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요약

Targeted cell delivery is useful in a variety of biomedical applications. The goal of this protocol is to use superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) to label cells and thereby enable magnetic cell targeting approaches for a high degree of control over cell delivery and localization.

초록

세포 치료제의 표적 전달이 오프 - 표적 부위에 악영향을 최소화하면서 목표 부위에 치료 효과를 집중하여 의치 광범위한 애플리케이션 혜택 것이다. 자기 세포 타겟팅, 효율적인 안전하고 간단 전달 기술이다. 초상 자성 산화철 나노 입자 (SPION)은 생체 적합성, 생분해 성이며, 자기장에 응답들을 렌더링하기 위해 세포로 endocytosed 수있다. 합성 과정은 마그네타이트 FE (3 O 4)를 생성하는 것을 포함하는 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) (PLGA) 코팅을 형성하는 고속 유화 나노 입자. PLGA-마그네타이트 SPIONs는 약 10 nm의 직경을 포함 마그네타이트 코어 직경이 약 12​​0 나노 미터이다. 문화 매체에 배치 할 때, SPIONs 자연스럽게 세포에 의해 endocytosed 및 세포질 엔도 좀 내 작은 클러스터로 저장됩니다. 이들 입자는 세포에 충분한 질량을 부여 자성자기장 내에서 대상을 허용합니다. 수많은 세포 정렬 및 대상 응용 프로그램은 자기장에 반응하는 다양한 세포 유형을 렌더링하여 사용할 수 있습니다. SPIONs뿐만 아니라 종양 치료 또는 조직 솔더링 로컬 고열증의 의료 영상 조영제로 사용, 표적 유전자 또는 약물 전달, 진단 분석 및 생성을 포함하는 다른 생물 의학 다양한 애플리케이션을 갖는다.

서문

Targeted delivery and capture of cells to specific sites within the body is desirable for a variety of biomedical applications. Delivery of neural stem cells to the brain by MRI-guided focused ultrasound has been proposed as a possible treatment option for neurodegenerative disease, traumatic brain injury, and stroke1. Mesenchymal stem cells are being studied for their ability to deliver anti-cancer drugs to tumors due to their natural tumor-tropic properties2,3. Cardiac stem cells have been delivered to the heart as a possible treatment for myocardial infarction4,5. Vascular stents have been developed with CD34 antibodies to capture circulating progenitor cells6. While promising, these cell targeting approaches present drawbacks including lack of cell specificity, inconsistent cell retention, and off-target cell delivery.

The overall goal of the current method is to enable magnetically directed targeting of cells for a variety of cell delivery and sorting applications. Magnetic targeting allows for controlled delivery of specific cells to a specific target site with minimal off-target effects7. The magnetic fields can be generated by implanted or external devices to safely direct the movement of magnetically-labeled cells within the body8. Numerous research efforts have focused on magnetically directed targeting of stem cells to injured tissues such as the heart9-14, retina15, lung16, skin17, spinal cord18,19, bone20, liver21, and muscle22,23 in order to improve regeneration outcomes.

Magnetic targeting of cells has also been studied extensively as a means to endothelialize implantable cardiovascular devices. A uniform and complete endothelium provides a barrier between the device and circulating blood elements to mitigate thrombosis and inflammation. Endothelial cells can be delivered to the device either prior to implantation or via the vascular system following implantation. In both cases, magnetic fields are used to capture cells to the surface of the device and retain the cells when subjected to the shear stress generated by circulating blood. Magnetic vascular stents24-27 and vascular grafts28 have both been fabricated and tested for this purpose.

Magnetic cell targeting requires a strategy for labeling cells with magnetic carrier particles. These particles can be bound to the surface of cells via antibodies or ligand/receptor pairs or they can be endocytosed into the cells. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) are biodegradable, biocompatible, and readily endocytosed by a variety of cell types29. These particles effectively render a cell responsive to magnetic fields and are naturally degraded over time. SPIONs provide a straightforward and safe means of magnetically labeling cells in culture for a variety of magnetic targeting and sorting applications. A method for synthesizing SPIONs with a magnetite (Fe3O4) core and poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) shell is provided. In addition, a method for labeling cells in culture with SPIONs is provided.

