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요약

게놈 대상 분자의 직접적인 목표를 확인하는 것은 중요한 과제로 남아. DNA 결합 분자 게놈 참여 방법을 이해하기 위해, 우리는 염색질을 분리하는 작은 분자의 가교에 의존하는 방법 (COSMIC)을 개발.

초록

게놈은 가장 효과적인 화학 요법 제의 일부의 목표이지만, 이러한 약물의 대부분은 투여 량 - 제한 독성 많은 부작용을 초래 DNA 서열 특이성을 결여. 서열 - 특이 소분자와 게놈 타겟팅 증가 된 치료 지수 적은 표적 이탈 효과 분자를 가능하게 할 수있다. N의 -methylpyrrole / N -methylimidazole 아미드 합리적 절묘한 정밀도로 특정 DNA 서열을 대상으로 설계 될 수 분자이다. 그리고 가장 자연스러운 전사 인자와는 달리, 폴리 아미드는 친 화성의 손실없이 메틸화 및 chromatinized DNA에 결합 할 수 있습니다. 폴리 아미드의 서열 특이도는 광범위하게 동족 사이트 식별 (CSI)와 체외에서 전통적인 생화학 및 생물 물리학 적 방법으로 연구되어 왔지만, 세포의 게놈 대상에 결합 폴리 아미드의 연구는 애매 남아있다. 우리는 방법을보고 여기서, 작은 분자의 가교하는 졸라테 염색질 (COSMIC은), 즉 게놈에 걸쳐 폴리 아미드 결합 부위를 식별합니다. COSMIC는 염색질 면역 (칩)와 유사하지만, 두 가지 중요한 방식에서 차이 : photocrosslinker은 선택적, 시간적으로 제어되는 아미드 결합 이벤트 캡처, 및 (2) 비오틴 친화력 핸들 아미드를 정화하는 데 사용을 가능하게하는데 사용된다 (1) 반 변성 조건에서 -DNA 복합체가 아닌 공유 결합 인 DNA를 감소시킵니다. COSMIC는 폴리 아미드 및 다른 게놈 표적 항암제의 게놈 전체의 결합 이벤트를 나타 내기 위해 사용될 수있는 일반적인 전략이다.

서문

정보는 인간의 몸에있는 각 셀은 DNA로 인코딩하게한다. 정보의 선택적 사용은 세포의 운명을 관장. 전사 인자 (TFS)의 게놈에서 유전자의 특정 서브 세트를 표현하는 특정 DNA 서열에 결합하는 단백질이고, TF가의 오동작 발육 불량, 암, 당뇨병을 포함한 질병의 광범위한 배열의 발병에 연결되어 . 1, 우리는 선택적으로 유전자에 결합하여 유전자 조절 네트워크를 조절할 수 분자를 개발에 관심이 있었다.

폴리 아미드는 N 개의 -methylpyrrole 구성 및 N 라이벌 자연 전사 인자. 3-6이 분자가 DNA의 작은 홈에 특정 서열에 결합 특이성과 친화력을 가진 DNA를 타겟팅 할 수 있습니다 분자를 -methylimidazole 합리적으로 설계되어있다. 4,5,7 -11 폴리 아미드를 모두 억제하는데 사용될 특정 g의 발현을 활성화 된ENES. 4,12-19은 또한 흥미 20-24 항 바이러스 및 항암 12,13,25-30 특성을 갖는다. 폴리 아미드의 하나의 매력적인 기능은 (31, 32)을 메틸화와 히스톤 단백질 9,10,33 감싸되는 DNA 서열에 액세스 할 수있는 능력이다.

