결합 된 방법론을 활용하여 축삭 분기 및 신경 세포 형태 형성 동안 플라즈마 멤브레인 배달의 역할을 정의합니다

요약

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

초록

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

서문

Recent estimates suggest that the human brain contains 10¹¹ neurons with 10¹⁴ synaptic connections¹, highlighting the importance of axon branching in vivo. Extracellular axon guidance cues such as netrin-1 guide axons to appropriate synaptic partners and stimulate axonal branching, thereby increasing synaptic capacity^2-5. Netrin-1-dependent axonal arborization involves substantial plasma membrane expansion⁶, which we hypothesized requires delivery of additional membrane components via SNARE complex dependent exocytic vesicle fusion⁷.

Investigating the role of SNARE-mediated exocytosis in netrin-1 dependent axon branching is complicated by several factors. First, the heterogeneity of cortical neurons increases the sample size required to identify significant effects, complicating single cell techniques like imaging. Second, although biochemical techniques permit observation of changes that occur at the population level, they lack the temporal and spatial resolution necessary to localize plasma membrane expansion to the axon in the time frame of axon branching. Lastly, although axon branches form over hours, the cellular changes that contribute to axonal extension may begin within minutes and occur on the order of seconds, thus extending the temporal scope for experimental consideration.

We outline a multi-technique approach that addresses these diverse temporal and spatial scales of exocytosis and axon branching, and thus enhances our understanding of the fundamental cellular mechanisms. Utilizing these approaches provides evidence that supports a critical role for SNARE-mediated exocytosis in axon branching.

프로토콜

연구 윤리의 진술 : 여기에 설명 된 동물을 포함한 모든 실험은 규칙과 동물 관리에 UNC위원회의 규정과 관리 및 실험 동물의 사용을위한 NIH 기준이 적용됩니다.

1. 준비 및 해리 두피 뉴런의 도금

1. CO에 의해 자궁 경부 전위 다음 ₂ 흡입을 초과 임신 여성을 안락사. 각 반구에서 배아 일 15.5 (E15.5) 마우스 및 microdissect 피질의 두개골에서 전체 뇌를 제거합니다. Viesselmann 등의 알 ^(8)를 참조하십시오 배아 마우스 피질의 미세 절제에 관한 자세한 지침.
2. 멸균 1.6 ml의 마이크로 튜브에 해부 미디어 1 ㎖에는 4 개 이상의 피질을 배치합니다. 10 배 트립신의 120 μl를 추가하고 관 3 반전 - 혼합 5 회.
3. 혈구를 사용하여, 세포는 세포 배양 접시를 시드 계산합니다. 주 : 1 피질 반구가 제공하는 approximately 삼백만 세포.
   1. SDS 방지 SNARE 복잡한 생화학 분석의 경우, 35mm 접시 당 육백만 세포를 판과 상태에 따라 두 가지 요리를 이용한다. 주 :이 여러 조건을 비교하면 6 웰 플레이트를 사용함으로써 단순화된다.
   2. 분지 분석 들어 질산 접시 뉴런 150,000의 밀도로 축삭 분지 판 DIC 이미징, 35mm 접시 당 250,000 세포의 밀도로 순환 된 커버 세척 하였다. 이 밀도는 인구 과잉을 방지하고 분석을 단순화합니다.
4. 라이브 셀 TIRF 현미경의 경우, 실온에서 nucleofection 솔루션에 형질 전환 당 이백 만 신경을 재현 탁.
   1. 제조 업체 프로토콜 ^(9)에 따라 nucleofector와 VAMP2 - pHlourin 발현 플라스미드 및 electroporate 10 μg의 포함 된 마이크로 튜브에 세포 현탁액 100 μl를 추가합니다.
   2. 형질 즉시 트립신 담금질 매체의 500 μl를 추가 한 후, 서재에서 큐벳 및 플레이트 세포 현탁액을 제거35mm PDL 코팅 유리 바닥 접시 당 400,000 세포의 SITY.
5. 플레이트 혈청이없는 배지 2 ㎖의 모든 대뇌 피질의 뉴런.

