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요약

이 작업은 수용액 중의 단백질의 생체 시츄 비행 시간 형 2 차 이온 질량 분석기 분석을위한 마이크로 액체 취급 및 샘플 도입을위한 프로토콜을 나타낸다.

초록

이 작업은 액체 진공 인터페이스 (SALVI) 및 TOF (-SIMS), 비행 시간 형 이차 이온 질량 분석법으로 분석 시스템을 사용하여 수용액의 단백질의 생체 시츄 특성화 보여준다. 피브로넥틴 단백질 막을 SALVI 감지 영역을 형성하는 상기 실리콘 질화물 (SIN) 막 상에 고정화 하였다. 으로 ToF-SIMS 분석에서, 분석의 세 개의 모드는 높은 공간 분해능 질량 분석법, 2 차원 영상 및 깊이 프로파일 링을 포함하여 수행 하였다. 질량 스펙트럼을 양성 및 음성 모드를 모두 취득 하였다. 탈 이온수는 기준 샘플로서 분석 하였다. 우리의 결과는 물에 피브로넥틴 영화는 혼자 물에 비해 더 독특하고 강한 물 클러스터 피크를 가지고 있음을 보여준다. 아미노산 단편의 특징적인 피크는 단백질 수화으로 ToF-SIMS 스펙트럼에서 관찰 가능하다. 이러한 결과는 표면에 단백질 분자의 흡착 dynamica을 연구 할 수있는 예시에서야 처음으로 액체 환경에서 SALVI 및으로 ToF-SIMS를 사용하여.

서문

수화 구조, 형태 1, 2 단백질의 생물학적 활성을 3 중요하다. 그들을 둘러싼 물 분자가없는 단백질은 실행 가능한 생물학적 활성이없는 것입니다. 특히, 물 분자가 표면 단백질의 내부 구조와 상호 작용 단백질의 상이한 수화 상태는 별개 이러한 상호 작용을 만든다. (4) 고체 표면과 단백질의 상호 작용은 나노, 바이오 물질 및 조직 공학 프로세스의 의미와 기본적인 현상이다. 연구는 긴 단백질이 표면에 발생으로 구조적인 변화가 발생할 수 있음을 지적했다. 으로 ToF-SIMS는 단백질 - 고체 계면을 연구 할 수있는 잠재력을 가지고 기술로서 구상되었다. 5-7 이는 잠재적으로 그 구조의기구의 기본적인 이해를 제공 고체 표면에 단백질의 수화를 이해하는 것이 중요 형태 및 생물학적등 활동.

그러나, 주 표면 분석 기술은 주로 진공 기반 휘발성 액체 연구 직접 애플리케이션 인해 진공 분위기 하에서 휘발성 액체의 신속한 증발하기 어렵다. 우리는 액체 표면과 액체 - 고체 상호 TOF (-SIMS), 비행 시간 형 이차 이온 질량 분석기를 사용하여 직접 관찰을 가능하게하는 액체 진공 인터페이스 (SALVI)에서 분석 호환 미세 인터페이스 시스템에 진공을 개발 하였다. 8- 2) 표면 장력이 개구 내에 상기 액체를 보유하기 위해 사용되는 1) 검출 창 액면 직접 촬상 있도록 직경 2-3 μm 인 개구이며 3) SALVI는 11 독특한 양상은 다음과 같다 여러 분석 플랫폼 사이의 휴대용. (11, 12)

SALVI은 검출 영역 및 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)로 이루어지는 마이크로으로서 실리콘 질화막 (SiN) 막으로 구성된다. 그것은 fabr입니다클린 룸에서 icated하고, 제조 및 핵심 설계 요소는 이전의 논문 및 특허에 자세히 설명되어있다. 8-12 분석 도구 등으로 ToF-SIMS의 응용 프로그램의 일부 수용액 복잡한 액체 혼합물의 다양한 사용하여 시연 하였다 이는 나노 입자가 포함되어 있습니다. 13-17 구체적으로는, SALVI 액으로 ToF-SIMS는 현장 응축 단계에서 새로운 기회를 열어, 라이브 생물학적 시스템 (즉, 바이오 필름), 단일 세포 및 고체 전해질 인터페이스의 액체 - 고체 계면의 프로빙 동적 수 있습니다 으로 ToF-SIMS를 사용하여 액체를 포함하는 연구. 그러나, 현재의 디자인은 아직 기체 - 액체의 상호 작용을 허용하지 않습니다. 이것은 미래의 발전을위한 방향이다. SALVI 처음 본 연구에서 수화 된 막 단백질을 연구하기 위해 사용되었다.