DNA 결합 분자의 광범위한 결합 특이성을 측정하기 위해, 우리의 실험은 34-39 체외 특이성 (genomescapes)에 기초하여 결합 부위의 예측 된 발생 게놈 상에 표시 될 수있다. 동족 사이트 식별자 (CSI)에있어서 생성하기 때문에 체외에서 결합 강도가 협회 상수에 직접적으로 비례한다 (K). 34,35,37이 genomescapes는 게놈에서 폴리 아미드 점유율에 대한 통찰력을 제공하지만, 살아있는 세포에 결합 측정 폴리 아미드 도전하고있다. DNA는 단단히 결합 부위의 접근성에 영향을 미칠 수있는 핵에 포장된다.폴리 아미드 이러한 chromatinized DNA 서열의 ccessibility은 신비에 남아있다.

최근, 많은 방법이 등장 작은 분자와 핵산 사이의 상호 작용을 연구. 40-48을 화학적 친 화성 캡처 및 대규모 병렬 염기 서열 (화학-서열은) 하나의 기술이다. 화학 - 서열은 리간드 - 타겟 상호 작용을 캡쳐하는 관심 대상 유전자와 명소 소분자의 비오틴 유도체 작은 분자를 가교하는 포름 알데히드를 사용한다. 48,49

포름 알데히드 가교는 오탐 (false positive)을 생성 할 수 있습니다 간접적 인 상호 작용에 연결됩니다. (50) 우리는 새로운 방법, 작은 분자의 가교이 소위 "팬텀"피크를 제거하기 위해 photocrosslinker와 염색질 (COSMIC), (51)을 분리한다. (50)을 시작하려면를 개발, 우리는 설계 및 폴리 아미드의 관능 성 유도체를 합성. 이들 분자는 DNA 결합 POL 포함yamide, photocrosslinker (소 랄렌)과 친 화성 핸들 (비오틴, 그림 1). 관능 폴리 아미드, 우리는 공유. 365 nm의 자외선 조사, DNA 손상되거나 비 랄렌 계 가교를 유발하지 않는 파장을 갖는 폴리 DNA 상호 작용을 캡처 (51) 다음으로, 우리는 엄격한 반 하에서 캡처 DNA를 게놈 단편화 및 정제 -denaturing 조건이 아닌 공유 결합 인 DNA를 감소시킵니다. 따라서, 우리는 화학-SEQ 관련된 방법으로서 COSMIC 볼하지만 DNA의 직접적인 판독 타겟팅. 중요한 것은, 약한 (K 10 세 -10 4 M-1) DNA에 대한 소 랄렌의 친화력은하지 않습니다, 검출 충격 폴리 아미드 특이성. (51, 52) 농축 DNA 절편이 정량적 중합 효소 연쇄 반응 (51) 중 하나에 의해 분석 될 수있다 (COSMIC-qPCR에) 또는 차세대 시퀀싱 (53) (COSMIC-SEQ)에 의해. 이러한 데이터는 리간드의 편견, 게놈 안내 디자인을 사용하는 것이 간자신의 원하는 게놈 궤적 행동 및 오프 - 타겟 효과를 최소화 할 수 있습니다.

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그림 1. 생리 활성 폴리 아미드 및 COSMIC 계획. (A) 폴리 아미드 머리핀 (가) 1 - 2 타겟 DNA 서열 5'-WACGTW-3 '. 선형 폴리 아미드 3-4 목표 5'-AAGAAGAAG-3 '. N 메틸이 미다 졸의 반지는 명확성을 위해 굵은있다. 열고 채워진 원은 각각 N 개의 -methylpyrrole 및 N의 -methylimidazole을 나타냅니다. 스퀘어 -3- 클로로 티를 나타내고, 다이아몬드 β 알라닌을 나타낸다. 소 랄렌 및 비오틴은 각각 P 및 B로 표시된다. (B) COSMIC 계획. 세포는 폴리 아미드의 관능 성 유도체로 처리됩니다. 365 nm의 자외선을 조사하여 가교 한 후, 세포는 L 아르ysed 및 게놈 DNA는 전단된다. 스트렙 타비 딘 - 코팅 자석 구슬은 폴리 아미드-DNA 부가 물을 캡처하는 추가됩니다. DNA가 해제되고 정량 PCR (qPCR에) 또는 차세대 시퀀싱 (NGS)에 의해 분석 될 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

