HIV 유도 된 신경 염증의 마우스 모델에서 이광자 현미경을 사용하여 뇌 혈관 구조의 정량

요약

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

초록

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

서문

인간 면역 결핍 바이러스 1 (HIV-1) 바이러스 감염의 급성 단계에서 뇌를 침범하고, 생산적으로 자신의 활성화로 이어지는, 미세 아교 세포 및 뇌 상주 식세포 모두 감염 - 두 호스트 유래 염증 매개과 가용성 HIV-1 출시 이러한 문신과 ^(1,2 검토) gp120의 같은 virotoxins. 그 결과, 만성 신경 염증성 상태는 HIV-1 관련 신경인지 장애 (HAND) ^3-5의 발병에 기여하는 것으로 생각된다 CNS에서 설립된다.

HIV-1 문신 또는 마우스의 중추 신경계 내에서 인터루킨 (IL) -17A의 만성 과발현은 미세 혈관 진공 ^6,7 발생하는 것으로 나타났다. 이것은 만성 신경 염증은 뇌 혈관계에 영향을 HAND의 병인에 기여할 수있는 가능성을 제기한다. 또한이 문제를 조사하기 위해, 우리는 뇌 혈관의 struc을 정량화하는 방법을 개발했다투 레스.

이 논문은, 세그먼트 길이, 총 세그먼트 길이를 의미 모세관 직경 및 얇은 스컬 피질 창을 통해 모세관 네트워크의 생체 내 이미징에 사용한 총 모세관 체적 평균 모세관 노드 모세관 세그먼트 수를 정량하는 방법을 설명한다 (전술로부터 개질 프로토콜) ^-8,9-뿐만 아니라 이광자 현미경을 사용하여 뇌 부분의 생체 촬상. 생체 얇은 스컬 피질 창이 대뇌 환경의 보존을 가능하게 때문에 뇌 조각 모세관 네트워크의 생체 촬상의 재구성을 가능하게하면서,이 결합 방법은, 뇌 혈관 파라미터 론적 정량 제공 입체 완료 모세관 네트워크 - 후 상용 소프트웨어를 사용하여 정량화 할 수있다.

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프로토콜

동물 자원에 로체스터 대학위원회의 대학은이 논문에서 수행되는 모든 절차를 승인했다.

1. 수술 전 준비 (쥐)

1. 필요한 모든 장비와 수술 영역을 준비합니다. 미리 70 % 에탄올을 사용하여 절차를 수행하는 동안 사용되는 모든 도구를 살균. 선택적으로, 유리 구슬 살균기를 사용하거나 도구를 소독하기 위해 압력솥.
2. 이소 플루 란 기화기에 연결 이소 플루 란 유도 챔버에 마우스를 놓습니다. 1 L / min의 속도로 4 %에 이소 플루 란 수준을 설정합니다.
   주 : 성상 세포 특이 신경교 섬유 성 단백질 (GFAP) 프로모터 (HIV 두드리는의 Tg 생쥐)에 의해 구동 독시사이클린 (DOX) 유도 성 HIV-1 타트 트랜스와 여기에보고 된 실험 쥐 ¹⁰ HIV의 효과를 조사하기 위해 사용 하였다 이전에 ^{7,10 설명} 된대로 -1, 뇌 혈관 구조에 신경 염증을 유도.
3. 부드럽게 및 마우스를 관찰 유도 챔버 팁# 39;의 복원 정 반사. 복원력 반사가 억제되면, 2 % 이소 플루 레벨을 설정하고 수술 벤치 노즈콘을 유도 챔버로부터 공기 흐름을 재.
4. 빨리 물을 주입 가열 패드로 유도 챔버에서 마우스를 이동합니다. 코 콘을 통해 이소 플루 란 (1.5 %)을 계속 적용. 호흡 수 (RR) 모니터링을 통해 평가 개별 마우스 허용 오차에 따라 마취를 조정합니다.
   주 : RR의 우울증은 뇌 혈류 및 혈관 직경의 평가를 변경하는 가스 생리적 파라미터를 교란 할 수있다. 분당 55-65 숨 사이 RR을 유지하기 위해 시도합니다. 심장 박동수 (HR)도 마취 깊이를 평가할 수있다; 혈관 직경에 대한 생리 학적 변화를 방지하기 위해 분당 300-450 박동 사이에 인사를 유지한다. 일반적으로 마취는 주어진 마우스 1 L / 분에서 1.5-2.0 %의 이소 플루 란 사이에 충분한 것입니다.
5. 또한 마취의 깊이를 확인하는 발가락 핀치를 수행합니다. 마우스는, 통신을 응답하지 않으면수술을 줬어.