2. SNARE 복합체 형성의 분석

참고 : SDS 방지 SNARE 복합체 처리 원래 아래에 자세히 설명 수정과 ^(10)를 기술 된 바와 같이 분석 하였다. 여기에 사용 된 것과 검증 된 대안 항체를 들어, 자료 섹션을 참조하십시오.

1. 이전의 용해에 1 시간 동안 250 NG / ㎖ netrin-1 또는 가짜 제어 시험 관내 (DIV)에 E15.5 대뇌 피질의 뉴런 2 일 자극한다.
2. 처리 샘플, 37 ° C 4 ° C로 냉각 원심 분리기 및 설정 수조 온도 100 ° C의 열 블록에 이전.
3. 인큐베이터에서 세포 요리를 제거하고 얼음에 배치합니다.
   1. 세척 당 2 분 - 세포에서 대기음 매체는 2 ~와 ml의 얼음 추위 인산염 완충 식염수 (PBS) 1 부드럽게 2 번 교체합니다.
   2. 이 분석을 위해, 콘드 당이 우물을 사용ition.
   3. 조건의 첫 번째 우물에서 대기음 PBS와 250 μl의 균질화 버퍼로 교체합니다. 얼음에 세포를 균질화, 5 분간 얼음에두고, 다음 셀 리프터를 사용.
   4. 동일한 조건의 다음 잘에서 PBS를 기음과 우물에 최근 균질 혼합물을 추가합니다. 이 단백질의 농도를 증가시킬 것이다. 모든 조건에 대해 반복합니다.
   5. 완료되면, 피펫 얼음에 미리 냉각 된 1.6 ml의 마이크로 튜브에 균질 액을 1 % 트리톤-100의 최종 농도에 도달하기 위해 20 % 트리톤-100을 추가한다. 거품을 최소화하면서 1000 μL 피펫으로 10 시간 혼합 씹다.
4. 2 분 단백질을 가용화하는 얼음 튜브 부화. 4 ° C에서 6010 RCF에서 10 분 동안 배양, 원심 분리기에 이어 비 가용성 물질을 펠렛합니다. 얼음에 새로운 냉장 1.6 ML 튜브에 해물 뜨는 이동합니다.
5. 브래드 포드 분석 ^(11)를 사용하여 단백질 농도 분석을 수행하고 FINA에 샘플을 희석B-Mercaptethanol (BME)으로 보충 된 1 % 트리톤 -100 5 배 샘플 버퍼가 보충 균질화 완충액 남은가 5mg / ml - 3 L의 단백질 농도.
6. 이 튜브에 균등하게 각 실험 샘플을 나눈다. 30 분 (SNARE 복합체), 30 분 (SNARE 단량체) 100 ° C에서 다른 37 ° C에서 하나의 샘플을 인큐베이션. 용액의 샘플을 유지하기 위해 간헐적 튜브 전환.
7. SDS-PAGE로 분리 할 준비가 될 때까지 -20 ℃에서 동결 된 샘플. 100 ° C에서 5 분 동안 끓인 이전 샘플 재비 표준 기술을 사용하여 전기 영동을 통해 샘플을 실행하지만, RT에서 37 ° C 샘플을 해동 종래.
8. 샘플의 실행 중복 (30 - 샘플 당 단백질 40 μg의) 8 %와 15 % 겔 모두; 15 %의 SNARE 단백질 단량체 (SNAP-25 ~ 25kDa, VAMP2 ~ 18kDa, 신택-1 ~ 35kDa)을 정량화하는 데 사용되는 반면, 8 %는 단지의 이상적인 분리를 제공합니다. 염료 라인이 STAC 통해까지 70 V에서 전원을 유지90V에 왕 젤 증가 전압. 염료 전원이 소모 될 때까지 젤을 실행합니다.
9. 단량체을 유지하려면 45 분 70 V에서 20 % 메탄올 (메탄올)을 첨가하여 차가운 전송 버퍼를 사용하여 얼음에 0.2 μm의 니트로 셀룰로오스 막에 단백질을 전송합니다.
10. O 2 시간 동안 덮여 접시에 건조 막 / RT에서 N (O / N이 최상의 결과를 제공한다).
11. 블록은 RT에서 1 시간 동안 10 %의 소 혈청 알부민 (BSA)의 복합 막을 스네어.
12. 회전 진탕 기에서 4 ° C에서 1,000 프로브 O / N : 1의 희석 (특정 SNARE 복합체 구성 요소 인식) 일차 항체를 준비합니다.
    1. 트리스 완충 식염수 플러스 0.1 % 트윈 20 (TBS-T) 5 분마다 3 번에 말을 씻어.
13. 1의 희석에 형광 차 항체 솔루션을 준비 : 20,000 1 %의 TBS-T에서 BSA와 프로브를 RT로 덮여 1 시간에 대해. 1 시간 후 단계를 반복 2.12.1.
14. 형광 스캐닝 시스템의 이미지도 말은 소프트웨어 스위트를 장착하고 SNARE 단백질의 공동 모두 정량화직사각형의 ROI를 그리기위한 제조업체의 지침을 사용하여 (각각 25 kDa의 18 kDa의, SNAP-25, VAMP2 35 kDa의에서 면역 밴드와 신택-1) mplex (40kDa 위의 면역 밴드)와 단량체 밴드.