프로토콜

라이브 세포 1. 가교

  1. ~에 웰당 2.5 7 H1 세포, 또는 다른 배양 세포로 시작합니다.
    참고 : H1 셀이 숫자는 5 ~ 10 cm의 요리 (약 40 % 컨 플루)에 해당합니다.
  2. 다 능성 줄기 세포를지지하는 표면 상에 코팅 접시에 E8 배지에서 세포를 성장 (자재 목록 참조), 및 5 % CO 2의 가습 된 분위기에서 37 ° C에서 그들을 부화. 수확 세포는 효소 (자료 목록 참조). 참고 : H1 세포가 90 % 컨 플루를 초과 할 수 없음; 포화 상태는 H1 세포의 자연 분화를 유도한다. 세포를 계산하려면, 셀의 추가 10-CM 접시 성장 효소 등의 섹션 1.8-1.10에 설명 된 세포를 들어 올린 혈구 그들을 계산합니다.
    1. Chen 등의 알에 설명 된대로 E8 문화 매체를 준비합니다. (54)
  3. 폴리 아미드를 추가하기 전에, 진공 트랩에 부착 된 파스퇴르 피펫으로 소비 문화의 용지를 제거합니다. 같은 신선한 매체를 추가erological 피펫과 피펫 디스펜서 (10-CM 접시 당 8 ㎖).
    주 : 세포를 파괴 방지하기 위해 접시의 측에 용지를 추가한다. 이 시점에서의 조기 전방 광 - 교차하지 않도록 광으로부터 세포를 보호한다.
  4. 직접 각 요리의 문화 미디어에 피펫 (DMSO 400 μm의 폴리 아미드의 8 μL, 400 nm의 최종 농도)와 폴리 아미드를 추가합니다. 미디어에 고르게 폴리 아미드를 분산 할 수있는 요리를 소용돌이.
    주 : 농도는 변할 수 있지만 세포 독성 선택된 처리에 대해 관찰되지 않았 음을 보장 할 수있다.
  5. 5 % CO 2의 가습 된 분위기에서 세포를 24 시간 37 ℃로 배양 한, 그들은 빛으로부터 보호되도록.
    참고 : 배양 시간은 시간에 걸쳐 폴리 아미드 결합을 측정하기 위해 변화 될 수있다.
  6. 4 ml의 PBS (1.05 mM의 인산 칼륨 일 염기성, 155.17 mM 염화나트륨, 2.97 mM의 인산 나트륨) 혈청 피펫 및 피펫 DIS를 이용하여 각각 10 cm 접시 씻어penser. 대기음 PBS 및 3 ㎖ E8 문화 매체를 추가 할 수 있습니다.
  7. 빛이 희미으로, 5 배양 접시의 뚜껑을 제거하고 후드의 외부 평평한 표면에 세포를 배치합니다. λ <300 nm의 빛을 걸러 5 배양 접시 위에 유리 필터를 놓습니다. 필터의 상단에 UV 소스를 넣습니다. 가교 샘플을 365 nm의 자외선을 조사 (2.4 mW의 / cm 2)와 함께 30 분.
    참고 : 시간을 가교는 경험적으로 결정되어야한다.
  8. 다시 후드에 문화 요리를 전송합니다. 진공 트랩에 부착 된 파스퇴르 피펫으로 미디어를 대기음. 4 ml의 PBS로 각 10-CM 접시를 씻으십시오. PBS를 대기음. 세포를 떼어 놓다 10-CM 접시 당 세포 분리에 대한 3 ㎖ 효소 (자료 목록 참조)를 추가합니다. 37 ℃에서 5 분을 품어.
    참고 :하지 마십시오 효소를 미리 따뜻하게.
  9. 접시 당 3 ㎖ E8 매체와 효소를 끄다. 전송 한 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 분해.
    참고 : 이후이 지점에서 얼음에 장소 세포.
  10. 원심 펌프fuge 세포 5 분, 4 ° C에서 500 XG 해리. 기음 뜨는 효소와 미디어를 제거합니다.
    참고 : 포인트를 일시 중지합니다. 세포는 나중에 후속 처리를 위해 -80 ℃에서 보관, 플래시 냉동 액체 질소 일 수있다.

