식물에서 물고기에 적합한 빠른 공기 건조 떨어 뜨리 염색체 제조 방법

요약

A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.

초록

염색체 스프레드의 제조 현장 하이브리드에 형광의 성공적인 성능 (FISH)을위한 전제 조건이다. 높은 품질의 식물 염색체 스프레드의 준비로 인해 단단한 세포벽에 도전한다. 식물 염색체의 제조를위한 승인 방법 중 하나는 소위 드롭 제제, 또한 드롭 확산 또는 공기 - 건조 기술로 알려져있다. 여기, 우리는 유사 분열 염색체의 빠른 준비를위한 프로토콜은 단일 및 높은 사본 DNA 프로브의 물고기 검출에 적합한 확산 제시한다. 이 방법은 50 % -55 %의 상대 습도 하에서 수행 풍건 드롭 방식의 개선 된 변이체이다. 이 프로토콜은 그 적용이 쉽고 효율적이고 재현하게 세척 단계의 감소 된 수를 포함한다. 이 방법의 명백한 이점은 성공적인 FISH 분석을위한 완벽한 전제 조건으로서 잘 확산, 손상되지 않은 수많은 중기 염색체이다. 이 프로토콜을 이용하여, 우리는 높은 품질을 얻을 CHROMosome 스프레드와 Hordeum vulgare의, 수평 bulbosum, 수평 marinum, 수평 murinum, 수평 pubiflorum 및 Secale의 cereale에 대한 재현 물고기 결과.

서문

계내 혼성화 (FISH)의 형광은 염색체 수준에서 단일 및 높은 복사 서열의 물리적 맵핑에 대한 효과적인 도구이다. 전제 조건은 높은 품질의 염색체 스프레드의 준비입니다. 동물과 식물 세포에 대한 동등하게 적합 할 것이 더 일반적인 염색체 준비 프로토콜이 없습니다. 식물 염색체의 준비로 인해 다른 종 내에서 단단한 세포벽과 각종 세포질의 일관성에 특히 도전이다. 식물 염색체의 제조를위한 바람직한 방법 중 하나는 드롭 확산 기법 및 공기 - 건조 기술로 알려진 ^1,2 소위 드롭 기술이다. 이 방법은 처음 체외 성장 포유 동물 세포 ³ Rothfels과 Siminovitch에 의해 1958 년에 도입되었다. 나중에 마틴 등 알. ⁴ 카토 등. ^5는 식물이 방법을 적용.

최근 방법이라는 'SteamDrop &# 39; 비 중첩 염색체 ^(6)의 제조에 수증기를 사용하는 개발되었다. 높은 습도의 긍정적 인 영향은 이전 관찰되었지만 ⁷ 'SteamDrop'는 고품질 염색체 제제 ^(6)의 제어 흐름을 제공한다. 증기 처리는 아마도 염색체 단백질의 일부​​ 수정에 접속 염색체 연신시킨다. 전체 중기의 충분한 수의 고정 후속 물고기 실험은 기술적 인 전문 지식을 필요로 확산 있지만 중기 스프레드 결과의 품질은 매우 높다.

여기에서 우리는 단일 및 높은 사본 프로브 ^5,8의 물고기 검출에 적합한 유사 분열 시리얼 염색체의 제조를위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 카토 50 % -55 %의 상대 습도 하에서 수행 ⁽⁹⁾ (도 1)에 의해 설명 풍건 적하 법의 개선 된 변이체이다. 이 프로토콜은 감소 된 수를 포함그 적용이 쉽고 효율적이고 재현하게 세척 단계. 우리가 Hordeum vulgare의, 수평 bulbosum, 수평 marinum, 수평 murinum, 수평 pubiflorum 및 Secale의 cereale 높은 품질의 염색체 확산과 물고기 결과를 얻었다이 프로토콜을 사용.

