용RM 차원이 다른 구슬에 신경 세포 사이의 제한된 연결과 다른 층에 신경 세포의 고유 한 하위 집합을 포함하는 육각형 배열을 계층. 이 방법으로 달성 세포 밀도는 / mm ³ 약 75,000 세포이었다.

최근에, 우리는 다자간 ¹⁶ Pautot의 방법을 적응 : 얻어진 결과는 3D 전기 생리 활동이 2D 네트워크에 의해 표현 된 것보다 활동의 폭 넓은 레퍼토리를 제시 것으로 나타났다. 3D 성숙한 문화가 향상된 동적을 전시하는 네트워크 버스트 임의 스파이크 활동이 공존하는 모두. 마찬가지로, 탕-Schomer 동료 ¹⁷ 개월 일부 체외에서 일차 피질 배양을 유지 실크 프로테인 계 다공성 지지체를 실현하고, 텅스텐 전극에 의해 전기 생리 활성을 기록했다.

이 연구에서, 실험 절차는 MEA를 결합 3D 신경 네트워크를 구축하는 것이 설명 될 것이다.

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프로토콜

실험 프로토콜은 DL 1,992분의 116에 따라와 제노바 (보호 해주는 대학의 지침에 의해 건강의 이탈리아 교육부 유럽 동물 관리 규정 (63분의 2,010 / EU)에 의해 승인되었다. N. 13130​​, 월 2011). 모든 노력이 프로젝트 동물의 수를 줄이기 위해 자신의 고통을 최소화 하였다.

재료 및 지지대 1. 준비

1. CNC (컴퓨터 수치 제어) 밀링 머신에 의해 PDMS (폴리 디메틸 실록산) 제약 조건을 구축 할 수있는 틀을 구축합니다. 이러한 몰드는 폴리 테트라 플루오로 에틸렌의 중앙 실린더 (PTFE), 폴리 카보네이트로 실현된다. PDMS가 강화되면이 물질은 마스크의 쉽게 추출 할 수 있습니다.
   주 : 주형의 설계는 컴퓨터 지원 설계 (CAD)에 의해 수행하고 CNC 밀링 머신에 전달되었다.
2. PDMS 엘라스토머를 준비합니다. PDMS는 유기 폴리머이다. 그것은 두 가지 요소로 구성되어있다경화제 및 중합체. 1:10 부피비로 섞는다, 경화제의 일부 및 중합체의 아홉 부품. , 페트리 접시에서 두 성분을 넣어 진탕하고 기포를 제거하기 위해 10 분 동안 진공 챔버에서 믹스를 삽입한다. PDMS의 3g 하나의 제약 조건에 대한 충분하다.
3. PDMS 제약을 구축합니다. 성형기에 PDMS 재료를 넣고 120 ℃에서 30 분 동안 오븐에 넣어. PDMS 제약은 각각 22.0 및 3.0 mm의 외부 및 내부 직경 650 ㎛의 높이를 갖는 원통의 이상적인 형상을 갖는다.
4. 도금 하루 전에, 커플 실체 현미경 집게 의해 마이크로 전극 어레이 (다자간)의 활성 영역에 마스크 및 120 ° C의 오븐에서 PDMS 마스크 살균.
5. 원추형 바이알에 2 시간 동안 70 %의 에탄올 및 EV 회전 (42.3 ± 1.1 μm의 평균 직경의 인증을 40 ± 2 ㎛의 공칭 직경) 유리 마이크로 비드를 살균ERY 30 분 모든 마이크로 비드를 노출합니다.
6. 유리 병에서 에탄올 용액을 제거하고 마이크로 비드를 멸균 수로 2 회 씻어.
7. 0.05 ㎍ / ㎖의에 폴리 -D- 라이신과 라미닌 혼합액 24 μL와 (직경이 3.0 mm로 동일) PDMS 마스크로 구분 MEA 영역의 중앙 부분을 컨디셔닝.
8. 코트 0.05 μg의 /에서 접착 단백질, 라미닌 및 폴리 D 라이신과 마이크로 비드 용액과 안정하고 오래 지속되는 신경 네트워크를 획득하기 위해, 37 ℃ 배양기에 밤새두​​고 그들.
9. MEA의 유리 표면으로부터 유리 마이크로 비드에서 모두 접착 인자를 제거한다. 대기음 피펫 코팅 용액의 약 95 % 및 MEA 표면에 멸균의 작은 부피 - 24μl- 적용. 대기음은 다시 95 개 이상의 물 %와 세포를 도금하기 전에 1 시간 동안 층류 후드 아래 MEA 건조를 할 수 있습니다.
   주 : 대신 마이크로 비드의 경우, 코팅 대기음용액 및 뉴런 도금한다 유리 표면을 컨디셔닝하기 위해, 멸균 수와 기본 배지와 같은로서의 B27 보충제와 두 번째 세척으로 제를 만든다. 마이크로 비드가 건조하게하지 마십시오. 유리 병 내부의 배양액에 부유을 남겨주세요.
10. 그들이 균일 한 층을 형성하는 자기 - 조립된다 멤브레인 삽입물 (구멍 직경 0.4 μm의)와 멀티 웰 플레이트에 피펫 -200 μl-, 처리 된 마이크로 비드 현탁액 (약 32,000)을 이용하여, 배포.
11. 매체의 0.5 ml의 멤브레인의 각 웰을 입력하고 인큐베이터에 넣어 (T = 37.0 ^O C, CO ₂ = 5 %) 뉴런 (3.2) 도금 될 준비가 될 때까지.

