Photoconvertible PSmOrange 시스템을 사용하여 GFP 유전자 변형 Zebrafish의 세포를 추적

요약

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

초록

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state¹ and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish^2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

서문

Exponentially improving imaging techniques allow following developmental processes over time periods of up to about four consecutive days³. In zebrafish and many other animal model systems, specific cells, tissues, axonal or vascular structures are marked by transgenic green or sometimes red or yellow fluorescent proteins to facilitate visualization. However, in most transgenic lines the transgene is not specifically expressed in the cells of interest but also additional structures, which hinders the precise tracking of for instance single cells or groups of cells.

Fluorescent photoconvertible proteins are well suited for cell tracking during embryonic development. The prerequisites for the application of such proteins are a long-lived nature, a well-separated emission range upon conversion and bright fluorescence. Available photoconvertible proteins comprise those that change their emission range upon conversion such as Kaede⁴, KiGR⁵, mEos2⁶, PS-CFP2 or Dendra2⁷ and others which are only fluorescent when photoactivated (PAmCherry⁸, PAGFP⁹ or PATagRFP¹⁰). Their applications to track cells in existing FP-transgenic animals are however limited as they often involve a green fluorescent state or do not fulfill all of the above criteria. Only recently, Subach and colleagues reported the PSmOrange protein, which changes its emission from orange/red to far red upon photoconversion and was successfully applied in cells in culture and cultured cells injected into mice².

To investigate the protein's suitability for cell tracking in a living embryo, we generated an expression construct for the microinjection of nuclear-tagged H2B-PSmOrange into zebrafish embryos. We find that the protein fulfills all prerequisites for successful cell tracking in GFP transgenic backgrounds during the first 4 (and possibly more) days of zebrafish embryonic development. During this time, most of the cell migratory events are completed in fish making the PSmOrange system an excellent addition to the zebrafish toolkit.

프로토콜

1. H2B-PSmOrange mRNA의 시험 관내 전사 및 mRNA의 정제

1. 제조업체의 지시에 따라를 NotI 제한 효소를 사용 PCS2 + 플라스미드를 함유-H2B PSmOrange 선형화.
   참고 : mRNA의 오염 및 열화를 방지하기 위해 같은 장갑, 실험실 코트 등의 적절한 보호를 사용하여 다음 단계를 수행합니다.
2. 제조사의 프로토콜에 따라 PCR 정제 키트 또는 페놀 - 클로로포름 계 방법을 사용하여 선형화 된 DNA를 정제.
3. 제조업체의 지침에 따라 SP6-mRNA의 전사를위한 선형화 템플릿 DNA 1 μg의를 사용합니다.
4. 37 ° C에서 10 ~ 20 분 동안 1.0 U의 RNase 무료 DNaseI을 추가하여 DNA를 제거합니다.
5. RNA는 제조사의 프로토콜에 따라 키트를 정리하여 mRNA의 정리.
6. mRNA의 순도 및 농도를 증가 6 μL 아세트산 나트륨 (3.0 M, pH를 5.2), 150 ㎕의 96 % 에탄올을 첨가하여 mRNA의 석출. m을 품어최소 30 분에서 24 시간까지 -20 ° C에서 ixed 솔루션입니다.
7. 4 ° C에서 45 분 18.407 XG에 솔루션을 회전시켜 mRNA를 수집합니다. 액체를 버리고, 150 μL의 70 % 에탄올의 mRNA를 재현 탁. 믹스와 4 ℃에서 추가로 15 분 동안 솔루션을 원심 분리기. 액체를 폐기 얼음에 5 분 동안 펠렛을 건조하고 20 μl를 초순수의 RNase 무료 물에의 mRNA를 재현 탁.
8. (100) mRNA의 희석 (99 μL의 초순수의 RNase없는 물 1 μl의 mRNA의) : 1 광도 측정에 의해 mRNA의 농도와 순도를 평가합니다.
9. 단기 저장을 위해, -20 ° C에서의 mRNA 용액을 유지한다. 장기간 저장을 위해, -80 ° C에서의 mRNA를 유지한다.