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프로토콜

1. 염색체 준비

1. 종자 발아 및 뿌리 끝의 고정
   1. 22 ~ 24 ℃에서 2 일간 어두운 조건에서 배양 접시에 촉촉한 필터 종이의 두 층에 10 ~ 20 보리 씨앗을 발아. 면도날을 사용하여 시드로부터 1-2cm의 길이 격렬한 뿌리 잘라.
   2. 분쇄 된 얼음 - 물에 차가운 수돗물을 함유하는 500 ㎖의 유리 병을 배치하여 빙 냉수를 준비한다. 빙 냉수를 폭기 및 중기 세포의 빈도를 증가시키기 위해 20 시간 동안 뿌리 끝 부분을 넣는다.
   3. 50ml의 에탄올에 물을 뿌리 전송 : 아세트산 (3 : 1)을 고정 제 2 일 동안 실온에서이를 해결하기 위해. 갓 준비 에탄올에 보관 뿌리 : 아세트산 (3 : 1) 4 ° C에서 정착 년까지 사용할까지.
2. 세탁 효소 처리
   1. 5 분 50 회 mL 유리 비커를 사용하여 30 mL의 얼음처럼 차가운 수돗물로 씻어 뿌리 10-20. 쌍안 현미경을 사용합니다. 에 의해 뿌리 하나를 전송30 mL의 0.01 M 시트 레이트 완충액 (+ 0.01 M 시트르산 나트륨, 0.01 M 시트르산, pH를 4.8) 겸자를 사용하여 5 분 동안 두번 유리 비커를 흔들어 씻는다. 완전히 액체를 제거하고 차단 원하지 않는 비 분열 조직을 면도날을 사용하여 필터 종이에 뿌리를 놓습니다.
   2. 시계 접시로 식물 조직을 부드럽게 약 50 분 (표 1), 37 ° C에서 1 ㎖의 효소 혼합물에 20 뿌리 끝까지 배양한다. 효소 혼합물 0.01 M 구연산 버퍼에 희석 0.7 % 셀룰라아제 R10, 0.7 %의 셀룰라아제, 1 % pectolyase과 1 % cytohelicase가 포함되어 있습니다. -20 ℃에서 효소 혼합물을 저장하고 다섯 번까지 재사용.
   3. 피펫으로 효소를 제거하고 잔류 효소를 대체하기 위해 두 번 5 ml의 0.01 M 구연산 버퍼와 얼음에 뿌리 끝을 씻는다.
3. 루트 침용
   1. 두 번주의 깊게 같은 시계 접시에 1 ml의 96 % 에탄올로 세척 루트 팁. 갓 준비 고정액 (25 % 에탄올 75 % 아세트산)와 에탄올을 교체합니다. 10 ~ 15를 사용하여루트 팁 당 μL 정착.
   2. 해부 바늘이나 집게로 2 ML 튜브에 정착와 함께 전송 루트 팁과 분해 루트 분열 조직. 세포 현탁액을 얻기 위해 세포를 다시 중단 튜브 20 번 눌러. 2 개월 -20 ° C 최대의 세포 현탁액을 저장합니다.
4. 세포 현탁액의 적하
   1. 50 ° C에서 뜨거운 접시에 물을 적신 종이 조직의 2 ~ 3 층을 놓습니다. 30 분 동안 냉장고에 얼음처럼 차가운 수돗물에 현미경 슬라이드를 담가. 장소는 축축한 종이 티슈 위에 슬라이드.
   2. 피펫 7-10 세포 현탁액의 μL와 핫 플레이트에 배치 된 냉각 슬라이드에 20cm의 거리에서 드롭합니다. 피펫 (10) 슬라이드에 세포 현탁액과 같은 장소에 아세트산 - 에탄올 혼합물의 μL 및 추가 2 분 동안 핫 플레이트에 슬라이드를 유지. 물티슈없이 핫 플레이트에 슬라이드를 배치하고 1 분 동안 건조 할 수 있습니다.
5. 품질 관리 및 스토리지 박슬라이드의 전자
   1. 염색체 스프레드의 품질을 제어하는​​ 위상차 현미경을 사용하여 슬라이드를 확인한다. -20 ° C에서 코 플린 항아리에 96 %의 에탄올에 침지하여 같은 날 또는 저장 중 슬라이드를 사용합니다.
6. 물고기 전에 슬라이드 전처리; 모든 단계는 실온에서 수행
   1. 배 SSC의 50 ㎖를 포함하는 코 플린 항아리에 넣어 슬라이드 5 분 (20 배 SSC는 3 M의 NaCl 300 MM의 트리 소듐 시트 레이트를 포함). 3-10 분 동안 45 % 아세트산 50 ㎖를 함유하는 코 플린 항아리 집게, 이전 슬라이드를 사용.
   2. 전달은 10 분 동안 2 배 SSC 50 ㎖를 함유하는 코 플린 항아리에 슬라이드. 10 분 동안 (2 × SSC)에 4 % 포름 알데히드의 50 ㎖를 포함하는 코 플린 항아리로 전송 슬라이드 빠져들게 슬라이드 염색체를 해결하려면.
   3. 50 ml의 2 배 SSC를 포함하는 코 플린 항아리, 4 분 각각의 슬라이드 3 회 세척하여 포름 알데히드를 제거합니다. 수직에서 70 %의 시리즈에서 2 분, 90 %, 100 % 에탄올, 각각 건조 슬라이드의 코 플린 항아리에 슬라이드를 탈수위치.

