방법은 세균 Pyomelanin 생산을 억제하고 산화 스트레스에 감도에 대응 증가를 확인하는 방법

요약

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

초록

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H₂O₂ into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H₂O₂ compared to a no H₂O₂ control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H₂O₂. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

서문

Pseudomonas aeruginosa is a Gram negative bacterium that produces a variety of pigments including pyomelanin, a red-brown pigment that helps provide protection from oxidative stress^1-4 and binds a variety of compounds, including aminoglycoside antibiotics^5-7. Pyomelanin production is caused by a defect in the tyrosine catabolism pathway^4,8, either through deletions or mutations of the gene encoding homogentisate 1,2-dioxygenase (HmgA)^1,9 or through imbalances in the various enzymes in the pathway¹⁰. Homogentisate accumulates due to inactivation of HmgA, and is secreted and oxidized to form pyomelanin¹¹. Production of pyomelanin can be abolished or reduced in a dose dependent manner through treatment with the herbicide 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)¹², which inhibits 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (Hpd) in the tyrosine catabolism pathway¹³. Hpd is required for the formation of homogentisate, and therefore pyomelanin¹¹.

We describe in detail three techniques that were important in our studies of NTBC treatment of pyomelanin producing strains of P. aeruginosa. These techniques include titration of NTBC to determine the concentrations that will abolish or reduce pyomelanin production in laboratory and clinical pyomelanin producing strains, determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) of antibiotics when bacteria are treated with NTBC, and the resulting sensitivity to oxidative stress with NTBC treatment.

The titration assay we developed serves two purposes. First, the assay will allow the user to determine if NTBC can abolish or reduce pyomelanin production in the bacterium being studied and at which concentrations. This will allow the user to determine sensitivity to NTBC, since different strains of bacteria may have different sensitivities to this compound, as observed in P. aeruginosa¹². Second, the NTBC titration assay will allow the user to determine the appropriate concentration of NTBC to use in subsequent assays, such as antibiotic MIC and oxidative stress response assays, if the goal is to abolish or reduce pyomelanin production and determine the effects of pigment reduction.

The titration assay works because a visible difference in pyomelanin production can be seen in strains treated with NTBC and the differences in pyomelanin production are dose dependent¹². Additionally, this technique can be applied to the study of other compounds that may eliminate or enhance pigment production in bacteria.

Antibiotic MICs are used to determine the sensitivity of bacteria to antibiotics. There are several methods to determine MICs, including agar dilution plates and broth dilutions¹⁴. Broth dilutions can be performed in small test tubes or in a 96-well microtiter plate. The microtiter plate method of MIC determination described herein will allow the user to test a wide range of antibiotics using a minimum of resources. The assay provides reproducibility as well as flexibility in the number of antibiotics and strains tested by this method. Additionally, with the incorporation of NTBC in the assay, the user can determine if elimination or reduction of pyomelanin production alters antibiotic sensitivity in bacteria that produce pyomelanin.

Bacterial response to oxidative stress can be tested in several ways. The most common methods described are either viable counts of bacteria subjected to oxidative stress for a period of time¹, or oxidative stress disc diffusion assays¹⁵. These methods tend to use high concentrations of oxidative stressors to examine the effects of oxidative stress in bacteria and results can be quite variable between biological replicates. The viable count assay also tends to use more agar plates than the other methods. The spot plate assay we describe uses low concentrations of H₂O₂ and allows the user to test the oxidative stress response of multiple strains using a minimum of plates. The assay is also consistently reproducible between technical and biological replicates. As pyomelanin is involved in resistance to oxidative stress, the incorporation of NTBC in the assay allows the user to determine the effects of elimination of pyomelanin production on oxidative stress resistance.