TIRF 현미경을 통해 3 이미징 Exocytic 이벤트

이 프로토콜은 온도, 습도, CO _(2), epifluorescent 조명하는 고배율 / 높은 개구 수 (NA) TIRF 목적 자동화 된 XYZ 스테이지를 구비 한 반전 TIRF 현미경을 유지하는 환경 챔버를 포함 특수 현미경 장비를 필요로하고, 참고 민감한 전하 결합 소자 (CCD) 검출기. 이 프로토콜은 100 배 1.49NA TIRF 목표 고체 491 nm의 레이저 및 전자 배가 CCD (EM-CCD)를 장착 한 완전 자동화 된 거꾸로 현미경을 사용합니다. 모든 장비는 이미징과 레이저 제어 소프트웨어에 의해 제어된다. envir 이전에 처음으로 촬상 프로토콜 전력onmental 실, 무대, 조명, 컴퓨터, 카메라.

1. 이미징 소프트웨어 내에서 선택의 목적. 대물가 제자리에 있으면, 칼라 주위 대물 히터를 고정.
2. 그 목적은 단 슬롯에 무대 인큐베이터을 확보하기 전에 완전히 내려 확인합니다. 유출을 방지하기 위해 균등 단계 인큐베이터 입구에 증류수를 붓는다.
3. 배양 시스템을 켭니다. _{이산화탄소} 탱크 밸브를 열어 압력이 제조업체의 지침에 따라 시스템에 적합한 확인합니다. 실을 5 % CO _2, 37 °의 C에 도달하는 시간을 허용합니다. 촬상 접시를 첨가하기 전에, 대물 물 응축을 피하기 위해 인큐베이터에서 빈 접시를 배치했다.
4. 레이저 소스의 전원을 켭니다.
5. 오픈 스테이지 인큐베이터와 렌즈에 침지 기름을 추가 할 수 있습니다. 인큐베이터에서 샘플을 놓고 안정성 무기 또는 접시의 무게와 안정. 오일 샘플의 바닥에 닿을 때까지 대물을 올린다. Switc투과광 조명에 시간과 접안를 통해 신경 세포의 초점면을 찾을 수 있습니다.
6. 레이저 소프트웨어를 시작하고 레이저 제어 소프트웨어에 연결합니다. 위드와 목적이 사용되는 선택 조명을 설정 (100X 1.49 NA TIRF 권장). 샘플의 설정 굴절률 (셀 ~ 1.38). 491 nm의 레이저에 대해 "TTL"를 취소하여 레이저 강도를 조정합니다. 40 % - 다음 20 사이의 값으로 다시 아래로 가져 (100) 슬라이더를 조정합니다. "TTL"을 다시 확인.
7. 투과광 조명에 다시 샘플에 초점을 맞 춥니 다. 이미징 소프트웨어로 이동하여 491 nm의 레이저 조명 및 오픈 셔터를 선택합니다. 미세 천장에 레이저의 초점을 조절하고 제거 응축기와 닫힌 필드 다이어프램의 중앙 지점을 중심. 그래서하지 스크래치 렌즈에 거꾸로 광학 벤치에 콘덴서를 배치합니다.
