RNA 분석을위한 인간의 전립선 상피 세포의 레이저 캡처 이외에 Microdissection

요약

The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

초록

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.

서문

전립선은 주로 평활근 ^1로 구성 fibromuscular 기질에 둘러싸여 샘 꽈리에 배치 분비 상피 세포로 구성된 이종 조직이다. 기저 세포 분비 세포, 신경 내분비 세포, 중계 증폭 세포 및 줄기 세포 ² : 상피 구획 다섯 다르지만 조직 유형의 세포로 구성된다. 내강 상피 세포로부터 발생 전립선 암 (PCA)에있어서, 선암 성장 기질 구획 ^(3)의 점진적인 하락 분명시킨다. 이러한 이유로, 조직 표본은 PCA의 정도에 기초하여 기질과 상피 세포 유형의 비율 뚜렷한 차이가있을 것이다. 이러한 차이는 원하는 세포 유형의 미세 절제에 관계없이 전체 조직에서 얻은 유전자 발현 데이터의 바이어스 된 가정을 초래할 수있다. 따라서, 이러한 바이어스를 제거하는 것이 종래 RNA 추출 및 세포 유형을 분리하는 것이 필수적이다유전자 발현 분석.

Macrodissection 미세 절제 또는 물리적 주변 기질 ^{4 -6에서} 잘 특성화 상피 영역을 분리하기 위해 사용될 수있다. Macrodissection는 일반적으로 해부 현미경 면도날으로 수행하고 큰 PCA는 기질에서 결절 분리 잘 작동하지만, 기질 주변에서 양성 상피를 제거 할 수 없습니다 (그림 1에서 양성 전립선 조직 검사의 예를 참조). 레이저 (LCM)와 미세 절제는 macrodissection보다 훨씬 더 많은 노동 집약적이지만, 매우 정확하게 양성 상피 ^(4)를 해부 할 수 있습니다.

우리의 실험실에서 최근 출판물은 RNA가 성공적으로 포르말린 고정 파라핀 (FFPE) 조직 검사 또는 냉동 조직 ^4,7-9 중 하나에서 LCM에 의해 추출 될 수 있음을 보여 주었다. LCM-RNA 추출의 주요 과제는 R 1)을 정확하게 조직의 원하는 부분을 해부하고, 2) 보존하려면LCM 및 분리 공정 ^4,10 동안 NA의 무결성. 순수한 세포 집단에서 분리 된 RNA는 정량적 역전사 PCR (RT-qPCR에) ^7,8, 마이크로 어레이 ^(11), 및 깊은 -sequencing ^12-14 포함한 여러 방법에 의해 유전자 발현 분석을 위해 사용될 수있다.

이 프로토콜의 목적은 하류 유전자의 발현 분석을 위해 냉동 된 조직으로부터의 LCM 전립선 상피 세포에서 총 RNA를 분리하는 것이다.

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프로토콜

이 실험에 사용 된 모든 인체 조직은 시카고 일리노이 대학의 임상 시험 심사위원회의 승인을 프로토콜 및 / 또는 면제를 통해 인수했다.

