효율적인 포유 동물 세포 발현 및 결정화에 대한 세포 외 당 단백질의 단일 단계 정화

요약

This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.

초록

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.

서문

원자 수준에서 단백질의 구조를 이해하는 것은 생물학적 경로와 질병의 분자 기반을 폭로의 핵심입니다. X 선 결정학은 단백질 거대 분자의 구조를 결정하기위한 가장 널리 사용 / 적용 가능한 방법이다. 이 방법의 가장 큰 문제는 제대로 접혀, 순수한 단백질의 충분한 양을 얻을 수있다. 특히 특정 번역 후 수정을 거쳐 분비 포유류 단백질, 작업 문제가된다.

세균 발현 단백질은 단백질 데이터 뱅크 ^1에서 증착 된 결정화 된 단백질의 주요 원이다. 그들은 저렴하고, 빠르고 일반적으로 단백질의 높은 수율을 생산하기 때문에 세균 발현 시스템은 크게 바람직하다. 그러나, 박테리아에서 발현 포유류 단백질의 세포 외 도메인은 종종 제대로 fo를 균일하게 얻기 위해하는 경우 폴딩 및 광범위한 정화 단계가 필요, 접힌되지 않습니다lded 단백질. 또한, 많은 포유류 단백질은 적절한 폴딩 ^2를 달성하기 위해 번역 후 당화가 필요합니다. 효모 또는 곤충 세포에서의 발현은 글리코 실화 및 접힘 문제를 극복 할 수 있지만, 당화 포함 번역 후 변형은, 부정확 한 또는 불균일 한 변형을 가진 단백질을 수득 포유류 세포 ^(3)의 것과 크게 다르지.

포유 동물 세포가 적절한 번역 후 변형 및 폴딩을 위해 필요한 모든 분자 기계를 표현; 그러나, 이러한 발현 시스템은 전형적으로 제한 수율 및 시약 및 소모품의 높은 비용, 대부분의 실험실에서 바람직하지 않다. 폴리에틸렌 이민 (PEI)는 표준 트랜 스펙 션 시약을 비교적 염가이지만 상당한 독성, 낮은 형질 감염 효율, 셀 매체, DNA의 비용 상승을 초래하고 장비의 배양을 부과한다. PEI에 많은 대안이 엄청나게 비싸다. 우리는 해결개선 된 세포 배양 용 도구의 조합을 나타내는 화학적, 단일 단계 정제 한 후, 분비 된 포유 동물 단백질의 발현을위한 신속하고 비교적 저렴​​한 방법에 대한 PEI를 수정함으로써 이러한 문제. 이 방법은 강력한 기능, 생화학 적 연구 ⁴ 충분한 수율을 제공하고, 어떤 경우에는, 추가의 정제없이 결정화 의무가 단백질을 초래한다.

이 프로토콜은 표현을 극대화하고 정지에서 재배 인간 배아 신장 (HEK)에서 분비 포유류 단백질 293F 세포 산출하기 위해 여러 가지 기술에 대해 설명합니다. 형질 전환 효율 (비용), 단백질 생산 및 정제 모두 크게이 프로토콜에 따라 향상됩니다. 단일 단계의 개환 반응을 통해 카바 메이트의 추가에 의해 변형 된 PEI는 (PEI-TMC-25, REF ^5에 상세히 설명 합성 및 특성)을 크게, 트랜 스펙 션 효율을 향상 양이온으로부터 세포 독성을 줄여따라서 막 중단 및 실험 비용을 절감 할 수 있습니다. 또한, 세포 생존 및 단백질 발현이 크게 포도당과 비타민 공급 배양 보조제의 첨가로 향상된다. 중요한 kifunensine와 당화 단백질, 치료의 제조, 만노 I의 비 독성 화학 억제제, 대신에 단일 N 아세틸 글루코사민으로 단백질을 수득 엔도 글리코시다 제의 EndoHf에 의해 제거 될 수있다 정의 미성숙 글리 칸으로 단백질을 생산 전체 길이가 ⁶ 글리 ^칸을 N- 결합. 마지막으로, 혈청, 화학적 매체에 단백질의 분비는 구조적, 생화학 적 연구에 대한 신속하고 손쉬운 정화를 할 수 있습니다. 단일 단계 니켈 니트릴 로트리 아세트산 (NTA 니켈) 수지의 정제는 경우에 따라, 결정화를 위해 충분한 순도의 단백질을 얻을 수 있고, 상징액의 종 및 오염의 대부분을 제거한다.