제자리 하이브리드 2. 형광 (물고기)

1. 각 슬라이드에 대해, 탈 포름 아미드 10 μL, 4X 혼성화 완충액 5 μL를 사용하여 총 20 μL의 혼성화 용액을 제조 하였다 (200 ㎕를 완충액 80 ㎕의 20 배 SSC, 8 ㎕의 1 M 트리스 -HCl pH가 8.0를 포함 1.6 ㎕의 0.5 M EDTA, 11.2 μL 10 μg의 / μL 연어 정자와 99.2 μL의 DNase를없는 물), 프로브의 3 μL와 DNase를없는 물 2 μL.
2. 24 X 32mm 커버 슬립과 슬라이드 커버 당 혼성화 용액 20 μl를 추가하고 고무 시멘트와 커버 슬립을 체포. 핫 플레이트에서 2 분 동안 80 ℃에서 프로브와 동시에 슬라이드 변성.
3. 전송 습기 챔버에 슬라이드와 37 ° CO / N 피 빛 슬라이드를 품어. 배 SSC와 코 플린 항아리에 슬라이드를 세척하여 커버 전표를 제거합니다. 그리고 55-60 ° C의 2 배 SSC를 포함하는 코 플린 항아리에 넣어 슬라이드 20 분 동안 품어.
4. 실온에서 2 분 동안 코 플린 항아리에 SSC를 2 배 슬라이드를 놓습니다. 각각 70 %, 90 %, 100 % 에탄올, 일련의 2 분 동안 코 플린 항아리 슬라이드 탈수.
5. 강렬한 빛을 방지, antifade 설치 매체에 / ㎖ 4 ', 6 diamidino-2-phenylindoline 1 μg의 (DAPI)과 슬라이드와 Counterstain과를 공기 - 건조.

3. 현미경 분석 및 저장

1. 표면 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 분석한다. 필터의 선택은 라벨 프로브 형광 색소 사용에 의존한다. 필요한 경우, 1 년까지 어두운 조건에서 4 ° C에서 저장 슬라이드.

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결과

유사 분열 중기 스프레드 현미경 슬라이드는 전술 빠른 공기 건조 적하 염색체의 제조 방법에 의해 제조 하였다 (SUPPL.도 1). FISH 분석은 모두, 반복적이고 단일 - 카피 시퀀스를 사용하여 수행 하였다. 이미지는 대응하는 형광체의 여기를 가능 필터 세트 표면 형광 현미경에 의해 얻은 고감도 CCD 흑백 카메라에 의하여 촬영되었다. 화상 획득을 위해 우리는 화상 취득 소프트웨어가 설치...

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토론

염색체 준비 실험 잔디 가족 (벼과)에 속하는 시리얼 어린 뿌리를 이용하여 수행되었다. 모든 분석 종은 이배체 게놈 세트 14 상대적으로 긴 유사 분열 중기 염색체 (11 ~ 15 μm의)가 큰 게놈 종 (5.1-7.9 GBP)에 속한다.

발아 한 뿌리의 길이가 세포 분열 조직의 최대치를 얻기 위해 2 cm 이상이 아니었다. 분열하는 세포의 동기화 유사 분열 중기의 수량이 ^{10 퍼} 향상 20 시간 긴 ...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hot Plate	MEDAX GmbH	12603
Cellulase R10	Duchefa	C8001
Cellulase	CalBioChem	219466
Pectolyase	Sigma	P3026
Cytohelicase	Sigma	C8274
Texas Red-12-dUTP	Invitrogen	C3176	direct fluorochrome
Fluor488-5-dUTP	Invitrogen	C11397	direct fluorochrome
Fluorecsence microscope	Olympus BX61	BX61
CCD camera	Orca ER, Hamamatsu	C10600
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Vector Laboratories	H-1200	fluorecsent dye