프로토콜

자철광 젤 1. 합성

  1. 에틸 알코올 다음에 탈 이온수 다음에 진한 염산을 사용하여 모든 유리 제품을 씻으십시오. 바람직하게는 건조 오븐에서, O / N을 건조하도록 허용합니다.
    주의! 염산 유해 - 흄 후드에서 개인용 보호 장비는 작업을 착용; 에틸 알코올은 유해한 - 개인 보호 장비를 착용하십시오.
  2. 탈 가스 탈 H 2 O의 500 mL로 부드럽게 30 분 동안 N 2 가스 버블 링에 의해 Dreschel 병을 사용합니다.
  3. 셋업 화학 물질 흄 후드 내에서 자철광 합성 장치.
    1. isomantle 히터 내에 500㎖의 3 구 둥근 바닥 플라스크를 놓고 클램프를 사용하여 중심 목을 고정 및 스탠드.
    2. 환저 플라스크의 목의 측면에 하나의 고무 격막 나머지 측 경부에 고무 격막과 환류 냉각기를 설치한다. 지속적으로 환류 냉각기를 통해 차가운​​ 물을 실행합니다.
    3. 펑크 일E 환저 플라스크의 고무 N 2 가스 라인에 연결된 바늘을 격막과 기포에 실행 가스 라인에 연결된 바늘을 환류 응축기의 고무 격막을 천공 (즉, 물을 플라스크) 가스 유출을 시각화.
    4. 패들 어댑터를 통해 둥근 바닥 플라스크의 중심 목에 블레이드 패를 설치합니다. 스탠드에 장착 된 오버 헤드 교반기에 블레이드 패의 샤프트를 연결합니다.
  4. N 2 가스로 둥근 바닥 플라스크를 제거하고 낮은하지만 검출 속도로 흐르는 N 2 가스를 둡니다.
  5. 둥근 바닥 플라스크에서 환류 응축기를 제거하고, 철 (III) 클로라이드, 철 0.6125 g (II) 클로라이드 수화물 1.000 g을 추가하고, 탈기 H 2 O 50 ㎖
    주의! 철 (III) 클로라이드 및 철 (II) 클로라이드 테트라는 유해한 - 개인 보호 장비를 착용하십시오.
  6. 50 가열하면서 환류 냉각기를 교체하고 1,000 rpm에서 교반° C. 이러한 조건에서 교반은 10 나노 미터 직경의 마그네타이트 나노 입자를 생성합니다.
  7. 일단 50 ℃에서 계속 교반 둥근 바닥 플라스크에 고무 격막을 통해 주입하여, 28 % 수산화 암모늄 용액 10 ㎖를 추가한다.
    주의! 수산화 암모늄은 유해한 - 개인 보호 장비를 착용하십시오.
    주 : 수산화 암모늄 용액 마그네타이트를 침전 사용되고 용액 검게한다.
  8. 계속 교반하면서 암모니아 가스를 끓여 90 ℃로 둥근 바닥 플라스크 및 열에서 고무 격막 및 N 2 가스 라인을 제거합니다.
    주 : 환류 응축기의 고무 격막을 천공하여 둥근 바닥 플라스크에 N (2)의 흐름을 유지하는 것이 선택적이다, 그러나, 마그 헤 마이트에 마그네타이트의 산화가이 단계에서 무시할 수있다.
  9. 계속 교반하면서 한 번에 90 ℃에서, 둥근 바닥 플라스크에 올레산 1 ㎖를 추가한다. 올레산 노나 코팅 마그네타이트를 사용noparticles는 마그네타이트 겔을 형성한다.
    주의! 올레산은 유해 - 개인 보호 장비를 착용하십시오.
  10. 둥근 바닥 플라스크에 고무 격막 및 N 2 가스 라인을 교체하고 환류 냉각기를 제거합니다.
  11. 2 시간 동안 500 rpm에서 열 및 교반을 끕니다.
  12. isomantle 히터에서 둥근 바닥 플라스크를 꺼내고 마그네타이트 겔을 보유하는 형틀의 저부에 대해 유지 강력 자석을 사용하는 동안 남아있는 액체를 가만히 따르다.
    주의! 손상이나 부상을 방지하기 위해 극도의주의 강한 자석을 처리합니다.
  13. (선택 사항) / N은 ​​공기 건조 O에 자철광 젤을 허용합니다.