2. 태아의 해부 및 조직의 해리

1. 일반 명암 일정에 따라 일정한 온도 (22 ± 1 ℃로)과 상대 습도 (50 %)에서 하우스 성인 여성 쥐 (2백~2백50그램) (빛에 오전 7시에서 오후 7시까지)에서동물 시설. 그 음식을 확인하고 물을 자유롭게 사용할 수 있습니다.
2. 3 % 이소 플루 란을 사용하여 개발 십팔일 (E18) 후 임신 여성 쥐를 마취. 그 후, 경부 탈구에 의해 동물을 희생.
3. 각 쥐의 배아에서 해마를 제거하고 ^칼슘과 마그네슘없이 얼음 차가운 행크의 균형 염 용액 ^2+에 배치합니다. 하루에 개발 해마와 피질 조직 (18)는 매우 부드럽고 작은 조각으로 절단 할 필요가 없습니다. 더 자세한 사항은 ^{18, 19을} 찾을 수있다.
4. 37 ℃에서 18-20 분 동안 DNase의 0.05 %를 함유하는 트립신 / 행크 용액의 0.125 %로 조직을 해리.
5. 파스퇴르 피펫으로 상층 액을 제거하고 5 분 동안 10 % 소 태아 혈청 (FBS)와 매체를 첨가하여 효소 소화를 멈춘다.
6. FBS로 배지를 제거하고 그 보충, 1 % L- 글루타민, 10 μg의 겐타 마이신 / ㎖와 배지로 한번 세척 하였다. 파스퇴르 핍 다시 매체를 제거두기가 보충은, 1 % L- 글루타민, 10 μg의 겐타 마이신 / ㎖와 함께 성장 배지의 소량 (500 μL)로 다시 채우고.
7. 세포의 유백색 현탁액 명백한까지 좁은 파스퇴르 피펫 기계적 조직 펠렛을 해리. 이 세포 현탁액을 원심 분리 할 필요가 없다.
8. 2.0 ㎖의 최종 부피를 얻기 위해 생장 배지로 세포 현탁액의 소량 희석. 혈구 챔버와 얻어진 세포의 농도를 계산합니다. / μL 600-700 세포의 원하는 세포 농도를 얻기 위해, 5 : 1에서 이러한 농도를 희석.

3. 셀 도금

1. PDMS 제약 조건에 의해 정의 된 MEA의 활성 영역 상에 약 2,000 세포 / mm ^2의 밀도로 접시 세포는 2D 신경 네트워크를 생성한다.
   참고 : 각 해마는 약 5 × 10 ⁵ 세포를 포함, (하나의 배아에 대한 1 × ^6). 6 × 10의 총량을 얻기 위해 6 배아를 해부하다⁶ 2 ㎖ 중의 세포 및 / μL 3,000 세포의 추정 농도. 원하는 세포 농도를 구하고 약 600-700 세포 / μL 판형 위해 5 : 1에서 이러한 농도를 희석. PDMS 제약으로 구분 MEA 영역은 약 7.065 mm ⁽²⁾ 및 도금 된 세포의 총 수의 경우 600 세포 / μL X 24 μL = 14,400 세포 / mm ² 2,038 세포의 최종 농도.
2. 37 ℃에서 가습 _{이산화탄소} 분위기 (5 %)와 인큐베이터에 MEA 장치를 놓습니다.
3. 삼차원 배양 건설 예비 단계를 완료하기 위해 멀티 웰 플레이트 내부에 위치 된 마이크로 비드 단층의 표면 상 / μL 600-700 세포 (약 100,000 세포)의 세포 농도로 현탁액 160 μl를 배포한다. 37 ℃에서 가습 _{이산화탄소} 분위기 (5 %)로 인큐베이터에서 멀티 웰 플레이트를 넣습니다.