프로토콜

대규모 과도 형질에 대한 플라스미드 DNA의 밀리그램 수량 1. 생산

1. 제한 부위 클로닝, 또는 다른 적절한 기술을 사용하여 높은 카피 수 포유 동물 발현 벡터에 목적 단백질을 복제.
   1. 최적의 결과를 가지고 pHLsec ⁷ 벡터를 사용하는 내장 된 C- 말단 6His 태그, 강력한 프로모터 코작 순서 및 최적화 분비 신호.
2. 적격 세포에 플라스미드를 변형.
   1. 플라스미드 DNA의 1 μg의 관할에 대장균의 20 μl를 첨가하고 30 분 동안 얼음 위에서 배양한다.
   2. 42 ℃에서 열 쇼크 셀 35 초 후, 2 분 동안 얼음 위에서 배양한다.
   3. 미생물 성장 매체 (SOC)의 300 μl를 추가하고 220 rpm으로 떨고, 45 분 동안 37 ° C에서 품어.
   4. 적절한 항생제 선택과 한천 플레이트에 플레이트 세포.
      1. 플라스미드 pHLsec 벡터의 경우 100 μg의 / mL의 카르 베니 실린을 사용하여.
3. 루리아 국물 (LB) 미디어 250 ml의 문화 식민지는 220 rpm으로 흔들어, 37 ° C에서 100 μg의 / ㎖ 항생제 (카르 베니 실린) O / N로 보충.
4. 제조 업체의 프로토콜에 따라 고속 플라스미드 맥시 키트를 사용하여 문화의 DNA를 정화.
   1. 대신 버퍼 TE의 버퍼 EB (10 mM 트리스 - CL, 산도 8.5)에서 DNA를 용출.
   2. -20 ° C에서 형질 전환 및 저장에 필요한 양의 정제 된 플라스미드를 나누어지는.

293F 세포의 2. 대규모 문화와 과도 형질

1. 10 글루타민 ㎖의 5 ml의 펜 / 연쇄상 구균 (둘 다 100 배)와 보충 1 L 293F 미디어. 4 ℃에서 보관하십시오. 5 ㎖ 펜 / 스트렙토 단백질 수율을 향상 무 혈청 조건으로 환원 항생제 농도가 형질 중에 세포 생존을 개선에 충분한 강도이다.
2. 1 리터의 폴리 카보네이트 300 ml의 미디어 문화 293F 세포는 배출 캡으로 삼각 플라스크를 당황8 % CO _2와 37 ° C에서의 표준 조직 문화 인큐베이터에 떨고있다.
3. 세포에 5 × ¹⁰⁵ / ㎖ 밀도 형질 전에 하루 희석.
4. 293F 세포 미디어 부스트 V / w 2 %의 10 % 부피를 첨가하여 형질 감염, 보충 배지 날.
   1. 500 밀리그램 / dL로의 글루코스 농도를 달성하기 위해 필요에 따라 제조자의 지시 및 사용에 따른 보충 글루코스 모니터를 이용하여 글루코스 농도를 측정한다.
5. 단백질 당화을 제어하는​​이 단계에서 kifunensine (1 μg의 / ml의 최종 농도)를 추가합니다.
6. DNA의 계산 볼륨 1 × 10 ⁶ 세포 당 1 μg의 플라스미드 필요합니다. 멸균 조건하에, 5 ㎖의 무 혈청 배지에서 희석 DNA.
7. 형질 전환 시약 μL 2 당 1 μg의 플라스미드에 필요한 형질 전환 시약의 양을 계산합니다. 멸균 조건하에, 5 ㎖의 무 혈청 배지에서 형질 전환 시약 (PEI-TMC-25)를 희석한다.
8. 더하다1 ml의 단위로 DNA 용액으로 형질 전환 시약, 부드럽게 혼합. 형성 시약-DNA 복합체에 대한 RT에서 30 분 동안 배양한다. 이어서 적가 방식으로 셀에 용액을 추가한다.
9. 형질 세포는 72-96 시간 동안 단백질을 발현하도록 허용합니다. ~ 10 % 볼륨 셀 부스트 매일 미디어, 또는 필요에 보충은 혈당이 400 ~ 600 밀리그램 / DL을 읽고 유지합니다.