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프로토콜

배양기 항생제 1. 제조, 및 2- [2- 니트로 -4- (트리 플루오로 메틸) 벤조일] -1,3- 시클로 헥산 디온 (NTBC)

1. 적절한 볼륨으로 LB 액체 배지 (1 % 트립 톤, 0.5 % 효모 추출물, 0.25 %의 NaCl의 H ₂ O)과 분취 액을 만든다. 오토 클레이브 소독. 실온에서 보관하십시오.
2. 100 ㎖ LB 한천 (1 % 트립 톤, 0.5 % 효모 추출물, 0.25 % 염화나트륨, H ₂ O 1.5 % 한천) 250 mL의 플라스크를 만든다. 실온에서 오토 클레이브 및 저장에 의해 소독. 한천 플레이트에 쏟아져 전에 용융되어 있는지 확인합니다.
   주 : 4 판을 수득한다 LB 한천 100 ㎖을 함유하는 플라스크. LB 한천의 양이 분석에 필요한 플레이트의 수에 대응하도록 변경 될 수있다.
3. (137 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl, 10 mM의 나 ₂ HPO _4, 2 mM의 KH ₂ PO ₄₎ ⁽¹⁶⁾ PBS를 확인합니다. 실온에서 오토 클레이브 또는 여과 및 저장에 의해 소독.
4. 겐타 마이신에 대한 항생제 재고 솔루션을 준비, 카나마이신,D 토 브라 마이신.
   1. 피에 대한 적절한 항생제 재고 농도를 준비 100 ㎎ / ㎖ 젠타 마이신 30 ㎎ / ㎖의 카나마이신 및 10 ㎎ / ㎖의 토 브라 마이신을 함유 루기 노자 균주. 4 ° C에서 물 필터 소독 (0.2 μm의)와 저장소에 항생제를 녹인다. 연구 박테리아에 따라 항생제 농도를 변경합니다.
5. NTBC 재고 솔루션을 준비합니다. DMSO 400 μL에 NTBC 10 mg을 녹이고. 이것은 75.9 mM의 NTBC의 농도를 산출한다. -20 ° C에서 보관 NTBC 스톡 솔루션을 제공합니다. 실온에서 해동 용액은 필요에 따라.
   참고 : NTBC의 다른 소스는 용해도의 차이가 있습니다. 제조업체의 권장 사항에 따라 NTBC을 용해 단계 1.5 따라서를 조정하는 적절한 차량을 결정합니다.

2. 세균 균주의 NTBC 적정의를

1. 균주의 설정 하룻밤 문화를 테스트합니다. 2 ㎖의 LB 배지에 16 × 150mm 시험관 추가S (주 당 하나) 및 각 변형에서 1 절연 식민지 접종. 공기 인큐베이터에서 조직 배양 회전기에 통기로 37 ℃에서 밤새 배양한다.
2. 다음 날, LB 배지에 NTBC의 적정을 준비합니다. 다른 균주 NTBC에 대한 민감도에 차이가 있기 때문에 0 ~ 900 μm의 NTBC에 초기 범위를 사용합니다.
   1. 변형 당 4 ~ 5 시험관 (16 × 150mm)에 1 ㎖의 LB 배지를 추가합니다.
   2. 농도 범위에서 시험관 (16 × 150mm)에 NTBC 스톡 용액 (75.9 mm)를 추가한다. LB 액체 배지 1 ㎖에 추가 NTBC 농도 및 해당 재고 수량은 표 1을 참조하십시오.
3. 하룻밤 문화의 OD _600을 측정합니다. 미디어에 존재 pyomelanin 제거하기 위해 OD ₆₀₀ 판독을 복용하기 전에 문화를 씻으십시오.
   1. 2 분 동안 16,000 XG에서의 microcentrifuge에 문화 1 ㎖을 원심 분리하여 문화를 씻으십시오. 뜨는 및 느슨하게 펠렛 세포를 제거micropipettor 및 1 ml의 (LB)에 고체 세포 펠렛을 재현 탁
4. OD ₆₀₀ 0.05 적정 튜브를 접종. 튜브에 접종하는 데 필요한 세척하고 배양의 양을 계산한다.
   참고 : 존재하지 않아야 pyomelanin 때문에 예방 접종에 대한 세척 문화를 사용합니다.
5. 폭기는 공기 인큐베이터에서 조직 배양 회전기를 사용하여 37 ℃에서 약 24 시간 동안 적정 튜브 부화.
6. 적정 튜브 사진 및 MIC 및 산화 스트레스 분석에 사용할 NTBC의 양을 결정하기 위해 내부 및 균주간에 색소 생산을 비교한다. 무 세포 배양 상층 액에서 pyomelanin의 양을 결정하고 세포 밀도를 결정하기 위해 ₆₀₀ OD 판독을 사용한다.
   주 : 세포 배양 상청액에서 pyomelanin OD _600의 비율로 처리 후 NTBC pyomelanin 생산에서의 차이를 정량화하기 위해 계산 될 수있다.