1. 제 냉동 전립선 PEN-슬라이드에와 충전 유리 슬라이드에

1. 하루 전 또는 몇 시간 샘플을 절편하기 전에, 청소 도구 (즉, 브러쉬, 집게, coplins, 블레이드, PEN-프레임 슬라이드 (그렇지 않으면 이미 된 RNase 무료), ETOH 안전 마커와 연필)과의 내부 스프레이 병 및 실험실 와이프를 사용하여 솔루션을-오염 제거의 RNase와 RT의 저온 유지 장치.
   1. 의 RNase-오염 제거 솔루션, 멀리 닦아 전에 5 분 동안 앉아 솔루션 (depcH ₂ 0 준비) 70 % EtOH로 최종 헹굼의 RNase가-오염 제거를 통해 왼쪽 제거하려면 depcH ₂ 0 씻어하도록 허용합니다.
      참고 :이 된 RNase없는 작업 공간을 유지하기 위해 필수적이다. 모든 coplins, 도구, 냉동 장착 매체, 블레이드 및 사용 슬라이드의 RNase 무료 작업에만 사용되어야한다및 표준 비의 RNase없는 환경에서 사용되지 않습니다. 모든 악기는 각 실험 이전의 RNase의 오염 제거 용액으로 처리해야합니다.
2. -24 ℃로 냉각 저온 유지 장치.
3. 이전 절편에 적어도 30 분을 냉각 저온 유지 장치 내부에 다음과 같은 청소의 RNase 무료로 악기를 배치 : 슬라이드 코 플린 충전 100 % 에탄올, 도구, 작은 냉동 조직 카세트 및 장착 척.
4. 전송을 위해 드라이 아이스로 채워진 거품 양동이에 cryostorage과 장소에서 냉동 된 전립선 조직을 검색합니다. 적어도 30 분 동안 온도를 저온 유지하는 평형 저온 유지로 조직을 놓습니다.
   참고 : 레이저 캡처 마이크로 해부에 대한 인간의 전립선 조직이 신선한 냉동 또는 일 수있다 파라핀 (FFPE)를 포르말린 고정. 시간 제약 및 슬라이드 준비는 조직 소스간에 약간 다릅니다. 여기에서 우리는 냉동 섹션의 단계를 설명합니다.
5. 한 번에 하나의 조직과 협력하고 BOTTO에 고정 설치 매체를 분출카세트의 M 빠르게는 냉장 집게를 사용하여 냉동 설치 매체에 고정 된 전립선 조직을 탑재합니다.
6. 냉동 설치 매체를 설정하는 데 5 분 동안 저온 유지 장치에 냉각기에 조직과 카세트를 놓습니다.
7. 척에 고정 장착 매체의 작은 금액을 분출 조심스럽게 냉동 설치 매체에 최대 장착 조직 아래쪽을 누르십시오. 5 분은 냉동 장착 매체가 완전히 응고 할 수 있도록하기위한 저온 유지 장치에 설정할 수 있습니다.
8. 홀더에 척을 배치하고 조입니다.
9. 잠금 위치에 손잡이를 잠금 및 저온 유지 장치에 새로운 블레이드를 배치합니다. 증폭 단계를 포함 하류 분자 엔드 포인트의 경우 (즉, qPCR에)는 오염을 방지 (또는 다음 샘플을 위해 블레이드의 영역을 사용하는 동안 블레이드를 이동) 각 환자에 대한 새로운 블레이드를 사용하는 것이 좋습니다.
10. 핸들의 잠금을 해제하고 조심스럽게 균일 손 또는 발 페달과 조직을 발전 50 μ와 조직을 노출원하는 조직 m까지 노출 부에 도달한다.
11. 5 μm의 저온 유지 장치를 조정 하나 또는 두 개의 섹션을 절감하고 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E) 염색 부과 유리 슬라이드에 그들을 배치 (2 단계 참조).
12. 즉시 2 분 동안 차가운 100 % 에탄올로 슬라이드를 배치합니다.
13. 에탄올에서 충전 된 유리 슬라이드를 제거하고 H & E 염색 (2 단계)로 진행하기 전에 실온에서이 건조 할 수 있습니다.
14. 프레임 지지자에 RT PEN 프레임 슬라이드를 놓습니다.
15. RT PEN 프레임 슬라이드에 10 μm의 장소 섹션에 저온 유지 장치를 조정합니다. 1 ~ 4 절은 조직의 크기에 따라 각각의 슬라이드에 장소가 될 수 있습니다.
16. 즉시 2 분 동안 100 % 냉 에탄올로 슬라이드 급락.
17. 에탄올 펜 프레임 슬라이드를 제거하고 LCM에 대한 준비가 될 때까지 -80 ° C 냉장고에 데시 케이 상자에 슬라이드 상자에 슬라이드를 저장합니다. 사흘 최적 RNA 회수의 최대 축적 시간이다.
18. 충전 된 유리 슬라이드에 대해서만 2 단계를 진행합니다이자형. PEN 프레임 슬라이드의 3 단계로 진행합니다.

2. 헤 마톡 실린 및 에오신-Y (H & E) 조직 학적 마크 업에 대한 얼룩

참고 :이 충전 된 유리 슬라이드에 조직과하지 LCM의 PEN 프레임 슬라이드의 경우.