3. 정제

1. 세포를 펠릿 화하고 상층 액을 수집 1,300 XG에서 20 분 동안 원심 분리기로 원심 분리 플라스크 배양을 경사 분리한다. 필요하다면, 두 번째 회전 및 / 또는 상등액을 명확히 0.22 μm의 필터를 사용한다.
2. 10 %의 10 배 부피의 Ni-NTA 추가 결합 완충액 (1.5 M의 NaCl, 0.5 MK ₂ HPO _4, 0.1 M 트리스 pH가 8.5, 50 mM의 이미 다졸).
3. 열에서의 Ni-NTA 슬러리 2 ㎖를 추가하고 1X 바인딩 버퍼의 10 열 볼륨 (CV)로 평형화하여 중력 열을 준비합니다. 가능하면, 4 ° C를 방에서 모든 열 단계를 수행. Alternativ엘리, 진정 단백질 및 열 단계 전에 얼음에 모든 버퍼 및 단백질을 유지하고 수집 흐름을 통해 얼음에.
   주 : 니켈 NTA 슬러리를 50 체적 %의 수지 및 제조의 명시 결합능은 50 ㎎ / ㎖이다. NI-NTA 비드 여러 용도로 재충전 될 수있다
4. 수지 위에 뜨는 흐름과 흐름을 통해 수집합니다. 이 단계를 반복합니다.
5. 세척 버퍼의 10 CV로 세척 (300 mM의 염화나트륨, 50 mM의 K ₂ HPO _4, 20 mM의 이미 다졸 산도 8).
6. 용출 완충제 5 CV로 단백질을 용리 (300 mM의 염화나트륨, 50 mM의 K ₂ HPO _4, 250 mM의 이미 다졸의 pH 8).
7. 경우 탈 글리코 실화가 필요합니다 :
   1. 0.5 ㎖의 최종 부피를 위해, 원심 분리 농축기를 이용하여 0.43 ml의 용출액을 농축시킨다. 양식을 침전 경우, 16,000 XG, 4 ℃에서 원심 분리하여 이물질을 펠렛.
   2. 500 밀리미터 나 - 구연산 산도 5.5의 50 μl를 추가합니다.
   3. EndoHf (1 × ¹⁰⁶ U / ㎖)의 20 μl를 추가합니다. 2 시간 동안 실온에서 품어.
      아니E : 효소는 농축 된 단백질이 응집시킬 수있는, 37 ℃에서 최적으로 작동합니다. SDS-PAGE 또는 면역 탈 글리코 실화에 의해 평가가 불완전한 경우, RT 배양을 연장한다. 효소는 4 ° C에서 활동이 없습니다.
   4. 인산염 완충 식염수 (PBS) 또는 최종 저장 버퍼에 세척 아밀로스 수지 배 : EndoHf를 제거하십시오. 4 ℃에서 1 시간 동안 수지와 단백질을 품어. 구슬 펠렛 상층 액을 수집하기 위해 1,000 XG에서 5 분 스핀.
   5. 적절한 분획 분자량 원심 분리 필터를 이용하여 단백질을 농축시키고, 저장 버퍼 (150 mM의 염화나트륨, 20 mM의 HEPES pH를 7.5)로 교환 버퍼.

결과

본원에서 골수 세포를 2 (hTREM2 잔사 19부터 1백32까지)에 발현 인간 단백질 트리거링 수용체로부터 분비되는 13 kDa의 면역 글로빈의 (IG)에인가 도메인이 발현 시스템의 결과에 따른다. TREM2 두 개의 이황화 결합 및 N - 결합 글리코 실화 부위를 갖는 단일 IG 세포 외 도메인을 함유하는 I 형 막 횡단 단백질이다. 다른 많은 IG 도메인 단백질 ^(8)과는 달리, TREM2 세균 봉입체 ^(9)에서 접힘 의?...

토론

HEK 293F 세포는 번역 후 변형을 필요로하는 단백질의 강력한 생산을 제공한다. 이 시스템은 이황화물, 당화, 그렇지 않으면 더 일상적인 표현 도구를 사용하여 결석 것 인산화를 포함 기본적으로 접힌 단백질의 신속하고 확장 가능한 표현을 할 수 있습니다. 또한,이 시스템은 단순히 여러 플라스미드의 공동 형질 감염에 의해 발현 및 다중 단백질 복합체의 정제를 위해 사용될 수있다. TREM2 외에도,?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture Flasks	GeneMate	F-5909B
293 Freestyle Media	Gibco/Life Technologies	12338-018
GlutaMAX	Gibco/Life Technologies	35050-061	Use in place of Glutamine
Hype 5 transfection reagent	Oz Biosciences	HY01500
293fectin transfection reagent	Life Technologies	12347019
PEI transfection reagent	Sigma-Aldrich	408727
Maxiprep Kit	Qiagen	12162
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430
Endo Hf	NEB	P0703L
Amylose Resin	NEB	E8021S
Cell Boost R05.2	HyClone	SH30584.02	Cell Culture Supplement
GlucCell	CESCO Bioengineering	DG2032	Glucose Monitoring System
Opti-MEM	Life Technologies	519850.91	Serum Free Medium for DNA transfection
Luria Broth (LB Media)	Life Technologies	10855-001
GC10 Competent Cells	Sigma-Aldrich	G2919