Zebrafish의 배아에 2 H2B-PSmOrange mRNA의 미세 주입

1. TG 사용하여 주입하기 전에 쌍에게 밤에 짝짓기 설정 (foxD3 : GFP)를; TG (FLH : GFP)을 두 번 형질 전환 어류 (또는 다른 GFP 형질 전환 어류). 스페이서를 배치하여 분리 물고기를 남겨주세요그들 사이의 상대 시간을 제어한다.
2. 주입 아침에 스페이서를 제거하고 20 분 동안 물고기 짝을 할 수 있습니다.
3. 짝짓기 시간 동안, 130 페이지의 최종 농도-H2B PSmOrange mRNA의 희석 / NL 및 microloader 팁을 사용하여, 마이크로 인젝션 모세관에 전사 6 μL 주입 용액 (물에의 RNase 무료). 보정 된 유리 슬라이드와 주입량을 확인합니다. NL이 mRNA의 용액 (260 페이지)를 주입하는 주입 압력을 조정한다.
4. 1 배 배아 (E3​​) 매체를 포함하는 멸균 플라스틱 페트리 접시에 계란을 수집합니다.
5. 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 주입 접시에 20 ~ 30 배아를 전송합니다.
6. 한 세포 단계 ^(11)에서 노른자로 전지 셀에 또는 아래 사항 솔루션을 포함하는 2 NL의 mRNA를 주입한다.
7. 1 배 E3 매체를 포함하는 페트리 접시에 전송 주입 된 배아는, 미 수정 여부를 일반적으로 개발 배아를 제거하고 28 ° C에서 그들을 성장.
   참고 : 가벼운 보호 O를배아 f를 실험을하는 동안 필요하지 않습니다.
8. 1 배 E3 매체에 제브라 피쉬의 배아를 올리고 색소 침착을 억제하는 낭 배기 후 0.2 mM의 PTU (1- 페닐 -2- 티오)를 추가합니다. 세균 오염의 위험을 최소화하기 위해 하루에 두 번 배지를 변경합니다.

3. 배아 퍼가기

1. GFP (녹색) 및 PSmOrange 형광 램프와 적절한 방출 필터가 장착 쌍안 현미경을 사용하여 (레드 / 오렌지)의 공동 발현 배아를 선택합니다. 1 배 E3 매체를 포함하는 멸균 페트리 접시에 긍정적 인 배아를 전송합니다.
2. 겸자 ^(12)를 사용하여 실체 현미경 Dechorionate 배아.
3. 1.0 ml를 포함하는 1.5 ML 튜브에 전송 한 배아 컷 팁 피펫 (P200)를 사용하여 초순수 제조 1.0 % 낮은 용융 아가로 오스 (LMA)를 미리은 예열. 참고 : 80 ° C에 LMA를 따뜻하게하고 배아를 삽입하기 전에 실온에서 3 ~ 5 분 동안 냉각.
4. 에 150 ㎕의 LMA에서 배아를 이동커브 글라스를 챔버 및 미세 플라스틱 팁을 사용, 아래로 반전 공 초점 레이저 주사 현미경 A1R + (또는 다른 적절한 현미경)에 기술 된 실험에서 배아의 방향, 예를 들어 지느러미 측면을 조정합니다. LMA가 중합되면, 마취 0.2 mM의 PTU 0.02 % 에틸 -3- 아미노 벤조 에이트 methansulfonate (Tricaine)를 함유하는 생선 물 챔버를 채운다.
5. 샘플을 이미징하기 전에 Tricaine의 효과를 확인하기 위해 15 분을 기다립니다. 마취는 브라이트 조명이 장착 된 실체 현미경을 사용하여 모니터링 할 수있는 배아의 움직임을 방지 할 수 있습니다.
   주 : 챔버 회 재사용 될 수있다.