1. 다음과 같이 등급 에탄올 통해 슬라이드 침지 청구 유리 슬라이드 섹션 수화물 : 3 분, 두 동안 70 % 에탄올로 한 번, 3 분간, 3 분간 슬라이드를 95 % 에탄올에 두 번 100 % 에탄올에 두 번 찍어 3 분 동안 증류수 H ₂ O의 시간.
   1. 99 ml의 70 % 에탄올 + 1 ml의 1 % HCl 및 0.1 % 중탄산 나트륨 용액 : 100 ㎖의 0.1 g 중탄산 나트륨 증류 H ₂ O 산 알코올 용액을 조제
2. 5 분 동안 헤 마톡 실린 길 II (0.4 %)에서 슬라이드를 찍어.
3. 3 분 동안 지속적으로 실행 탭 H ₂ O에 여분의 얼룩을 씻어 내십시오.
4. 슬라이드를 산 알코올의 10 배를 찍어
5. 3 분 동안 탭 H ₂ O를 실행에 슬라이드를 씻으십시오.
6. 슬라이드를 찍어0.1 % 탄산 수​​소 나트륨 용액에 30 ~ 60 초 파란색 보라색 색상을 설정하려면하십시오.
7. 3 분 동안 탭 H ₂ O를 실행에 슬라이드를 씻으십시오.
8. 10 딥 95 % 에탄올에 슬라이드를 씻어.
9. 15 초 총 에오신-Y 2 ~ 3 시간에 슬라이드를 찍어.
10. 다음과 같이 등급 에탄올을 통해 슬라이드를 탈수 : 크실렌에 슬라이드 95 % 에탄올에 두 번, 100 % 에탄올에 두 번, 두 번 찍어 (조직이 철저한 탈수를 나타내는 명확한 표시해야합니다).
11. 비 수성 영구적으로 하드 장착 매체 커버 슬립과 슬라이드를 탑재합니다.
12. 30 분 동안 슬라이드 건조하자.
13. 어떤 전체 슬라이드 스캐너 스캔 슬라이드와 8 "X 11"용지에 대형, 고해상도 이미지를 인쇄 할 수 있습니다.
14. 관심의 개요 영역은 마커 (일반적으로 보드 인증 병리학 자에 의해 수행). 이 태그는 LCM 절차에 대한 가이드입니다.

PEN 프레임 슬라이드 3. 톨루이딘 블루 염색

참고 : 목을LCM과 같은 날을 수행한다. 모든 솔루션을 depcH ₂ O 물을 사용합니다. 의 RNase가없는 지역의 모든 단계를 완료합니다. 모든 coplins이 된 RNase-오염 제거 용액으로 세척해야합니다.

1. LCM의 날은 2 분 후 2 분 동안 90 %의 EtOH에 부드럽게 찍기 슬라이드에 의해 75 %의 EtOH를 -80 ° C의 냉동고 및 수화물에서 펜 프레임 슬라이드를 제거합니다.
   1. 다음 실온에서 0.2 μm의 필터와 저장소를 통해 살균 필터 분자 생물학 수준의 물에 용해하여 0.5 % 톨루이딘 블루를 준비합니다. 이 용액은 최대 6 개월 동안 재사용 될 수있다. 참고 : 그것은 매우 전에 여과 몇 시간이 걸릴 수 있습니다로 솔루션을 준비하는 것이 좋습니다.
2. 부드럽게 5-30 초 동안 0.5 % 톨루이딘 블루로 슬라이드를 침지하여 전립선 조직을 염색. 세탁에 의한 조직은 3 분 30 초 동안 75 % EtOH로 다음 15 초 동안 depcH ₂ O 2 번 슬라이드 Destain. 주 : 얼룩과 destain 시간은 양호한 염색을 위해 조정될 수있다. 전립선은 얼룩 위에 경향이있다.
얼음에 RNAase없는 건조한 용기에 펜 프레임 슬라이드를 전송합니다.

4. 레이저 캡처 마이크로 해부 (LCM)