피브로넥틴은 거의 동일한 두 개의 이황화 결합에 의해 연결된 한 쌍의 단량체 (18)로 이루어진, 일반적으로 사용되는 단백질 이량 인 I세포에 결합하는 능력에 대해 잘 알려지. 그것은 모델 시스템으로 선택되었다 (19, 20)을 수화 단백질 막 동적 SALVI 액으로 ToF-SIMS를 사용하는 방식 프로브 될 수 있음을 설명하기 위해. 단백질 용액은 마이크로 채널에 도입 하였다. 12 시간 동안 배양 한 후에, 수화 된 막 단백질의 SiN 막의 배면 측에 형성되어있다. 탈 이온수 (DI) 물은 단백질 도입 한 후의 채널을 씻어 하였다. 정보는 동적으로 ToF-SIMS를 사용하는 마이크로 채널 SALVI 수화 피브로넥틴 단백질 분자로부터 수집 하였다. DI 물은 수화 피브로넥틴 박막에서 얻은 결과와 비교 대조군으로 연구 하였다. 뚜렷한 차이점은 수화 단백질 막 및 DI 물 사이에서 관찰되었다. 이 작업은, 액체 환경에서 표면 단백질 흡착은 신규 SALVI 액상으로 ToF-SIMS 방식을 사용하여 조사 할 수 있음을 확인할 수 있었다. 비디오 프로토콜은 관심이있는 사람들을위한 기술지도를 제공하기위한 것입니다으로 ToF-SIMS와 SALVI의 다양한 애플리케이션을위한 새로운 분석 도구를 활용하고으로 ToF-SIMS 데이터 수집 및 분석뿐만 아니라 액체 처리에 불필요한 실수를 줄일 수있다.

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프로토콜

SALVI 마이크로 채널 1. 청소 및 살균

  1. SALVI의 마이크로 채널의 살균
    1. 주사기 70 % 에탄올 수용액 2 ㎖를 그리 SALVI의 입구 단부와 주사기를 연결하고 천천히 10 분에 액 1 ㎖을 주입. 사출의 끝에서 주사기를 제거한다. 다음으로, 폴리 에테르 에테르 케톤 (PEEK) 조합을 사용하여 SALVI의 입구와 출구를 연결합니다. 대안 적으로, 동일한 절차를 수행하기 위해 주사기 펌프를 사용한다. 예를 들어, 100 μL / 분으로 유동 속도를 설정한다.
    2. 4 시간 동안 실온에서 70 % 에탄올 용액으로 채워진 마이크로 채널 SALVI 유지.
  2. SALVI에 탈 (DI) 물을 소개
    1. 주사기로 멸균 DI 물 2 ㎖를 그리 SALVI의 입구와 주사기를 연결하고 천천히 10 분에 액 1 ㎖을 주입. 주사기를 제거하고, PEEK 조합을 사용하여 SALVI의 입구와 출구를 연결합니다. 에서 언급 한 바와 같이 교대로 시린지 펌프를 사용하여1.1.1.

SALVI에서 단백질 2 막의 고정화

  1. SALVI에서 단백질 막을 고정화
    1. 주사기로 (인산염 완충 염수 중 10 ㎍ / ㎖, PBS) 용액 피브로넥틴 2 ㎖ 그리기 천천히 10 분에 액 1 ㎖을 주입, SALVI의 입구와 주사기를 연결 주사기를 제거하고, 유입 연결 및 SALVI의 출구 PEEK 조합을 사용하여.
    2. 깨끗한 배양 접시에 피브로넥틴 용액을 가득 SALVI 부화 실온에서 12 시간 동안 접시 후드 유지.
    3. 주사기에 멸균 DI 물 2 ㎖를 그리고 SALVI의 입구에 주사기를 연결합니다. 천천히 10 분에서 물 1 ㎖를 주입 주사기를 제거 SALVI의 입구와 출구를 연결한다.
      참고 : 광학 현미경을 갖춘 경우, 죄의 막으로 ToF-SIMS 분석 전에 그대로 있는지 확인하기 위해 현미경으로 SALVI을 확인합니다. 이제 SALVI 장치가 준비으로 ToF-SIMSalysis.