3. 항생제 최소 Inhibi96 웰 플레이트에 토리 농도 (MIC) 분석

1. 균주의 설정 하룻밤 문화와 NTBC없이 LB에서 시험한다.
   주 :이 프로토콜은 300 μM NTBC의 대표적인 레벨을 사용하여 설명한다. 사용될 NTBC의 적절한 수준은 단계 260에서 결정된다.
   1. 2 ml의 (LB) 300 μm의 NTBC 추가 더 NTBC 조건에 대해 2 ml의 LB에 차량 (DMSO)의 동등한 볼륨을 추가합니다.
   2. 멸균 이쑤시개를 사용하여 박테리아의 하나 고립 된 식민지와 튜브를 접종. NTBC 하나의 문화와 각 변형에 대한 NTBC없이 하나의 문화가 될 것입니다. 폭기는 공기 인큐베이터에서 조직 배양 회전기를 사용하여 37 ℃에서 밤새 배양한다.
2. 다음 날, MIC 분석을 설정하는 LB + NTBC 및 LB + DMSO 마스터 솔루션을합니다. 접종 물이 추가 될 때,이 600 μM의 농도로 추가하기 NTBC 300 μM의 최종 농도를 산출 두 배 희석한다.
   1. 하나 antibi을 테스트하려면하나의 변형, 2 ㎖의 LB 600 μm의 NTBC을 추가하고 NTBC 마스터 솔루션을 만들기 위해 혼합에 대한 귀의. 2 ㎖의 LB에 차량 (DMSO)의 동등한 볼륨을 추가하고 더 NTBC 마스터 솔루션을하지 않습니다 섞는다. 항생제 원액을 만들뿐만 아니라 96 웰 플레이트에서 희석 시리즈를 설정하는 이러한 솔루션을 사용한다.
      참고 : 마스터 용액 제형은 피펫 오류를 설명하는 별도의 솔루션을 얻을 것입니다. 시험 균주의 항생제와 수에 따라서 필요에 따라 마스터 솔루션은 상하 또는 축소 될 수있다.
3. LB + NTBC 또는 LB + DMSO 마스터 솔루션의 항생제 솔루션을 준비합니다.
   참고 :이 솔루션의 항생제 농도가 두 배 최종 원하는 농도이어야한다. 충분한 용액을 96 웰 플레이트에 웰에 네 100 μl를 전송해야한다.
   1. 겐타 마이신 + 64 ㎍ / ml의에서 NTBC 주식 솔루션을 준비합니다. 겐타 마이신 (450)의 콘텐츠 0.288 μL (100 ㎎ / ㎖)을 추가하고,이 용액을 만드는μL LB + NTBC 또는 LB + DMSO 마스터 솔루션입니다.
      참고 : P.에 대한 겐타 마이신의 최대 농도 녹농균 PAO1는 32 μg의 / ㎖이다.
   2. 카나마이신 + 256 μg의 / ㎖에서 NTBC 주식 솔루션을 확인하십시오. 450 μL LB + NTBC 또는 LB + DMSO 마스터 솔루션 카나마이신 주식의 3.84 μL (30 ㎎ / ㎖)를 추가,이 솔루션을 확인합니다.
      참고 : P.에 대한 카나마이신의 최대 농도 녹농균 PAO1 128 μg의 / ㎖이다.
   3. 토 브라 마이신 + 8 μg의 / ㎖에서 NTBC 주식 솔루션을 준비합니다. 이 솔루션을 450 μL LB + NTBC 또는 LB + DMSO 마스터 솔루션에 토 브라 마이신 주식의 0.36 μL (10 ㎎ / ㎖)를 추가합니다.
      참고 : P. 들어 aeruginosa의 PAO1, 토 브라 마이신의 최대 농도는 4 μg의 / ㎖이다.
      주 : 박테리아 시험되어야하는 항생제 농도가 조절 될 수있다.
4. 96 웰 플레이트에서 네 개의 우물에 각각 2 배 항생제 용액 100 μl를 추가합니다. exampl에 대한 행 A의 이러한 솔루션을 배치즉, 젠타 A4 통해 A1에 배치해야 카나마이신을 통해 A8 A5에 배치되어야하고, 토 브라 마이신을 통해 A12 A9에 배치되어야한다. 설정 96 웰 플레이트의 그림에 대한 그림 1A를 참조하십시오.