자철광 젤 2. 정제

  1. 마그네타이트 겔을 용해시키기 위해 둥근 바닥 플라스크에 헥산 40 mL로 추가
    주의! 헥산 유해한 - 흄 후드에서 개인용 보호 장비는 작업을 착용하십시오.
  2. 잔류 H 2 O를 제거하는 이리저리 탈기 H 2 O 40 mL를 분별 깔때기를 사용하여마그네타이트 용액 미터.
    1. 천천히 분리 깔때기 내의 H 상 자철광 솔루션 2 O을 부어 부드럽게 5 분 동안 2 상 액체 소용돌이 친다.
    2. 밖으로 배출 및 하부 수성 부분을 폐기합니다.
    3. 천천히 마그네타이트 용액 아래가 침전되도록 분별 깔때기로 탈기 H 2 O 40를 가하여 천천히 소용돌이 이전 드레인.
    4. 세 번째 씻어 반복합니다.
  3. , 삼각 플라스크에 마그네타이트 용액을 전송 무수 황산나트륨 상당 몇 주걱을 추가 소용돌이 마그네타이트 용액에 남아있는 잔류 H 2 O를 제거 하였다.
  4. 황산나트륨 및 잔류 H 2 O를 제거하는 필터 깔때기 1 ㎛ 여과지 마그네타이트 용액 필터
    참고 : 진공 지원이 좋습니다.
  5. 50 ㎖ 플라스크에 증발 마그네타이트 용액을 옮기고 용 헥산을 증발시켜, 회전 증발기를 사용하여다음의 조건으로 2 시간 : 중간 회전 속도, 진공을 50 ℃의 수욕을 증발 플라스크에, 도포하고, 24 ° C의 물을 순환하는 콘덴서.
    참고 : 선택적으로, PLGA으로 코팅하기 전에 자철광 젤을 저장합니다.

PLGA 셸 자철광 나노 입자의 코팅 (3)

  1. 1.5 % (m / v)의 용액을 만들고, 에틸 아세테이트 240 ㎖ 중의 3.60 g의 PLGA (75/25 블렌드)를 녹인다. 주의 : 에틸 아세테이트는 유해한 - 흄 후드에서 개인용 보호 장비는 작업을 착용하십시오.
  2. 5.0 % (m / v)의 용액을 만들기 위해 자석 교반기를 사용하여 탈기 H 2 O 500ml에 플루로 닉 F-127 25.00 g을 용해.
    주 : 플루로 닉 F-127은 생체 적합성 계면 활성제로 작용 비이 온성 양친 성 블록 공중 합체이다. 이 단계 3.3.2 중유 에멀젼을 안정화하는데 도움.
  3. microspatula를 사용하여 가중 유리 병 안에 여섯 0.040 g 씩에 자철광 젤를 수집합니다. 반환 한각 나누어지는에 대한 다음과 같은 코팅 및 세척 과정을 ORM.
    참고 : 분취 액을 4 단계에서 분해 이전하는 동결 건조를 최소화하면서 순도와 수율을 극대화 효율적 처리 및 자기 경사를 보장하기 위해 필요하다.
    1. 10 분 동안 초음파 세척기에서 0.040 g의 마그네타이트 겔의 분취 량과 플라스틱 비이커 및 초음파 처리에 PLGA 용액 40 ml를 추가하기.
    2. 플라스틱 비이커에 플루로 닉 용액 80 ml에 첨가하고 약 7 분은 수 중유 에멀젼으로서 마그네타이트 PLGA 나노 입자에 코팅을 형성하기 위해 즉시 높은 설정으로 실험실 혼합기 유화.
    3. 즉시 에틸 아세테이트를 증발시켜 화학 퓸 후드에서 1 시간 동안 탈 H 2 O 및 초음파 처리의 1 L에 SPION 용액을 희석.
    4. SPION 솔루션 옆에 강력한 자석을 놓고 부드럽게 자석에 갈색 SPIONs를 수집 저어.
      참고 :이 간헐적으로 몇 시간 동안 교반 할 필요가있다솔루션 전에 s는 SPIONs의 대부분은 수집 된 것을 나타내는 하얗게 변합니다.
    5. 자석 비이커 SPIONs을 유지하면서 수용액 따르다.
    6. 다음과 같이 SPIONs 세 번 씻으십시오.
      1. 탈 H 2 O 1 L에 SPIONs 일시 중단
      2. 20 분의 SPION 솔루션을 sonicate하세요.
      3. SPION 솔루션 옆에 강력한 자석을 놓고 부드럽게 자석에 갈색 SPIONs를 수집 저어. 이 용액 SPIONs 대부분 수집 된 것을 나타내는 명확한 꺼질 때까지 몇 시간 동안 간헐적으로 교반 할 필요가있다.
      4. 자석 비이커 SPIONs을 유지하면서 수용액 따르다.
  4. 수성 현탁액과 같은 단일 가중 된 유리 바이알에 여섯 마그네타이트 겔 분취 각각으로부터 합성 SPIONs 수집. 필요에 따라 선택적으로 자기 여분의 물을 가만히 따르다.