3.으로 ToF-SIMS로드 락 챔버에 SALVI 설치

참고 : SALVI 장치를 처리하고 표면 분석시 발생할 수있는 오염을 방지하기 위해으로 ToF-SIMS 단계에 그것을 설치할 때 장갑은 항상 착용해야합니다.

  1. 스테이지로 마운트 SALVI
    1. 평평하고 깨끗한 표면으로 ToF-SIMS 단계를 놓습니다. 실리콘 웨이퍼의 SiN 막 위쪽으로 향하게 스테이지로 SALVI 장치를 넣습니다. 네 개의 금속 클램프를 사용 SALVI를 해결하고 네 개의 나사에 의해 금속판에 장치의 모서리를 들고 금속편 스크류.
    2. 부드럽게 미세 유체 채널에 연결 PFTE 튜브를 굴립니다. 딱딱한 부분을 누르고 네 개의 금속 조각과 네 개의 나사를 사용합니다. 이 분석에서 차 이온 빔을 방해하지 않도록 장치가 SIMS 스테이지 개방 공간 내에 위치되어 있는지 확인. 추가 이미지와 SALVI의 fabricat의 그림이온 및 설치 이전의 출판물에서 사용할 수 있습니다. 8,9,11
  2. 스테이지로 패러데이 컵을 탑재
    1. 나사에 의해 무대에 패러데이 컵을 수정합니다.
  3. 로 스테이지를 넣으로 ToF-SIMS로드 락 챔버
    1. ,으로 ToF-SIMS의로드 록을 열고 상태에서 로딩 플랫폼에 수평으로 무대를 설정하고,로드 록 도어를 닫습니다.