염색질 2. 분리

  1. 1.2 ml의 COSMIC 버퍼를 추가 (20 mM 트리스 - 염산 [pH가 8.1, 2 mM의 EDTA, 150 mM의 NaCl을, 1 % 트리톤 - X100, 0.1 % SDS)와 위아래로 피펫 여러 번 각 샘플에 대한 세포 펠렛을 재현 탁하기 1.2 ml의 COSMIC 버퍼.
    1. PMSF 및 펩 스타틴 벤즈 아미 딘 및 1.5 μM 1 mM의 최종 농도로 신선한 133 μL 100mM의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF)의 각각 100 mM의 벤즈 아미 딘, 및 프로테아제 억제제 μM 펩 스타틴 (150)를 추가한다. 두 개의 황색 1.7 ml의 마이크로 원심 튜브에 세포 용 해물의 분할 솔루션입니다.
  2. 초음파기 35 분 (10 초, 10 초 끄기, 60 % 전력)와 초음파 처리 (100)를 사이에 게놈 단편ND 500 bp의.
    1. 저장조 내의 물 레벨 microcentrifuge 관 평행 염색질 용액의 레벨을 유지한다. 육안 검사로이 수준을 확인합니다.
      참고 :. DNA를 1.5 % 아가 로스 젤 전단되었는지 확인 (55)
    2. 경험적으로 초음파 시간을 최적화 할 수 있습니다. 샘플을 진정 저수지에 얼음의 최소 금액을 사용하고 얼음 샘플 및 컵 뿔 사이에 방해되지 않도록.
  3. 원심 분리기 샘플 12,000 XG 10 분. 피펫 새로운 황색 microcentrifuge 관에 전송하여 가용성 염색질이 들어있는 수용액을 저장합니다. 펠렛을 폐기하십시오.
  4. 새로운 microcentrifuge 관에 시료 110 μL (10 %)을 전송하고 그것을 입력 DNA 레이블을 붙입니다. -80 ° C에서 보관하십시오. 단계 3.3에서 사용하기 위해 얼음에 염색질 샘플의 나머지 부분을 저장합니다.

리간드-DNA 가교 3. 캡처

  1. 60 μL의 streptavi을 분배하는 피펫을 사용하여microcentrifuge 관에 자석 구슬을 DIN-코팅. 1 ml의에게 COSMIC 버퍼를 추가하고 실온에서 nutator 5 분에 섞는다. 자기 분리에 자석 구슬 구슬을 캡처하는 2 분 랙 놓습니다. 피펫 COSMIC 버퍼를 제거합니다.
    참고 : 구슬이 건조하는 것을 허용하지 마십시오. 다음 단계로 바로 진행합니다.
  2. 염색질 샘플을 추가 (1 ~ ㎖) 구슬 (60 μL)와 구슬을 재현 탁. 4 ° C에서 회전, 흔들 믹서에 스트렙 타비 딘 - 코팅 자석 구슬 적어도 4 시간과 염색질을 품어. 원하는 경우 샘플 O / N을 품어.