얇은 두개골 두개골 창 2. 준비

1. 마우스의 눈에 인공 눈물 젤을 적용합니다. 완전히 가위 전기 면도기를 사용하여 마우스의 두피에서 머리카락을 제거합니다.
2. 포비돈 요오드 용액을 도포하여 두피 살균; 건조 할 수 있습니다. 그 후, 광학 현미경 하에서 완전히 두정골 마킹, 꼬리 정면 뼈 및 브레 그마 노출 마우스의 두피로부터 피부를 제거한다.
3. 쉬운 제거를위한 멤브레인을 건조시키기 위해 두개골에 10 % 염화 제이철 용액의 소량을 적용한다. 부드럽게 두개골을 긁어 # 45분의 5 집게로 건조 된 세포막을 제거합니다.
4. headplate 창 주위에 접착제의 얇은 층을 적용합니다. 부드럽게 윈도우의 중심에있는 관심 영역을 유지하는 마우스의 두개골에 대하여 headplate를 누른다. 접착제를 중합 headplate에 치과 용 시멘트의 드롭을 적용합니다.
5. 얇은 층을 적용headplate 윈도우의 가장자리를 따라 접착제의 식염수를 개최하여 저수지를 만들 수 있습니다. 접착제가 건조되면, 마우스 headplate 하네스에 headplate 나사.
   참고 :이 절차에 사용되는 마우스 headplate 하네스는 금속베이스와 2 개의 금속 열이있는 구조입니다. 각 열에서 하나의 봄과 하나의 날개 너트가있다. headplate는 스프링의 위쪽에 배치되고, 헤드 레벨이며 움직이지 않을 때까지 날개 너트가 체결된다.
6. 6,000 rpm으로 설정 microtorque 드릴에 부착 된 드릴 비트를 사용하여 headplate 창에서 어떤 접착제를 제거합니다. 선박의 구조가 손상 될 수 있습니다 마우스 두개골의 과열을 방지하기 위해 모든 10 ~ 15 초를 중지합니다.
   1. 새로운 드릴 비트를 사용하여, 중간 선 (headplate 윈도우의 지름의 3 분의 1)에서 측면 microtorque 드릴 1.5 mm를 놓습니다. 4,000 rpm에서 얇은에이 위치 주변의 두개골을 시작합니다. 직접적인 하락 압력으로 두개골을 부드럽게 드릴을 이동합니다.
   2. 중지의 DRIL링 모든 10 ~ 15 초 마우스 두개골의 과열을 방지합니다. 이 시간 동안 압축 공기 용기를 사용하여 축적 된 두개골 먼지를 제거합니다.
   3. 5 ~ 10 초 동안 두개의 온도를 실온 식염수 방울을 사용합니다. 부드럽게 두개골의 숱을 계속 부드러운 티슈로 모든 유체를 제거합니다.
7. 두개골의 최종 박형화를 들어, 저장소 내에 headplate 식염수 소량을 넣고 가볍게 작은 혈관을 명확하게 보일 때까지 관심 영역 위에 치과 microblade 스윕.