1. LCM, 15 분 동안 42 ° C에서 따뜻한 슬라이드에 건조 슬라이드 직전. 처리하고 준비가 될 때까지 얼음에 나머지를 저장한다 드라이 만 슬라이드.
2. LCM과 컴퓨터의 순서로, 현미경 전력, 레이저 키, 레이저 스위치 다음 컴퓨터를 켭니다. 레이저 이외에 Microdissection 소프트웨어를 실행합니다.
3. 슬라이드 및 수집 튜브를로드하기 위해 현미경을 제어하는​​ 소프트웨어를 사용합니다. 다음 "계속"을 클릭, "언로드 샘플 홀더"를 클릭하면 아래로 향하게 조직과 현미경 슬라이드 홀더에 섹션 슬라이드를로드하고 현미경의 해당 슬롯에 슬라이드 홀더를 삽입합니다.
   1. "언로드 수집 관", 레이블을 클릭하고 튜브 홀더에 0.5 ml의 튜브를로드 및 기기의 해당 슬롯에 삽입합니다. 일단캡 컬렉션 캡에 용해 버퍼의 35 μl를 추가하고 거품을 피하려고, 고정된다. 그런 다음 "확인"을 클릭합니다.
      참고 : 25 ㎕의 용해 완충액을 10 μL로 depcH2O : 증발이 문제가되어있는 경우에는 다음과 같이, 희석 완충액.
4. 소프트웨어에서 슬라이드가 슬라이드 홀더에 배치 된 위치를 선택합니다. LCM 표본을 수집하는 수집 캡을 선택합니다.
5. 시각화 및 10X에서 컴퓨터를 통해 슬라이드를 초점을 맞 춥니 다. 다음 "보정", "레이저"를 선택하여 레이저를 보정 소프트웨어를 사용합니다. 레이저 빔이 완전하고 효율적으로 선택된 영역을 절감 할 수 있도록, 레이저의 파워, 개구 수 및 속도 선택 "레이저"다음 "제어"를 조정한다. 완전히 조직을 통해 레이저 절단 될 때까지 조정을 반복합니다.
6. 가이드로 8 "X 11"병리학 마크 업 사용 epithe의 원하는 영역을 에워하기 위해 "모양을 그립니다"도구를 사용하여보기 lium과는 기질를 수집하지 마십시오.
   여러 영역이 하나의보기에서 선택 될 수 있지만 "모양을 잘라"도구를 클릭하여 제 1 절단하지 않고 다른보기로 이동하지 않습니다 있습니다.
   1. 영역이 완전히 레이저로 절단되지 않는 경우 수동으로 그 위에 이동합니다 "이동 잘라"도구를 사용합니다. 새로운 뷰에 목적을 이동 계속 슬라이드가 완전히 해부 또는 조직의 원하는 양이 수집 될 때까지 레이저 절단을 반복 (일반적으로 100 양성 땀샘은 RNA의 150-500 NG를 얻을). (그림 1A의 예 참조).
7. 조심스럽게 뚜껑에 용해 버퍼 및 조직 염두되고, 수집 홀더에서 튜브를 제거하고 뚜껑을 닫습니다. 간단히 튜브의 바닥에서 액체 및 조직을 수집하기 위해 30 초 동안 원심 분리. RNA 분리에 대한 준비가 될 때까지 -80 ° C에서 30 분 및 저장을 위해 42 ° C에서 샘플을 품어.

필 5. 전체 RNA를 분리터 기반 키트 및 품질 분석

1. 얼음에 튜브를 해동 100 μL로 용액의 부피를 가지고.
2. 필터의 중심에 30 μL ofLysis 용액을 도포하여 RNA 분리 키트의 마이크로 필터를 미리 적시고 그 다음에 두 단계 (적어도 5 분) whileperforming 침지 할 수있다.
3. 해물에 (키트에 제공) LCM 첨가제 솔루션의 3 μl를 추가하고 5 초 동안 소용돌이로 교반하여 혼합한다. 상기 튜브의 하단에있는 유체를 수집하기 위해 30 초 동안 원심 분리한다.
4. 액체를 제거하기 위해 최고 속도에서 30 초 ~에 대한 사전 젖은 필터를 원심 분리기.
5. 위아래로 부드럽게, 해물 혼합물에 소용돌이 또는 피펫을 100 % 에탄올 (이 경우 129 μL)에 1.25 볼륨을 추가합니다. **이 방법은 크고 작은 RNA 종을 모두 복구합니다.
6. 1 분 필터로 RNA를 결합하는 10,000 XG에서 사전 습윤 마이크로 필터 상에 샘플과 원심 분리기를로드합니다. 그런 다음 세척 용액 1, R "의 180 μL와 마이크로 필터를 세척(21); 1 분 10,000 XG에 원심 분리기.
   참고 : 모든 회 원심이 시점은 13,000 XG, 또는 최대 속도로 수행해야합니다에서.
7. 키트 프로토콜의 지시에 따라 세척은 각각 "세척 솔루션 2, 3"180 μL, 두 번 필터링 할 수 있습니다. 원심 분리 잔류 유체를 제거하고 필터를 건조 30 초 후, 플로우 스루를 폐기하고, 1 분 동안 스핀 필터.
8. 새 컬렉션 튜브 필터를 전송합니다.
9. (키트와 함께 제공) -95 ℃로 따뜻한 용출 솔루션입니다.
10. 필터의 센터로 예열 용출 용액 10 μL를 적용, 뚜껑을 닫고 실온에서 5 분 동안 저장한다. 이어서 RNA를 용출 한 분 동안 원심 분리 한 RNA ~ 20 μl를 수득이 단계를 한 번 반복한다.
11. 37 ° C에서 15 분간의 DNase I 처리를 수행한다.
12. 260 nm에서 흡광도와 분광 광도계에 의한 RNA를 정량화. 260 nm 내지 280 nm의 파장에서의 광학 밀도의 비의 순도를 평가하기 위해 이용된다RNA는 ¹⁵ (표 1 참조).