4.으로 ToF-SIMS 데이터 수집

  1. (10-6 밀리바 또는 토르의 순서에, 예를 들면) 진공 펌프를 켜고 적당한 진공을 보장하기는로드 락 챔버에 도달한다.
  2. 진공이 약 30 분 후 안정화되면 메인 챔버로 SALVI 이동합니다.
    참고 : 진공는 데이터 수집 동안 주요 챔버에서보다 낮은 5 × 10-6 mbar의 진공을해야합니다. 그렇지 않으면, 높은 진공 SALVI 시스템의 누출을 나타낸다.
  3. 함께으로 ToF-SIMS의 기본 이온 빔 분석기를 조정제조업체의 권장 사항에 따라 약 400 나노 미터의 공간 해상도. 사이클 타임은 DC 모드에서 30 마이크로 초 동안 기본 빔 전류는 pA 1200이다.
    참고 :이 과정은 주로 제조업체의 권장 사항을 따른다.
  4. 광학 현미경을 이용하여 미세 유체 채널을 찾을 수 있습니다. 참고로 광학 이미지 센터를 이용하여 이차 이온 화상 중심과 일치하도록 정렬.
  5. 각 측정하기 전에, 표면 오염을 제거하기 위해 ~을위한 500 X 500 μm의 2 영역으로 죄 창에 15 초를 스캔 한 KeV의 O 2 + 빔 (~ 40 nA의)를 사용합니다. 또한, 모든 측정시 표면 충전을 보상하기 위해 전자 홍수 총을 사용합니다. 이 단계에 대한 기본 모드에서 홍수 총의 자동 기능을 사용합니다.
  6. 데이터 수집 전에 양 또는 음의 모드를 선택합니다. 모든 측정의 기본 이온 빔으로 25 keV의 양방향 3 + 빔을 사용합니다.
    참고 : 단계가 유사한 F입니다또는 양성 및 음성 데이터 취득. 공간 관심 포지티브 모드는 여기서 상세하게 설명한다.
    1. 깊이 프로파일 링
      1. 32 픽셀 해상도로 32 픽셀 ~ 2 ㎛의 직경 라운드 영역의 양방향 3 + 빔을 스캔합니다.
      2. 천공 통과하도록 된 SiN 막에 필요한 시간을 최소화하기 위해, 긴 펄스 폭을 사용하여 (예를 들어, 180 나노초 100 마이크로 초 사이클 시간에서 빔 전류 1.0 ~ PA) 3 + 양방향 빔. 액면 상승에 이차 이온 대표 농도는 펀치 쓰루가 도달 할 때. 펀치 - 스루 시간은 죄 멤브레인의 배치에 따라, 300 초에서 500 초로 다릅니다.
        참고 :이 차이가 우리의 경험에 따라 획득 된 SiN 막의 배치 관련이있을 것으로 보인다. 그러나, 펀치 - 스루 시간은 실제로 데이터 분석에 영향을 미치지 않는다.
      3. 죄 막 후-을 통해 펀치에 약 200 초 동안 같은 최신 상태로 유지2D 이미지 복원을위한 충분한 데이터를 얻을 수 있습니다.
      4. 더 나은 질량 해상도 스펙트럼을 얻기 위해 데이터 수집을 위해 80 나노초에 펄스 폭을 줄일 수 있습니다. 에 대한 또 다른 200 초 동안 이번 인수를 계속합니다. 도 1에 도시 된 스펙트럼 데이터는이 영역에서 얻어진다.
    2. 2D 이미징 및 질량 스펙트럼
      1. 깊이 프로파일 데이터를 측정 할 때 동일한 시간에 2 차원 촬상 및 질량 스펙트럼 데이터를 수집한다. 으로 ToF-SIMS 장비는 실험 기간 동안 각 지점의 모든 정보를 저장합니다. (- 스펙트럼, FPanel - 프로필 및 FPanel - 별도 이미지 FPanel) 디지털 제어 소프트웨어의 데이터는 다른 창에 표시됩니다. 신중하게 데이터 수집시 각 패널의 데이터를 확인합니다.

5.으로 ToF-SIMS 데이터 분석

주 : 데이터 분석은 초기 IonToF으로 ToF-SIMS 계기 소프트웨어를 이용하여 수행된다.