   주 : 다중 항생제 한 플레이트에서 시험 할 수 있지만, 단지 하나의 변형은 다른 균주에서 교차 오염의 가능성을 제거하기 위해 접시 당 테스트되어야한다.
5. 96 웰 플레이트의 H​​를 통해 행 B에 LB + NTBC 또는 LB + DMSO 마스터 용액 50 μl를 추가합니다. 그 하나의 판을 확인 LB + NTBC이고 하나 플레이트 LB + DMSO입니다. 그림 1A를 참조하십시오.
   1. LB + NTBC에서 항생제에 대한 LB + NTBC을 사용합니다. LB + DMSO의 항생제에 대한 LB + DMSO를 사용합니다.
6. micropipettor가 피펫 팁을 변경, B를 믹스에게 솔루션을 행하기 위해 행에서 용액 50 μl를 전송하여 항생제의 두 배 연속 희석을 수행하여, 및 행 (B)에서 용액 50 μl를 전송하기위한 C. 반복을 행합니다 remainiNG 행. 행 G 희석 한 후, 그 행과 폐기의 용액 50 μl를 제거합니다. 박테리아 성장을위한 항생제 컨트롤로 행 (H)를 사용합니다. 그림 1B를 참조하십시오.
   참고 : G를 통해 각각의 잘 행은 지금 배에서 LB + NTBC 또는 LB + DMSO 항생제의 50 μL 최종 원하는 농도가 포함되어 있습니다. 행 H없이 항생제로 LB + NTBC 또는 LB + DMSO가 포함되어 있습니다.
7. 하룻밤 문화의 OD _600을 측정합니다. 미디어에 존재 pyomelanin을 제거하기 위해 OD ₆₀₀ 판독을 복용하기 전에 모든 문화를 씻으십시오.
   1. 2 분 동안 16,000 XG에서의 microcentrifuge에 문화 1 ㎖을 원심 분리하여 문화를 씻으십시오. micropipettor으로 뜨는을 제거하고 1 ㎖의 (LB)에있는 세포 펠렛을 resuspend
8. (LB)에서 2.75x10 ⁵ CFU / ㎖로 하룻밤 문화를 희석
   참고 : 하나의 OD ₆₀₀ 단위 (P)에 대한 1 × ⁹ CFU / ㎖의 상응이라고 가정 녹농균. CFU / ㎖ 변환에 OD는 거라고 할 수있다다른 박테리아에 ifferent.
9. 적절한 웰에 희석 세균 배양의 50 μl를 추가합니다.
   주 : NTBC 성장 DMSO 배양에서 성장 및 배양 NTBC DMSO를 함유하는 웰에 첨가한다 함유 웰에 첨가한다. 그림 1B를 참조하십시오.
   1. 각 균주와 항생제 농도 세 우물에 세균을 추가합니다. 세균 오염에 대한 제어 역할을하는 네 번째 우물에 LB의 50 μl를 추가합니다. 그림 1B를 참조하십시오.
   2. 웰 접종 멀티 채널 micropipettor를 사용한다. 이웃하는 웰의 오염을 방지하기 위해 추가 접종 할 때 팁을 웰의 바닥 근처에 있음을 보장 피펫.
      참고 : 우물에 세균 배양을 추가하면 항생제와 NTBC 농도의 두 배를 희석합니다.
10. 파라 필름으로 96 웰 플레이트를 덮고, 37 ℃에서 약 24 시간 배양한다. 공기 인큐베이터에서 정적으로 96 웰 플레이트를 품어.
11. 검사우물에 세균 성장​​을위한 판. MIC는 세균의 성장에는 각 균주의 복제에 대해 세 보지되는 항생제의 최소 농도이다.
    1. 시각적으로 성장 판을 검사하거나 _{(600) 중독에} 플레이트 리더 세트를 사용하여 읽기.