6. 유전자 발현 분석

참고 : (의 mRNA와 lncRNAs 등) 긴 RNA 종의 유전자 발현하는 것은 단계 6.1과 짧은 RNA 종 (마이크로 RNA 등)에 표시됩니다 단계 6.2에 표시됩니다. 다른 키트는 RT-qPCR에 사용할 수 있습니다 필요한 RNA의 양이 (10 NG로 적게) 키트에 따라 다릅니다. RNA 서열 분석은 6.3에 기재되어있다.

1. 역방향 스크립트 작성 (RT) 5 RT 마스터 믹스 μL (RT 완충액의 dNTP의 랜덤 프라이머, RT 효소, RNA 분해 효소 억제제) 20 ng의 5 μL / RNA 샘플 μL를 혼합하는 cDNA에 RNA. 37 ℃에서 120 분 후, 25 ° C에서 25 분 동안 인큐베이션하고, 반응을 85 ° C에서 5 분.
2. 의 RNase 무료 물 RT 반응 1:10 희석과 관심의 유전자에 대한 프라이머 또는 프라이머 / 프로브 세트 10 μL qPCR에 반응 당 2.5 μL를 사용합니다.
   주 : 부분적으로 저하 RNA의 분석을 용이하게하기 위해이 fo를 프라이머를 사용하는 것이 바람직하다R 짧은 증폭 (이하 100 BP) ^16. (표 2B)
   1. 마이크로 RNA 발현 분석을 위해 RT 마스터 믹스의 5 μL로 2-10 NG의 5 μL / RNA 샘플 μL를 혼합하여 RT 반응을 실행.
      주 : 각 시판의 PCR 기반 마이크로 RNA 탐지 기술은 특허 특정 RT 프라이머의 사용을 필요로한다.
3. 대안 적으로 또는 RT-PCR에 더하여, RNA를 상이한 종을 정량화하기 위해 차세대 시퀀싱 (RNA-SEQ 또는 작은 RNA-SEQ)를 사용한다. 일반적으로,이 절차 (표 3)에 대해 500 ng의 RNA를 사용하여 제조 및 검출기구에 의해 지시 된 바와 같이 방법을 수행.

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결과

이전 연구에서 우리는 동일한 환자 ^(4)로부터 냉동 FFPE 전립선 조직에서의 mRNA 및 마이크로 RNA의 RT-qPCR에 의해 발현 프로파일을 비교하는 상피 및 간질 조직을 수집하는 LCM의 사용을 설명했다. LCM은 RNA의 다량 차세대 염기 서열 분석을 위해 수집하는 경우 특히, 시간 소모적이다. 따라서, 작업 공간을 유지하는 것이 중요하며 툴 무연의 RNase. 그것은 (다음 단락에서 자세히 설명) 수집 RNA의 ?...

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토론

표본에서 인간 유전자 발현 프로파일 링이 가능 품질 또는 조직의 수량뿐만 아니라, 주어진 조직 표본에 존재하는 다양한 조직 학적 엔티티뿐만 아니라, 도전 일 수있다. 이것은 양성 조직은 주로 간질 조직 및 암 영역이다 기질 결여 된 전립선에 특히 도전적이다. LCM은 두 개의 서로 다른 유형의 세포 (도 1A)의 더 정확한 서명 전립선 상피와 기질 RNA의 물리적 분리를 용이하게한다. mac...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNase-AWAY	MBP	7005-11
PEN-membrane 4.0 mm slides	Leica	11600289
Glass slides, Superfrost Plus	FisherBrand	12-550-15
Ethanol 200 proof	Decon labs.	2701
DEPC (diethyl pyrocarbonate)	Sigma	D-5758
Cryostat	Leica	CM3050
Coplins (Staining jar)	IHCWORLD	M900-12
Coplins (Staining rack)	IHCWORLD	M905-12
Aperio ScanScope	Aperio(Leica)	ScanScope® CS
Toluidine Blue	Fluka	89640-5G
Laser Microdissection System	Leica	LMD7000
0.5 ml Thin-walled Tubes for LCM	Thermo Scientific	AB-0350
RNAqueous®-Micro Total RNA Isolation Kit	Ambion	AM1931	Thermo Fisher Scientific Brand
NanoDrop	Thermo Scientific	ND-1000
Qubit 2.0 Fluorometer	Life Technologies	Q32866	Thermo Fisher Scientific Brand
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4368814	Thermo Fisher Scientific Brand
Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns	Exiqon	203301
TaqMan microRNA RT kit	Applied Biosystems	4366597	Thermo Fisher Scientific Brand
Hematoxylin stain	Ricca Chemical Company	3536-16
Eosin-Y	Richard Allan Scientific	7111