생리 학적 매개 변수 3. 모니터링

1. 두개골이 완전히 희석되면, 홀더에서 마우스를 분리하고 다시에 놓습니다. 부드럽게 명확하게 내측 허벅지를 노출 모두 뒷다리를 테이프.
2. 가위 전기 면도기와 모두 중간 허벅지 위에 머리를 제거합니다. 포비돈 - 요오드와 허벅지를 커버하여 수술 부위를 소독.
3. 대퇴 정맥 위의 중간 오른쪽 허벅지에 피부를 꼬집어및 동맥 # 5 집게를 사용. 부드럽게 위쪽으로 피부를 당겨 잘라 피부를 제거하기 위해 가위를 사용합니다.
   참고 : 왼쪽 허벅지가 수술 합병증 (혈관 기형, 파열 된 선박)의 경우에 예약되어 있습니다.
4. 수술 부위에 0.9 %의 식염수를 약 3 ~ 5 방울을 적용합니다. 이것은 혈관의 큰 확대율뿐 아니라 혈관의 수분 사이트를 유지하고 건조 방지 가능하다. 퉁명스럽게 두 #에게 45분의 5 집게를 사용하여 대퇴 신경 혈관 다발로 해부에 의해 동맥에서 대퇴 정맥을 분리합니다.
5. 약 1cm 간격 대퇴 동맥 아래 수술 봉합의 두 3cm 조각을 놓습니다. 카테터 삽입시 과도한 혈액 손실을 방지하는 데 도움이됩니다 혈관 지혈대를 만들 수있는 상부 봉합 시계 방향으로 돌립니다.
6. 봄 가위를 사용하여 대퇴 동맥에 작은 절개를합니다. 카테터는 동맥 내에서 안전하게 될 때까지 절개 사전을 통해 동맥에 카테터를 놓습니다.
누출 적절한 카테터 배치를 평가하기 위해 상부 봉합 (지혈대를) 꼬인 것이 풀리다. 봉합사를 이용하여 혈관 내 카테터 주위에 두 개의 매듭을 묶는하여 대퇴 동맥에 카테터를 고정합니다.
7. 혈액 응고를 방지하기 위해 카테터를 통해 헤파린 10 μL (100 IU / ㎖)을 주입한다. 그런 다음, 수술 간단한 중단 패턴에서 4-0 봉합과 함께 피부를 바느질로 오른쪽 허벅지를 닫습니다.
8. 복강 오른쪽 하복부에 우레탄을 50 μL (1.2 밀리그램 / g)을 주입한다. 5 분 후 복강 우레탄 100 ㎕의 총 왼쪽 하단 사분면에 다른 50 μL 주입으로 반복합니다. 병용 마취의 깊이을 위해 마우스를 다시 검사하는 동안 천천히 약 0.25 %로 이소 플루 란 수준을 줄일 수 있습니다.
   참고 :이 장을 관통하지 않도록 후방 복부 벽을 따라 복강 내 표면 바늘을 유지합니다. 이것은 복부 직근 (μ)를 협지함으로써 달성 될 수있다멀리 내장에서 다음 주입 scles.
9. 모세관을 사용하여 카테터의 동맥 혈액 40 μL 샘플을 수집한다. 염수로 채워진 네 방향 스톱 콕과 헤파린 채워진 주사기 장착 혈압 변환기에 카테터를 연결.
10. 카테터의 의도하지 않은 제거를 방지하기 위해 수술 장치 혈압 변환기를 테이프. 평균 동맥압의 모니터링을 시작합니다.
11. 혈액 가스 분석기 입력 포트에 혈액 채워진 모세관 튜브를 삽입합니다. 모든 혈액이 추출되면, 진입 포트로부터 모세관을 제거한다. O _2, CO ₂ 혈액 가스 농도는 혈액 가스 분석 장치에서 인쇄 용지에 나타날 것이다.