4. 3D 신경 네트워크 구축

1. 6-8 시간 도금 후, 약 30 ~ 40 μL의 볼륨 설정 피펫을 사용하여 PDMS 제약에 의해 구분 된 지역 내에서 매우 신중하게 멀티 웰 플레이트에서 서스펜션 (신경 세포와 마이크로 비드)를 전송합니다. 각 전송 후에, 육각형 컴팩트 한 구조로 자기 조립에 마이크로 비드를 허용, 절반 잠시 기다립니다.
2. 모든 층들이 증착되고 자발적 조립되면, 매체의 약 300 μL PDMS 제약으로 구분 영역의 상부의 큰 방울 리필.
3. 인큐베이터 (T를 = 37.0 ^O C, CO ₂ = 5 %)을 MEA에 연결된 3 차원 구조를 넣어 48 시간 동안 그 보충하여 성장 배지 배양의 최종 부피 (약 1ml)에 추가하기 전에.
   참고 : 막 삽입 (30,000) 및 MEA 장치 (6000) 상에 단일 층에 구슬의 수와 멀티 웰 플레이트에 구슬의 수를 고려한다. 생성 된 3 차원 구조는 MI의 5 층으로 구성되고crobeads 세포. 3D 신경 네트워크는 기하학적으로 완전한 아니라고 고려하여, 결과적인 3D 구조는 5~8 층으로 구성 될 수있다.
4. 날은 도금 후, 조심스럽게 MEA 링 내부의 중간 (약 900 μL)의 최종 부피를 추가합니다. 4~5주 동안 37 ° C에서 CO _2의 가습 분위기 (5 %)의 3 차원 배양을 유지한다. 일주일에 한 번 매체의 절반을 교체합니다.

5. 공 초점 현미경 취득

1. 홀더 현미경의 단계로 생물학적 샘플을 수정합니다. 정확한 대역폭 방출 필터와 순서를 캡처 할 각 이미지에 대한 PMT의 화상, 이득 및 오프셋 (-0.3 %)을 획득하는 레이저 (아르곤 4백96에서 5백55까지 ㎚), 스캔 속도 (400 Hz에서) 설정할 포화를 방지하고 신호대 잡음비를 증가시키기 위해. 결과 섹션은도 4의 이미지를 획득하는 데 사용되는 값을보고한다.
2. Z -stack 순서, 전나무의 취득ST는, 상부 및 샘플의 하부 층의 Z 위치의 값을 선택하고 획득하게 스텝 사이즈를 선택한다.

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결과

.이 실험 절차에서 중요한 역할 3D 신경 네트워크의 성장을위한 기계적 지지체를 정의하는 마이크로 비즈에 의해 재생되는 1a 및 B 화면을 마이크로 비드의 배열 (40 ± 2 ㎛의 공칭 직경도]의 인증 평균 직경 평면에서 42.3 ± 1.1 μm의). 이러한 구조의 특수성은 마이크로 비드가 자발적으로 소형 육각형 형상 (그림 1B 및 C)를 정의하는 자기 조립이다. 이렇게 생성 ?...

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토론

본 연구에서는 3 차원으로 구성 체외 플랫폼에서 새로운 실험 네트워크 전기 생리학에 대한 다자간가 제시되었다 결합의 연결을 문화를 설계. Z 방향을 따라 이동시킴으로써 행한다 신경 염성 생장을 허용하는 지지체로서 마이크로 비드의 사용은 평면 MEA와 일체화되도록 맞추어왔다. 이러한 방식으로, 유효하고 신뢰성있는 시험 관내 3D 모델에서 얻어진 마이크로 시스템 결과...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	0.05 µg/ml
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407	0.05 µg/ml
Trypsin	Gibco	25050-014	0.125% diluted 1:2 in HBSS w\o CA++, MG++
DNAase	Sigma-Aldrich	D5025	0.05% diluted  in Hanks solution
Neurobasal	Gibco Invitrogen	21103049	culture medium
B27	Gibco Invitrogen	17504044	2% medium supplent
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F-2442	10%
Glutamax-I	Gibco	35050038	0.5 mM
gentamicin	Sigma-Aldrich	G.1272	5 mg/L
Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS)	Corning Sigma	481939	curing agent and the polymer
Micro-Electrode Arrays	Multi Channel Systems (MCS)	60MEA200/30-Ti-pr	MEA with: Electrode grid 8x8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread
Microbead	Distrilab-Duke Scientific	9040	1 gr Glass Part. Size Stds 40 µm
Transwell	Costar Sigma	CLS 3413	multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm)
HBSS w\o Ca++ ,Mg++	Gibco Invitrogen	14175-052
Hanks Buffer Solution	Sigma	H8264
Teflon	Sigma	430935-5G	polytetrafluoroethylene
Rat	Sprague Dawley	Wistar Rat
Confocal Microscopy Upright	Leica	TCS SP5 AOBS
20.0x0.50 WATER objective	Leica	Leica HCX APO L U-V-I
40.0x0.80 WATER objective	Leica	Leica HCX APO L U-V-I
25.0x0.95 WATER objective	Leica	HCX IRAPO L