선호도 정제 DNA 4. 분리

  1. 비특이적 상호 작용을 제거하려면 다음 세척 버퍼로 실온에서 7 분 간격으로 구슬을 씻으십시오. 각 세척 후 구슬을 캡처하는 자기 분리 랙을 사용합니다. 세척 버퍼의 각 변경 후 구슬을 재현 탁.
  2. 사용하기 전에 증류수 탈 이온수 및 필터 (0.2 μm의)에서 세척 버퍼를 준비합니다. 초 동안 4 ℃에서 보관 세척 버퍼 1, 2everal 개월. 매일 세척 버퍼 3 신선한를 준비합니다. 추가 피펫 샘플에서 세척 버퍼를 제거합니다. 2, 4, 세척에서 각각 1 및 3 (5 mm)를 추가한다. 샘플은 추가로 (한 번 12 시간, 4 시간 한 번) 이전에 아래의 세척에 COSMIC 버퍼 회 세척 할 수있다.
    1. 워시 버퍼 1 (10 mM 트리스 - CL [pH가 8.0, 1 mM의 EDTA, 3 % SDS) 한 번 씻으십시오. 세척 완충제 2 (10 mM 트리스 - CL [pH를 8.0], 250 mM의의 LiCl, 1 mM의 EDTA, 0.5 % NP40, 1 % 나트륨 데 옥시 콜레이트)로 한번 세척 하였다. 세척 완충제 3 회 씻어 (4 M 우레아, 10 mM 트리스 - CL [pH를 7.5, 1 mM의 EDTA, 0.1 % NP-40). 트리스 EDTA (TE) 버퍼 (10 mM 트리스 - CL [pH가 8.0, 1 mM의 EDTA)로 두 번 씻으십시오.
  3. 피펫 200 ㎕의 TE 버퍼에 재현 탁 비즈. 캡처 DNA의 샘플은 친 화성 정제 된 (AP) DNA 라 칭한다.
  4. 10 배 크로스 링크 반전 버퍼 (100 mM 트리스 - CL [pH가 8.0, 1 M KOH, 4 mm의 입력 및 AP DNA를 보충EDTA)의 최종 농도를 1 배로. 56,57 인큐베이션을 30 분간 90 ° C에서.
    주 : 254 nm의 자외선 조사는 랄렌의 가교, 58하지만 뷰틸 피리 미딘 이량이 파장에서 조사로부터 형성 될 수 리버스 DNA의 하류 처리를 방해 할 수있다.
  5. AP DNA를 들어, 자기 분리에 샘플을 포함하는 microcentrifuge 관은 피펫 2 실온에서 분 및 분리 액체 (DNA)를 랙에 배치합니다. 새로운 황색 microcentrifuge 관에 AP DNA를 (구슬에서 방출 된) 전송합니다.
    주의 : 원하는 AP DNA가 액체 내에 더 이상 비드에 부착된다.
  6. 피펫 100 μL 시료 당 약 1 μL 6 N 염산을 첨가하여 pH 7로 농축 된 염산으로 입력 및 AP DNA를 중화. . 샘플 피펫 WARNING으로 pH 종이 위에 ~ 0.5 μl를 첨가하여 중화 확인 : 진한 HCl은 강한 부식성 산이다. 교육 기관에 따라 처리(217), 적절한 개인 보호 장비의 가이드 라인.
  7. 0.2 μg의에의 RNase (100 mg / mL)이 추가 / 입력 및 AP DNA 모두 최종 농도 μL. 37 ℃에서 1 시간을 품어. 0.2 μg의에 테 K (20 ㎎ / ㎖)를 추가 / 입력 및 AP DNA 모두 최종 농도 μL, 추가 할 수 있습니다. 55 ° C에서 1 시간을 품어.
  8. DNA 열 정리 키트와 함께 DNA (자료 목록 참조) 정화. 55 용출 DNA를 58 μL DNA 학년 H 2 O에 -20 또는 -80 ° C에서 보관 입력 및 AP 샘플
  9. 궤적 특이 적 프라이머, 및 / 또는 차세대 시퀀싱에 의해 정량적으로 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR에) AP에 의해 DNA를 분석한다. 95 ° C 10 분의 1주기와 95 ° C 20 초 40주기, 54 ° C 또는 56 ° C 20 초, 72 ℃에서 40 초 : qPCR에 들어, 다음과 같은 매개 변수와 현장 당 2 μL AP DNA를 사용합니다.
    주 : 어닐링 온도가 사용될 프라이머 쌍의 용융 온도에 따라 수정되어야한다. 어닐링 temperatu를 선택그 재없이 비특이적 증폭과 정량주기를 최소화 할 수 있습니다.
    참고 : 차세대 염기 서열 분석을 위해, 읽기 매핑 최소 10 만 달러 목표로하고 있습니다. 맵핑의 수는 AP의 DNA의 양을 증가시킴으로써 및 시퀀싱으로 실행 적은 샘플을 조합함으로써 증가 될 수 읽는다. 더 감도를 향상 읽는다. 칩 서열 분석을위한 표준 패키지 (예를 들면, 홈런 59 맥, 60, SPP 61) COSMIC-서열 데이터와 함께 작동합니다. 게놈 시퀀싱 및 칩 서열을 포함한 차세대 염기 서열에 의존하는 다른 방법과 마찬가지로, 반복 영역은 정렬 및 어셈블리의 모호성을 생성하고, 따라서 기술적 도전 남아 있습니다.