4. PSmOrange 광

1. 공 초점 현미경으로 시료를 넣고 488 nm의 각각 GFP 및 PSmOrange 촬상 561 nm의 레이저에 의한 photoconvert하는 영역을 식별하기 위해 표본을 검사한다.
   주 : 반전 STA에 반전 촛점 레이저 주사 현미경을 사용 A1R +GE의 현미경 이미징 소프트웨어에 의해 TiEcontrolled 및 488 nm의, 561 nm의 광 및 이미징 640 nm의 레이저를 장착. 그러나, 애플리케이션이 확실히만큼 변환 이미징 레이저 라인이 가능한 현미경으로 한정되지 않는다.
   1. 제자리에 20X 공기 목적을 넣어 (NA : 0.75, WD를 : 1.0 mm, FOV : 0.64 X 0.64 mm)를.
   2. 광 전에 PSmOrange 단백질을 검출하기 위해 다음과 같은 현미경 설정을 사용하여 561 nm의 레이저, 목적 위의 초점면에서 측정 된 0.74 mW의합니다.
      주 :이 시스템이 40 %에 해당한다 (초점 평면에서 측정하는 유효 전력을 결정하기위한 유일한 방법이다). 변할 수-H2B PSmOrange 주사의 효율성 실험 필요에 따라 레이저 전력을 조정한다.
   3. 관심 영역을 강조하기 위해 줌 요소를 추가합니다. 높은 배율 이미지 획득 시간 때문에 광독성을 감소시킨다.
2. 구조를 포함하는 Z 스택 획득488 nm의 연속 모드 (라인 모드 1> 4)에서 561 nm의 레이저를 사용하여 관심의. 1.0 및 2.0 μm의 사이의 Z-단계를 수정합니다. 라인 평균 주사 주파수는 화상 품질을 최적화하기 위해 사용될 수있다.
3. 샘플을 스캔하고 photoconvert 할 영역을 강조하기 위해 관심 (ROI) 도구의 지역을 선택합니다. 자극 곳은 투자 수익 (ROI)을 수정합니다. 사진 활성화 / 표백 모듈을 선택, 각 박스를 선택하여 488 nm의 레이저를 활성화하고 80 % (목적에서 측정 한 mW의 레이저 파워)로 488 nm의 레이저를 설정합니다. 0.5 초 / 프레임의 스캔 속도를 설정합니다.
4. 광 변환 유틸리티 (ND 자극)을 열고 광 설정을 지정합니다.
   1. 광 프로토콜을 지정하려면 "추가"명령을 클릭합니다.
   2. "취득 / 자극"메뉴의 "취득"에서 "단계"한 설정과 이미지의 개수는 "루프"메뉴의 광 전에 취득 할 나타냅니다.
   3. 세인트 "로 설정"단계 "2imulation "자극 이벤트의 수를 입력을 수행한다.
   4. 조정 "단계"3 "상"1 선택적으로 기술 한 바와 같이, 이미지 수집의 마지막 라운드 전에 대기하는 시간을 입력하여 "상"이 후 대기 "단계"를 삽입합니다.
   5. 모든 매개 변수가 설정되면, 자극 설정을 적용하고 광을 실행합니다.
      레이저 전원 다를 수 있습니다 광 각 라운드에 대한 검사 및 반복 수의 주파수 및 배아로 배아 다릅니다 있습니다. 설정은 표 1에 나타내었다 시작합니다.
5. 488 내지 561 nm이고, 상기와 같이 설정을 적용 640 nm의 레이저를 이용하여 마지막 Z 스택 획득. (mW의 4.5까지) 고 레이저 전력을 사용하여 변환 PSmOrange 시각화 640 nm의 레이저를 설정한다.

LMA 5. 마운트 해제 배아

1. 현미경에서 챔버를 포함하는 배아를 제거합니다. 조심스럽게 아가로 오스 유에서 배아를 제거집게를 노래.
2. 새로운 멸균 플라스틱 페트리 접시로 또는 1 배 E3 0.2 mM의 PTU를 포함하는 멸균 6 웰 플레이트에 배아를 전송합니다. 개발의 원하는 단계까지 28 ° C에서 배아를 품어.