산화 스트레스 응답 4. 스팟 플레이트 분석

1. 3.1 단계에 설명 된대로 균주의 설정 하룻밤 문화 NTBC와 LB와없이 테스트 할 수 있습니다.
2. 다음날, 산화성 스트레스로 H ₂ O _2를 함유하는 LB 아가 플레이트를 준비한다. 0 내지 1 mM의 H의 범위는 ₂ O ₂ 농도는 좋은 출발점이다.
   1. LB 한천 플라스크 용융. 실온에서 약 50 ° C로 냉각 매체.
   2. 원하는 농도로 냉각 된 미디어에 직접 O ₂ H _2를 추가합니다. 소용돌이 플라스크 혼합합니다. H의 농도는 표 2를 참조하십시오 ₂ O ₂농축 H ₂ O _2의 볼륨을 추가 할 수 있습니다. 이러한 값은 LB 한천 100 ㎖에 기초한다.
   3. 바로 거품을 제거하기 위해 H ₂ O ₂ 불꽃을 표면을 추가 한 후 번호판을 붓고. 수율은 LB 한천의 100 ㎖ 당 4 판입니다. H ₂ O ₂ 농도가 판을 표시합니다.
   4. 플레이트에서 과도한 수분을 제거하는 30 분 동안 실행 팬 생물학적 흐름 후드에서 발견 판을 놓습니다.
      참고 : 판들이 준비되어 같은 날을 사용합니다. 그렇게하지 ​​않으면 일치하지 않는 데이터가 발생할 수 있습니다.
      참고 사항 : 파라쿼트 같은 산화 스트레스는이 분석에서 H ₂ O _2를 대체 할 수 있습니다. 다른 산화성 스트레스에 사용 농도는 H ₂ O _2에 사용되는 것과 다를 수있다.
3. 세척 단계 3.7에 설명 된대로 외경에게 하룻밤 문화 _(600)을 측정한다.
4. 모든 하룻밤 CU의 OD ₆₀₀ 정상화균주의 집합의 가장 낮은 값 ltures 테스트중인. P. 녹농균은 일반적으로 LB + NTBC 또는 LB + DMSO에 하룻밤 성장 약 2.5의 OD _600이 있습니다.
   1. 1 ml의 총 부피에서 낮은 OD ₆₀₀ 문화를 희석하는 데 필요한 배양의 볼륨을 결정한다. 배양 OD (3)의 ₆₀₀ 균주의 세트는 낮은 OD _{(600)가있는} 경우, 예를 들면 2.5 인, 다음의 계산을 수행 (2.5) (1 ㎖)을 = (3) (X). X는 = 0.833 ml의. 문화의 0.833 mL의 미세 원심 분리 튜브에 배치됩니다.
   2. 1 ml의 배양 부피를 가지고 필요 LB + NTBC (300 μM) 또는 DMSO LB +의 양을 계산한다. 단계 4.4.1에서 예를 들어, LB + NTBC 또는 LB + DMSO의 양이 0.167 ㎖ (- 0.833 ml의 문화 1 ml의 총 부피) 될 문화에 추가됩니다. LB + NTBC 및 LB + DMSO의 재고 솔루션은 모든 균주를 희석에 필요한 볼륨 근거로이 희석에 사용합니다.
   3. 문화와 LB + N 믹스텍싱에 의해 TBC 또는 LB + DMSO.
5. NTBC 또는 DMSO의 일정한 농도의 문화를 유지하기 위해, PBS + NTBC 또는 PBS + DMSO의 정규화 하룻밤 문화의 열 배 연속 희석을 수행합니다.
   1. PBS + NTBC과 PBS + DMSO의 재고 솔루션을합니다. 하나의 균주에 대한 희석 한 세트의 경우, 720 ㎕의 총 부피를 수득 300 μM의 NTBC 또는 PBS와 DMSO의 동등한 양을 혼합한다. 테스트 얼마나 많은 균주에 따라 위 또는 아래로이 주식을 확장 할 수 있습니다.
   2. ^10-7 연속 희석을 통해 10 ^-1에 대한 라벨의 microfuge 튜브. 적절한 튜브에 PBS + NTBC 또는 PBS + DMSO의 90 μl를 추가합니다. LB + NTBC에서 재배 변종에 대한 PBS + NTBC를 사용하여 LB + DMSO에 성장 균주에 대한 PBS + DMSO를 사용합니다.
   3. 해당 ^10-1 희석 관에 문화의 10 μl를 추가합니다. 텍싱하여 혼합하고 10 ^-2 희석 튜브에 10 ^-1 희석의 10 μl를 전송합니다. 모든 희석이 PERFO 때까지 반복rmed. 희석 사이에 피펫 팁을 변경합니다.
6. 각 변형에 대한 중복에 LB + H ₂ O ₂ 판에 ^10-7 희석을 통해 10 ^-3의 자리는 5 μL. 관광 명소 도금하는 경우 대부분은 적어도 희석 ^{(10-7 -3} 10) 희석에서 한 피펫 팁을 사용합니다. 팁 또는 액체가 플레이트에 건조 될 때까지 판을 기울이지 마십시오.
7. 변형에 따라 37 ° C (공기 인큐베이터)에서 24 ~ 48 시간 동안 접시를 품어.
   참고 : P. 녹농균 PAO1는 배양 24 시간 후 LB에 좋은 크기의 식민지를해야합니다. 그들은 콜로니를 PAO1 대략 동일한 크기를 가질 때까지 균주를 배양한다.
8. transluminator 위의 CCD 카메라를 사용하여 번호판을 사진. 선택적으로, 같은 크기 대비 및 작물에 대한 사진을 편집 할 수 있습니다. 산화 스트레스에 대한 민감도에서의 변화를 결정하기 위해 각각의 스폿에서의 콜로니 수를 카운트.