8. 콘덴서를 교체하고 110 nm의 TIRF 소프트웨어 및 설정 침투 깊이 (PD)로 이동합니다. TIRF의 ILLUM에 위드 조명에서 전환이미징을위한 ination 모드.
9. epifluorescent 광원으로 위드 표면 형광을 사용하여 접안을 통해 발현 세포 VAMP2-phluorin를 찾을 수 있습니다.
   1. 촬상 파라미터 (노출 시간, 게인 및 레이저 파워) (예 photobleaching에 및 광독성 줄이는 최소 노출 시간 및 레이저의 강도를 사용하여 노이즈 비율과 동적 범위의 신호를 최대화하도록 조정 : 50 ~ 노광 - 100 밀리 초, 15로 - 30 30 % 최대 레이저 파워)에서 얻을 수 있습니다.
   2. 셀 당 설정 연속 자동 초점. 인수는 5 분 동안 매 0.5 초마다 발생으로 설정 timelapse에 이미지를 획득. netrin 1 자극 조건, 층류 후드에서 세포의 접시-1 NG netrin 500 / ㎖를 추가로 촬상 전에 1 시간 동안 인큐베이터에 접시를 반환한다.
10. , ImageJ에 오픈 이미지 스택> 열기> 파일 이름 (그림 창에 파일을 드래그하거나 파일로 이동하여 셀 영역 및 시간 당 정상화 exocytic 이벤트의 빈도를 정량화하기0; 2A 인셋 1).
    1. 평균 강도 : 소포 융합 이벤트를 나타내지 않는 안정된 형광 신호를 제거하려면 이미지> 스택> Z-프로젝트> 프로젝션 유형을 사용하여 전체 스택의 평균 Z 투영을 만듭니다. > 프로세스를 사용하여 timelapse에> 이미지 계산기 각 이미지에서 이미지 1을이 평균 이미지를 빼기 : 스택 작업 : 이미지 2를 새롭게 생성 된 평균 Z 투영을 뺍니다. 이 exocytic 이벤트 (- 3 그림 2A 삽입 된 2)를 강조한다.
    2. 눈으로 exocytic 융합 이벤트를 계산합니다. Exocytic 이벤트 급속 VAMP2-phluorin 플라즈마 막 (도 2A 인셋 6) 내에 확산으로 확산 회절 제한된 형광 신호의 모양으로서 정의된다.
    3. > 이미지를 사용하여 첫 번째 이미지를 강조 조정> 임계 값> 전체 셀이 임계 값 (- 8 그림 2A 삽입 된 7)를 강조 표시 될 때까지 슬라이더를 조정 임계 값 명령을 사용하십시오.
    4. 아나에서lyze, SetMeasurements을 선택하고 영역 표시 라벨을 확인합니다. (- 8 그림 2A 삽입 된 7)을 측정하기 위해 지팡이 추적 도구를 눌러 'm'을 사용하여 역치 휴대 영역을 선택합니다.
    5. 모두 exocytic 융합 이벤트 카운트 환승, 스프레드 시트 셀 면적을 측정하고, 경과 촬상 시간 exocytic 이벤트 / ² mm / 시간의 수 (도 2A 인셋 9)를 산출한다.