형광 염료 4. 주입

1. # 5 집게를 사용하여 중간 왼쪽 허벅지에 피부를 꼬집어. 부드럽게 위쪽으로 피부를 당겨 잘라 피부를 제거하기 위해 가위를 사용합니다. 덱스 트란 복합 빨간색 발광 로다 민 염료를 준비(70 kDa의) (생리 식염수에 녹인 10 ㎎ / ㎏).
2. 대퇴가 부착 된 30 G 바늘 1 ML의 주사기를 vein.Using 찾아 주사기의 130 μL 라인에 영상에 적합한 형광 염료의 이전에 제조 된 솔루션을 그립니다. 주사기에 완전히 염료를 그리기 단단히 주사기 벽을 쓸어 넘겨 모든 기포를 제거합니다.
   1. 벤드 딱딱한 표면 베벨면이 위로에 대해 그것을 누르면 약 30도 각도로 30 G 바늘. 염료와 바늘을 작성하고 100 μL 샘플을 떠나, 초과 액체를 폐기합니다.
3. 천천히 대퇴 정맥 내로 염료의 100 μL 샘플을 주입한다. 바늘을 제거한 후, 어떤 출혈을 멈추게하는 주사 부위에 안정적으로 부드럽게 압력을 적용합니다. 염료가 5 분 동안 순환하도록 허용합니다.
   주 : 대안 적으로, 오른쪽 대퇴부 정맥 다른 수술 부위의 생성을 통해 상기 혈액 손실을 방지하기 위해, 형광 염료의 주입 대신에 사용될 수있다. 또한, 만약동물은 수술 부위에서 미친 듯이 출혈이 너무 많은 헤파린이 카테터를 세척하기 위해 주어진 것을 표시 할 수있다. 이 10-15 분 내에 응고가없는 마우스가 여전히 출혈의 경우, 새로운 마우스로 실험을 재시작 고려한다.
4. 조심스럽게 그 위에 마우스를 뒤집어 4-0 봉합과 함께 피부를 바느질하여 왼쪽 허벅지를 닫고 마우스 headplate 하네스에 배치합니다.

생체 내 두 광자 이미징 5.

1. 연속 마취 수준을 유지 확인한 이광자 현미경 수술기구를 이동. headplate 저장조에 0.9 % 식염수의 소량을 배치하고 식염수에 접촉되도록 현미경 대물 저하. 브라이트 감상 목표를 사용하여 관심 영역을 찾습니다
2. 형광 염료에 적합한 파장에 두 광자 레이저 여기를 설정합니다. 25X O를 사용하여 두 개의 광자 영상화를 시작bjective.
   이 실험에서 우리는 780 nm의 파장에서 흥분했다 적색 발광 로다 민 염료에 접합 된 덱스 트란을 사용합니다. 발광 36분의 607 대역 통과 필터는 염료로부터의 형광을 검출하고, 발광 대역 통과 필터를 20분의 480 동맥자가 형광을 검출하기 위해 사용 된
3. 보기 화면 베드 모세관을 찾은 두 광자 이미징 소프트웨어를 사용하여 모세관 광학 줌 2. 획득 된 이미지를 사용하여이 영역을 확대.
4. 이미지가 완료되면, 참수 하였다 경추 탈구하여 마우스를 희생.