  1. 를 엽니 다다음, SIMS (측정 탐색기) 그리고 alysis 소프트웨어 깊이 프로파일, m / z 스펙트럼 화상 데이터를 처리하기 위해, 각각, "정보", "스펙트라"및 "화상"버튼을 클릭.
  2. 확장 ".ita"이 데이터 파일을 엽니 다.
  3. 관심 피크를 선택 "이온"상자에 종의 이름을 입력 한 스펙트럼에서 다른 색깔로 레이블을 붙입니다. x 축을 따라 끌어 마우스 스크롤 휠을 사용합니다. 피크의 높이와 폭을 조정 Ctrl 키와 스크롤 휠을 사용합니다. y 축을 따라 선형 및 로그 모드 사이의 문자 "L"로 전환됩니다.
  4. 질량 교정하기 전에 데이터 재구성을 실시한다. 그렇지 않으면 질량 교정 단계에서 피크들 사이의 간격을 선택하는 것이 곤란하다.
    1. 관심의 깊이 프로파일 링 데이터를 선택하고 깊이 프로파일 시간 시리즈에 따라 스펙트럼을 재구성.
    2. 복원 버튼을 클릭합니다. INT의 스캔 범위에서 "시작 재건"창에 입력erest. 깊이 프로파일 데이터를 재구성하는 "OK"를 클릭합니다.
  5. 질량 보정을 수행합니다. 보도는 "F3"는 "질량 교정"창을 엽니 다. 특정 샘플에 따라 교정을위한 피크를 선택합니다. (21) 본 연구에서는 다음과 같은 피크를 사용 CH 3 + (m / z 15), H 3 O + (m / z 19), C 2 H 5 + (m / z 29 ), H 5 O 2 + (m / z 37), C 3 H 7 + (m / z 43), H 7 O 3 + (m / z 55), H 9 O 4 + (m / z 71) H 11 O 5 + (m / z 99)와 긍정적 인 모드 H 13 O 6 + (m / z 109). 다음 봉우리 CH 사용 - (m / z 13), O - (m / z 16), OH - (m / z 17), C 2 H - (m / z 25), C 3 H - (m / z 37), 및 C 4 H - (m / z 49) 부의 모드.
    1. 피크를 선택,아래쪽 화살표가 윈도우의 왼쪽 하단 모서리에 절정에 지적되어 있는지 확인하십시오. 피크를 클릭하고 "질량 교정"창에서 피크 이름을 입력 "추가"를 클릭 한 관심의 이온은 질량 교정에 포함되어 있습니다.
    2. 마지막으로, "다시 보정"버튼을 클릭합니다. 피크의 영역 비율을 부과하는 그들의 질량에 따라 올바른 위치에 있는지 확인하십시오. "스펙트럼"메뉴에서 선택하여 수행되는 특정 분석에 따라 "적용 질량 교정"을 "모든 스펙트럼"또는 "선택한 스펙트럼"을 클릭합니다.
  6. 피크 선택 시료 분석에 필요한 바와 같이, 문헌 또는 다른 이전 결과에 따라 샘플의 특징적인 피크를 결정한다. m / Z 스펙트럼에 대한 관심의 피크의 강도를 비교합니다. 필요한 경우, 피크 목록 쓸모 피크 새로운 피크를 추가하거나 삭제할.
    1. 피크를 추가합니다. , 피크를 클릭하면 왼쪽 아래 창에 붉은 줄을 찾을 수 있습니다. 홀리D 'Ctrl 키 "키 자동 피크 목록에 추가 피크의 피크 폭을 정의하는 가로 스크롤 마우스. 피크를 추가하는 또 다른 방법은 창 위의 '피크를 추가 "버튼을 클릭 한 다음 주 스펙트럼 창에서 피크를 선택하는 것입니다. 새롭게 문을 연 창에 관련 사양, "스펙트럼"메뉴에 추가 "검색 봉우리"를 선택, 확인하는 많은 봉우리가있는 경우 필요에 따라 다음 피크를 추가 할 수 있습니다.
    2. "피크 목록"메뉴에서, 피크 목록을 내보내려면 선택 "itmil"형식으로 피크 목록 "... 저장". 스펙트럼을 따라 드래그 Ctrl 키와 왼쪽 버튼을 사용합니다. 스펙트럼 창에서 관심의 피크를 선택하고 원하는 위치에 두 개의 점선을 끕니다.
    3. 피크 목록을 가져 오려면, "대용량 간격 목록"메뉴에서 "가져 오기 ...", 파일 확장자 ".ITPL"와 기존의 피크 목록 파일의 위치를​​ 선택합니다. "열기"를 클릭합니다.
    4. 에, "itmil"피크 목록을 사용하려면"대용량 간격 목록"메뉴는 "열기 ..."를 클릭하여 파일을 찾을 후 "열기"를 클릭합니다.
  7. 추가 데이터를 분석하는 피크 목록을 적용합니다. "스펙트럼"윈도우의 왼쪽 하단에 "대용량 간격 목록"라는 창이있다. 수입 피크 목록은 여기에 표시됩니다.
    1. , 사용 피크 목록 파일을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 "활성 스펙트럼"또는 "모든 스펙트럼 '에 적용합니다.
  8. 데이터 프로파일을 볼 수 있습니다. "프로필"창에서 사용 문자 "M"은 y 축에 맞게 창 (전체 범위) 및 문자 "N"을에 맞게. Ctrl 키를 사용하여 프로파일 폭을 조정 휠을 스크롤합니다. 또는 Y 축 범위와 높이를 변경 키 보드의 "*", "/"를 사용하고.
  9. 또한 초기 분석 후 다른 그래픽 소프트웨어를 사용하여 플롯에 대한 데이터 내보내기.
    1. "파일"메뉴를 클릭 "프로필"창에서, 깊이 프로파일을 내보내려면 다음 "내보내기 & #을 선택(34), 및 다음 선택 "이 .txt"파일 "로 저장"을 선택합니다.
    2. , "스펙트럼"창에서, m / Z 스펙트럼 파일을 내보내 '파일'메뉴를 클릭 한 다음 "내보내기"를 선택한 후 "이 .txt"파일 "로 저장 '을 선택합니다.
    3. "이미지"창, 인쇄 화면에서 이미지 파일을 내 보낸 이미지 파일로 저장합니다.