4. 동결SPIONs의 -drying

  1. SPION 솔루션을 동결.
  2. 동결 건조 동결 건조기에서 SPION 솔루션 O / N을.
  3. 동결 건조 SPIONs 무게. 셀 라벨에 사용 전까지 동결 건조 SPIONs은 -20 ℃에서 저장 될 수있다.
    참고 : -20 ° C 극적에 저장이 분해 반응 속도를 줄이고 수명을 증가시킨다.

SPIONs와 세포의 5 라벨링

  1. 40 mg / ml의 농도로 포스페이트 완충 식염수 (PBS)에 SPIONs의 분취 량을 중단하고 30 분 동안 초음파 처리.
  2. 세포 배양 배지의 5 μL / ㎖의 농도에서 세포의 거의 합류 플라스크 SPION 용액을 추가한다. 조심스럽게 플라스크를 흔들어 균일 한 분포를 확인합니다.
  3. 37 ° C에서 16 시간 동안 세포를 배양한다.
  4. 부드럽게 문화 매체를 대기음하고 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오.
  5. 자기 표지 세포를 수집하고 실험을 위해 사용합니다.
  6. 미사용 SPION 용액을 4 ℃에서 저장 될 수 있고, 우리되어야몇 개월 이내에 에드. 각 사용하기 전에 30 분 동안 초음파 처리.

결과

마그네타이트 나노 입자는 50 ℃, 1000 rpm으로 (도 1) 및 철 (III) 클로라이드, 철 (II) 클로라이드 수화물 수용액을 교반 한 결과, 직경이 약 10 나노 미터이다. 이러한 결과는 마그네타이트 나노 입자가 성공적으로 합성을 보여준다. 이것은 처음으로 합성을 시도 할 때의 배치 작은 샘플로부터 취한 마그네타이트 나노 입자의 크기와 모양을 확인하는 것이 중요하다. 투과 전자 현미경 (TEM)?...

토론

모든 나노 입자 합성 프로토콜로서, 화학 반응물의 순도는 최소한의 세포 독성 효과를 가질 것이다 고품질 SPIONs 달성을위한 중요하다. 이것은 올레산 (≥99 %), 철 (II) 클로라이드 수화물 (≥99.99 %), 철 (III) 클로라이드 (≥99.99 %), 에틸 아세테이트를 포함하여 매우 순수한 시약을 구입하는 것이 중요하다 (HPLC 등급, ≥99.9 % ), 헥산 (HPLC 등급, ≥97.0 %), 수산화 암모늄 (≥99.99 %) 및 ​​황산나트륨 (≥99.0...

공개

The authors declare that they have no competing financial interests.