6. 예 생체 내 두 광자 이미징

1. 극세 가위를 사용하여, 마우스의 정면 뼈 interparietal 뼈 두피 절개를. 포인터 손가락과 엄지 손가락으로 두개골의 측면에 피부를 보호합니다.
2. 중간 interparietal 뼈 아래에있는 여분의 미세 가위를 놓고 시상 봉합 따라 두개골을 잘라. 브레 그마 마킹 후 약 3 mm의 두개골을 절단 중지합니다.
   참고 : 뇌를 절단 방지하기 위해 두개골을 절단 할 때 상승 압력을 적용합니다.
3. # 5 포셉 사용하여 뇌에서 두개골을 분리하고 조심스럽게 뇌의 표면에서 모든 수막을 제거합니다. 남은 수막 실수로 뇌를 가르기 수 있습니다 극도의주의는 이러한 문제를 방지하기 위해주의해야한다. 뇌가 두개골에서 분리 될 때까지 조심스럽게 천천히 앞으로 전진 뇌에서 # 5 집게를 밀어 넣습니다.
   주 : 하향 압력이 뇌 천공 피하기 위하여 사용되어야한다는 것을.
4. 생쥐의 특정 뇌 절편 도구에서 뇌를 놓습니다. 뇌를 통해 인공 뇌척수액의 방울을 적용하여 뇌를 씻으십시오.
5. 브레 그마에 브레 그마 0에서 뇌의 2mm 코로나 부분을 제거 -2. 위쪽으로 향하게 0 브레 그마 인공 뇌척수액을 포함하는 오목 유리 슬라이드에 관상 섹션 (섹션의 가장 두개골 부분)을 놓습니다. 조심스럽게 뇌 SL을 커버유리 커버 슬립 얼음.
   참고 :이 혈관 구조를 변형 수 있으므로 한 번 뇌 섹션에 배치 된 유리를 눌러 피하십시오.
6. 현미경 스테이지를 이동시켜 슬라이드 및 커버 슬립에 0.9 % 식염수의 소량을 배치. 이 식염수와 접촉 할 때까지 현미경 목표를 낮 춥니 다. 시야 목표를 사용하여 뇌의 중간 선을 찾습니다.
7. 이광자 촬상을 시작하고 다시 25X 대물를 사용 정중선을 찾아. 관상 부분의 피질 표면에서의 종 방향 균열에 대해보고이 작업을 수행. 중간 선에 영상 화면의 오른쪽 가장자리를 놓고 옆으로 세 개의 완전한 프레임 (중간 선에서 약 1.5 mm)를 뷰어 화면을 통해 이동합니다.
   이 실험에서, 촬상 파라미터 단계 5.2 주에 언급 된 것과 동일 하였다 참고.
8. 모세 혈관이보기 화면에서 거의 볼 수있는 깊이를 찾습니다. 초점 추가 (20)의 평면을 낮 춥니 다μm의 Z는 스택의 탑을 결정한다.
9. 1 μm의 이미지 두께를 설정합니다. 100 ㎛에 대한보기 화면을 내리고 화소의 1 % 미만이되도록 과포화 걸쳐 레이저 파워를 조정한다.
   참고 : Z - 스택 이미지가 100 연속 500x500x1 μm의 일련의 이미지에서 컴파일됩니다. 보다 정확한 후 처리 계산 될 것이다 Z 스택 크다. 일반적으로 100 ㎛ 이상의 Z - 스택을 수집하기 위해 시도합니다.
10. 인접 XY 아이콘 다음 XY 반복 아이콘을 누릅니다. Z-스택이 완료되면, 완료 아이콘 시리즈를 눌러 파일을 저장한다.

7. 데이터 처리

1. ImageJ에 소프트웨어에서 생체 모세관 이미지를 엽니 다. 수동 이광자 소프트웨어로부터 얻어지는 값에 기초하여 거리 비율에 픽셀을 설정한다.
   1. 도구 메뉴에서 * 바로 * 아이콘을 선택합니다. OPPO 한 모세관 벽으로부터 연장되는 선을 그립니다사이트 모세관 벽과 ImageJ에 의해 제공되는 길이를 기록한다.
      명확 모세관 벽의 모서리를 시각화하기 위해 이미지를 확대 할 필요가있을 수 있으므로주의.
   2. 모세관을 따라 다른 위치에서 단계를 반복 7.1.1뿐만 아니라에 대한 이미지에 여러 개의 모세 혈관.
2. 이러한 아미라으로 분석 소프트웨어에 Z-스택 파일을 엽니 다. 하위 응용 프로그램 도구 모음에서 필라멘트 편집기 아이콘을 선택
   1. 상단 또는 Z-스택의 하단을 약 20 이동할 수있는 뷰어를 시청 두께를 설정합니다.
   2. 추적 아이콘을 선택하고로드 된 이미지 위로 커서를 이동합니다. 도 2c에 설명 된 위치에서 모세 혈관에 배치 노드; 세그먼트는 자동으로 인접한 노드 사이에 나타납니다. 전체 Z - 스택을 통해 모세 혈관을 추적합니다.
      주 : THR 모세관을 추적하기 위해 엔드 포인트와 분기점 사이의 노드를 배치 할 필요가있다Z-스택 oughout.
   3. 이러한 노드를 제거하려면, 중급 제거 아이콘을 클릭합니다.
      참고 :이 제거 선택한 아이콘을 선택하고 선택 단일 아이콘을 사용하여 루프를 선택하고 수동으로 제거해야합니다 잘못된 루프 세그먼트를 만들 수 있습니다. 루프를 추적하는 동안, 같은 지역에 계속 표시하면, 노드가 다른 모세 혈관에 배치했다 가능성이 높습니다.
   4. 추적이 완료되면, 자동적으로 추출 된 파라미터를 포함한 혈관 스프레드 시트를 열 그래프 정보 아이콘을 선택한다. 노드와 세그먼트의 수는 기본보기 화면에서 사용할 수 있습니다.