6.으로 ToF-SIMS 데이터 플로팅 및 프리젠 테이션

참고 : SIMS 데이터가 쓸모 소프트웨어를 사용하여 처리 한 후 데이터를 플롯하는 그래픽 도구를 사용합니다.

  1. 데이터를 가져 그래픽 도구를 사용합니다.
  2. 재구성 된 스펙트럼을 표시하는 y 축으로서 X 축 및 피크 세기로 m / z를 사용하여 곡선을 만든다. 예를 그림 1에 제시되어있다.
  3. 재구성 된 깊이 프로파일의 시간 시리즈를 표시하는 y 축으로서 X 축 및 피크 세기로 스퍼터 시간을 사용하여 곡선을 만든다. 예를 Figu에 제시되어있다2를 다시.
  4. 다른 m / z의 복원 된 2 차원 영상을 결합 이온 매핑을 표시하는 매트릭스를 형성한다. 예를 그림 2에 제시되어있다.

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결과

대표적인 결과의 커플은 제안 된 프로토콜의 장점을 보여주기 위해 제공됩니다. SALVI 미세 인터페이스를 사용하여, 기본 이온빔 (BI + 3)가 직접 DI 물에서 수화 피브로넥틴 필름 포격있다. 따라서 액체 표면의 분자 화학 매핑 성공적 얻을 수있다.

도 1a 각각 수화 피브로넥틴 막 및 DI 물의 양으로 ToF-...

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토론

SALVI 등으로 ToF-SIMS 및 주사 전자 현미경 (SEM)과 같은 진공 기반기구에 의해 동적 액면과 액체 - 고체 계면 분석을 허용 미세 인터페이스이다. 작은 구멍의 사용은 직접 진공 액체에 노출하기 때문에, SALVI은 수정없이 많은 미세하게 초점을 맞춘 분광기 및 이미징 기술에 적합한 22 이동성과 미세 유체의 다양성이 진정한 멀티 모달 이미징 플랫폼입니다. 별개의 기능 및 기존의 기술에 비해 SA...

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공개

The authors have nothing to disclose.

감사의 말

We are grateful to the Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) Chemical Imaging Initiative-Laboratory Directed Research and Development (CII-LDRD) and Materials Synthesis and Simulation across Scales (MS3) Initiative LDRD fund for support. Instrumental access was provided through a W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) Science Themed Proposal. EMSL is a national scientific user facility sponsored by the Office of Biological and Environmental Research (BER) at PNNL. The authors thank Mr. Xiao Sui, Mr. Yuanzhao Ding, and Ms. Juan Yao for proof reading the manuscript and providing useful feedback. PNNL is operated by Battelle for the DOE under Contract DE-AC05-76RL01830.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
ToF-SIMSIONTOFTOF.SIMS 5Resolution: >10,000 m/Δm for mass resolution; >4,000 m/Δm for high spatial resolution 
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI)Pacific Northwest National LaboratoryN/ASALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum-based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
PEEK UnionValcoZU1TPKfor connecting the inlet and outlet of SALVI
5 Axes Sample StageIONTOFN/AStage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS
Barnstead Nanopure Water Purification SystemThermo Fisher ScientificD11921ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
SyringeBD3096591 ml
PipetteThermo Fisher Scientific21-377-821Range: 100 to 1,000 ml
Pipette TipNeptune2112.96.BS1,000 µl
Centrifuge TubeCorning43079115 ml
FibronectinSigma-AldrichF11411 mg/ml
EthanolThermo Fisher ScientificS25310A95% Denatured
Gibco PBSThermo Fisher Scientific10010-023pH 7.4

참고문헌

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