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결과

NTBC 적정

NTBC가 경찰에 pyomelanin 생산을 줄일 수 있다면 NTBC 적정을 결정하는 데 사용되었다 애 루기 노사, 또한 제거 또는 추가 분석에 사용하기 위해 생산을 감소 pyomelanin NTBC의 농도를 확인한다. 이 다른 복제에서 생성 pyomelanin의 수준에서 변화 될 수 있지만 일반적인 경향은 일정하게 유지 될 수 있습니다. NTBC 적정 분석은 다른 세균 안료 생산에 영향을 미칠 수...

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토론

The NTBC titration method described in this protocol will allow the user to determine if NTBC can reduce or eliminate pyomelanin production in bacteria, and determine the concentration of NTBC required. The most critical step in the NTBC titration assay is determining the range of NTBC concentrations to use in the assay. Different strains of P. aeruginosa have different sensitivities to NTBC, and laboratory strains may be more sensitive to NTBC than clinical isolates¹² (Figure 2). The...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)	Sigma-Aldrich	SML0269-50mg	Also called nitisinone.  Soluble in DMSO.
H2O2	Sigma-Aldrich	216763-100ML	30 wt. % in H2O.  Stabilized.
Gentamicin	Gold Bio	G-400-100	Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906-5	Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Tobramycin	Sigma-Aldrich	T4014-100MG	Soluble in H2O.  Filter sterilize.