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결과

얇은 두개골 대뇌 피질의 창은 대뇌 피질의 모세 혈관의 생체 내 두 광자 이미징 (그림 1)을 허용한다. 이미지에 적합한 지역은 수많은, 별개의 모세 혈관 (그림 1A)를 보여줍니다. 한 시야에서 더 동맥 세포벽 형광도 존재하지 않으며, ¹¹ 번째 고조파 발생량 (도 1b)에 의해 유도 된 이러한 콜라겐과 같은 다른 형광 형광 신...

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토론

여기에 기재된 방법은 실험 모델 / 설정 광범위한 뇌 미세 혈관 구조를 분석에 적용 할 수있다. 이 방법의 성공을 위해, 세 가지 중요한 단계를 마스터해야합니다. 첫째, 얇은 두개골 창은 두개골 또는 기본 뇌에 손상을주지해야합니다. 그것은 숱이 중 두개골에 구멍을 내거나, 또는 열 유도 혈관 누설의 원인이 쉽다. 형광 염료의 초점이 비행기로 누출과 모세 혈관을 모호하므로이 영상을 방해 할 ...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leica Microscope	Leica Inc.	MZ8
High Intensity Illuminator	Dolan-Jenner	180
Heating Pad	Stryker	TP3E
T/PUMP	Gaymar Industries, Inc.	TP-500
TEC-4 Isoflurane Vaporizer	Datex Ohmeda	447
Artificial Tear Gel	Butler AHS	7312
Povidone-Iodine solution	Aplicare	52380-1855-9
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Dumot #5 Forceps	Fine Science Tools	11295-10
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35
Ferric Chloride Solution	Ricca Chemical Company	3120-16
Loctite 454 Prism Instant Adhesive Gel	Henkel	45404
Dental Cement	Stoelting	51459
Microtoruqe II Handpiece Kit	Pearson Dental	R14-0002
005 Burr for Micro Drill	Fine Science Tools	19007-05
Norland Blade (Dental Microblade)	Salvin Dental	6900
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500	Group 2B Carcinogen
Braided Suture	Ethicon	735G
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-03
Arterial Catheter	SAI Infusion Technologies	MAC-01	The end of the catheter was manually stretched out in order to decrease its diameter.
Blood Pressure Moniter	World Precision Intruments	SYS-BP1
Blood Pressure Transducer and Cable	World Precision Intruments	BLPR2
RAPIDLab Blood Gas Analyzer	Siemens	248
40 μl Capillary Tube	VWR	15401-413
Texas Red-dextran (70,000 MW, 10 mg/kg dissolved in saline)	Invitrogen	D-1830
Adult Mouse Brain Slicer Matrix	Zivic Instruments	BSMAS001-1
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Multiphoton Microscope	Olypmus	FV-1000 MPE
MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser	Spectra-Physics
ImageJ Software	National Institutes of Health (NIH)		Available at http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Amira Software	Visage Imaging