결과

불균일 게놈 단편화 및 다른 변수를 고려하기 위해, 정제 된 DNA는 항상 입력 DNA의 기준에 대해 표준화되어야한다. 관심의 궤적에 특이 적 프라이머를 사용할 수있다. 또한, 음성 대조군으로서, 분자가 결합 할 것으로 예상되지 않은 궤적을 분석하는데 도움이된다. 우리는 365 nm의 빛 (그림 2) 조사에 폴리 아미드 점유율에서> 100 배 증가를 참조하십시오.

농축 된 ...

토론

One of the primary challenges with conventional ChIP is the identification of suitable antibodies. ChIP depends heavily upon the quality of the antibody, and most commercial antibodies are unacceptable for ChIP. In fact, the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) consortium found only 20% of commercial antibodies to be suitable for ChIP assays.50 With COSMIC, antibodies are replaced by streptavidin. Because polyamides are functionalized with biotin, streptavidin is used in place of an antibody to capture polyam...

공개

A.Z.A. is the sole proprietor of Vista Motif, LLC and WINStep Forward.

감사의 말

We thank members of the Ansari lab and Prof. Parameswaran Ramanathan for helpful discussions. This work was supported by NIH grants CA133508 and HL099773, the H. I. Romnes faculty fellowship, and the W. M. Keck Medical Research Award to A.Z.A. G.S.E. was supported by a Peterson Fellowship from the Department of Biochemistry and Molecular Biosciences Training Grant NIH T32 GM07215. A.E. was supported by the Morgridge Graduate Fellowship and the Stem Cell and Regenerative Medicine Center Fellowship, and D.B. was supported by the NSEC grant from NSF.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)any source
Benzamidineany source
Pepstatinany source
Proteinase Kany source
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Life Technologies65001
PBS, pH 7.4Life Technologies10010-023Other sources can be used
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentLife TechnologiesA1110501
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104We have tried other manufacturers of DNA columns with success.
TruSeq ChIP Sample Prep KitIlluminaIP-202-1012This Kit can be used to prepare COSMIC DNA for next-generation sequencing
Matrigel Basement Membrane MatrixBD Biosciences356231Used to coat plates in order to grow H1 ESCs
pH paperany source
amber microcentrifuge tubesany source
microcentrifuge tubesany source
pyrex filterany sourcePyrex baking dishes are suitable
qPCR master mixany source
RNaseany source
HCl (6 N)any source
10-cm tissue culture dishesany source
Serological pipettesany source
Pasteur pipettesany source
Pipette tipsany source
15-ml conical tubesany source
centrifugeany source
microcentrifugeany source
nutatorany source
Magnetic separation rackany source
UV sourceCalSunB001BH0A1AOther UV sources can be used, but crosslinking time must be optimized empirically
Misonix SonicatorQsonicaS4000 with 431C1 cup hornOther sonicators can be used, but sonication conditions must be optimized empirically
Humidified CO2 incubatorany source
Biological safety cabinet with vacuum outletany source

참고문헌

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