6. Photoconverted PSmOrange 단백질 발현하는 세포의 운명을 분석

1. 점 3.3 3.4에 기재된 바와 같이 배아를 다시 삽입.
2. 공 초점 현미경으로 시료를 놓고 관심 (488 ㎚)의 GFP 유전자 변형 구조 photoconverted 세포 (640 나노 미터)을 식별하기 위해 표본을 검사합니다.
3. 488 nm의, 561 nm의 연속 모드 (라인 모드 1> 4)에서 640 nm의 레이저를 사용하여 관심의 구조를 다루는 Z 스택 획득. 1.0 및 2.0 μm의 사이의 Z-단계를 수정합니다. 라인 평균 주사 주파수는 화상 품질을 최적화하기 위해 사용될 수있다.
4. 어느 공동 특급 GFP와 photoconverted 단백질을 세포를 식별하기 위해 다음 방법 중 하나를 사용하십시오.
   1. 사용자 정의 만든 자동 피지 이미지J 매크로 ³
      1. 에서 Convolve "GaussianBlur"플러그인을 사용하여 원래 스택 (→ 과정 → GaussianBlur → 필터) 및 "이미지 계산기"플러그인 (→ 프로세스 → 이미지 계산기)를 사용하여 원래의 부드러운 스택을 뺍니다. 관심있는 구조를 시각화하고 분석 연산 시간을 줄이기 위해이 공정을 사용한다.
      2. photoconverted 세포를 강조하기 위해 녹색과 원적외선 채널에 특정 임계 값을 적용 (→ 이미지 → → 임계 값을 조정합니다). 적절한 설정으로 임계 영역을 검출하기 위해 "입자를 분석"도구를 사용하여 (→ 입자를 분석 → 분석).
      3. "이미지 계산기"플러그인을 열고 노란색 (→ 프로세스 → 이미지 계산기)에 녹색과 원적외선 채널의 중복의 ROI를 표시됩니다.
   2. 3D 데이터 평가 현미경 이미징 소프트웨어
      1. 의 스택을 표시(3D 시각화 메뉴 →보기 볼륨보기 →) 쇼 볼륨보기 옵션을 사용하여 3D. , 녹색, 빨간색과 원적외선 채널을 선택 밝기와 대비를 조정하고 photoconverted 영역 (그림 1)을 강조 3D 스택을자를 그래픽 인터페이스를 사용합니다.
         참고 : 데이터가 이미지 분석을위한 일반적인 대부분의 소프트웨어에서 사용할 수있는 분석 비슷한 방법.

결과

도 1은 PSmOrange 광 변환 시스템의 일례를 도시한다. 뇌의 복잡한은 척추 동물의 등쪽 간뇌의 보존 구조입니다. 많은 다른 척추 동물에서와 마찬가지로,이 단지는 간뇌 왼쪽 양면 parapineal 세포의 중앙에 뇌의 기관으로 구성되어 있습니다. 우아한하지만 시간이 많이 소요되는 uncaging 실험은 parapineal 세포가 뇌의 기관 ^(13)의 앞쪽 부분에 발생한 것으로 나?...

토론

형광 기자를 운반하는 형질 전환 배아는 배아 발달을 이해하는 것이 근본적으로 도왔다. 그러나, 특정 구조의 특정 시각화를 용이하게하기위한 촉진제 중요한 필요성은 여전히​​ 존재한다. 자신의 부재에서 연구자들은 관심의 그 구조의 기원과 발전에 대해 알고 형광 단백질의 광과 같은 기술에 의존하고 있습니다. 이것은 차례로 개발에 관련된 분자 메커니즘을 식별하는 중요한 조건이다. 제...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
PCR Purification Kit	Qiagen	28104
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit	Ambion	AM1340
RNeasy MiniElute Cleanup kit	Qiagen	74204
Plastic Pasteur	alpha laboratories	LW4000
Original H2B-PSmOrange Plasmid	Addgene	31920	The plasmid described in the paper is available in the Carl lab
FemtoJet Microinjector	Eppendorf	5247 000.013
Forceps (5 Inox)	NeoLab	2-1633
Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System	Nunc	155382
Nikon A1R+	Nikon GmbH Germany	No Number
Nikon PLAN Apo λ 20X air objective	Nikon GmbH Germany	No Number
NIS Elements AR Software (v. 4.30.02)	Nikon GmbH Germany/Laboratory Imaging	No Number