감사의 말

The authors wish to acknowledge funding from the European Regional Development Fund – FNUSA-ICRC (no. CZ.1.05/ 1.1.00/ 02.0123), the American Heart Association Scientist Development Grant (AHA #06-35185N), and the National Institutes of Health (NIH #T32HL007111).

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Ammonium Hydroxide solution, 28% NH3 in H2O, ≥99.99% trace metal basisSigma-Aldrich338818-100ML Harmful reagent - wear personal protective equipment
Dreschel bottle, 500 mlAce Glass5516-16
Ethyl Acetate, CHROMASOLVR Plus, for HPLC, 99.9% Sigma-Aldrich650528-1LHarmful reagent - wear personal protective equipment & work in fume hood
Ethyl alcoholSigma-AldrichE7023Harmful reagent - wear personal protective equipment
Evaporating flask, 50 ml, 24/40 jointSigma-AldrichZ515558For use with rotoevaporator
Filter paper, 3 cm dia, grade 1Fisher09-805PFor use with glass filter funnel
Glass beakers, 1 LFisherFB-101-1000For washing SPIONs
Glass filter funnel, vacuum hose adapter, fits 24/40, 30 mLFisherK954100-0344 
Glass vial capsFisher03-391-46For use with glass vials
Glass vials, 2 mlFisher03-391-44For collecting magnetite gel & SPIONs
Hexane, CHROMASOLVR, for HPLC, ≥97.0% (GC)Sigma-Aldrich34859-1L Harmful reagent - wear personal protective equipment & work in fume hood
Hydrochloric acidSigma-AldrichH1758Harmful reagent - wear personal protective equipment & work in fume hood
Iron(II) chloride tetrahydrate, ≥99.99% trace metals basis Sigma-Aldrich380024-5GHarmful reagent - wear personal protective equipment
Iron(III) chloride anhydrous, powder, ≥99.99% trace metals basisSigma-Aldrich451649-1GHarmful reagent - wear personal protective equipment
Isomantle heater, 500 mLVoight GlobalEM0500/CEX1
Laboratory mixerSilversonL5M-A
LyophilizerLabconco7670520
MicrospatulasFisher21-401-25AFor transfering magnetite gel
NdFeB magnet, 1 in x 1 in x 1 inAmazing MagnetsC1000H-MVery strong magnet, handle with care
Oleic acid, ≥99% (GC)Sigma-AldrichO1008-5G Store in freezer; Harmful reagent - wear personal protective equipment
Overhead stirrerIKA2572201
Overhead stirrer clampIKA2664000For use with overhead stirrer
Overhead stirrer H-standIKA1412000For use with overhead stirrer
Phosphate buffered salineLife Technologies10010-023
Plastic beakers, 250 mlFisher02-591-28
PLGA PURASORB PDLG (75/25 blend)PuracPDLG 7502PDLG 7502A may be used as well; Store in freezer
Pluronic F-127 powder, BioReagent, suitable for cell cultureSigma-AldrichP2443-250G 
PTFE expandable blade paddle, 8 mm diaSciQuipSP4018
PTFE vessel adapter, fits 24/40, 8 mm dia paddleMonmouth ScientificPTFE Vessel Adaptor A480For use with PTFE expandable blade paddle
Recirculating chillerClarkson696613For use with rotoevaporator
Reflux condenser, fits 24/40, 250 mmAce Glass5997-133
RotoevaporatorClarkson216949
Rubber septa, fits 24/40Ace Glass9096-56
Separatory funnel with stopper, 250 mlFisher10-438E
Sodium sulfate ACS reagent, ≥99.0%, anhydrous, granularSigma-Aldrich239313-500G 
Three neck round bottom flask, angled, 24/40 joints, 500 mlAce Glass6948-16
Ultrasonic cleaner perforated panFisher15-335-20AFor use with ultrasonic cleaner
Ultrasonic cleaner, 2.8 LFisher15-335-20
Vacuum controllerClarkson216639For use with rotoevaporator (optional)
Vacuum pumpClarkson219959For use with rotoevaporator

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