4. 미분 간섭 대비 (DIC) 축삭 분기의 Timelapse입니다 현미경

참고 : DIC 이미징에 대한 일반적인 접근 방식에 대한 전체 프로토콜 및 데모 ^(12)을 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 DIC를 이용하지만, 다른 투과광 현미경 법 (예 : 위상차)를 동일한 목적으로 사용될 수있다.

1. 2 DIV에서, 사전 예열 환경 챔버에 형질 감염되지 않은 신경 세포를 포함하는 장소의 유리 바닥 이미징 요리는 습기 ENV를 유지하기 위해5 % CO _2, 37 ° C로 ironment. 최고의 이미지 품질과 해상도를 A A 60X 계획 - 고차 색지움 장착 현미경, 1.4 NA DIC 대물 렌즈와 높은 NA 콘덴서를 사용한다.
2. 투과광 조명을 사용하여 접안을 통해 신경 세포를 찾기 위해 초점면을 조정합니다.
3. 이미징 소프트웨어의 다중 영역 취득 기능을 이용하여 검색 및 적어도 106 세포의 XYZ 위치를 저장한다. 무대를 위치 있도록 최상의 결과를 위해 시야 내에서이자 맞는 뉴런.
   1. 250 NG로 자극 / ㎖ netrin-1를 눌러 '다중 영역 획득을 시작'. 순차적으로 필요에 따라 수집 및 재 초점을 일시 중지, 24 시간 동안 각각의 위치에서 매 20 초 영상을 획득.
4. 다중 차원 데이터> 열린 파일 이름을 검토> 앱을 사용하여 이미징 소프트웨어에서 이미지를 검토합니다. 안정적인 축삭 분기 (20 μm의 길이) 이미징 세션 동안 그 형태를 확인합니다. stableaxon의 branc을 측정하기 위해 선 그리기 도구를 사용하여끝으로 축삭의 기지에서 시간은 20 μm의 길이 자격이 충족되어 있는지 확인합니다.
   1. 막 돌기 초기 지점의 길이가 20 ㎛의 지점에 도달하면 이후뿐만 아니라 netrin 자극 후의 프레임 번호 형성 영역에서 시작할 때 스프레드 시트, netrin 자극 후에 프레임 번호를 기록한다.
   2. 브랜치마다의 형성 시간을 계산하기 위해 20 초만큼 돌출 형성 분기 간의 프레임 수를 곱한다.

5. 독소 노는 및 고정 세포 면역 형광

1. 2 DIV에서 250 NG와 실험 조건에서 신경 세포를 치료 / ㎖-netrin 1 및 / 또는 10 nM의 보툴리눔 효과적으로 / ㎖ netrin- ng를 SNARE 매개 세포 외 유출 ^(13), 플러스 (250)을 억제 절단 스네어 단백질 SNAP25 및 독소 (BoNTA) 1. 제어 조건으로 처리되지 않은 뉴런의 한 세트를 남겨주세요.
   주의 : 준비하고 사용하는 경우 BoNTA는 눈과 호흡기 보호의 사용을 필요로솔루션을 제공합니다. 가능한 한 빨리 생물학적 물질 및 오토 클레이브 등 모든 오염 물질을 유지한다.
2. 3 DIV (24 시간 후 처리) 흡인 미디어, 즉시 PHEM 수정 (자세한 내용은 표 1 참조) 중 적어도 1 ml의 교체에서 37 ° C로 예열. 실온에서 어둠 속에서 20 분 동안 품어.
3. (4 ° C에서 파​​라 필름 및 저장과 향후 사용 인감을위한) PBS로 3 배를 씻어.
4. 장소 어두운, 가습 염색 실 커버 슬립과 (10 % 트리톤-100 재고에서 만든) PBS에서 갓 희석 0.2 % 트리톤-100에서 10 분 동안 세포막을 Permeabilize 하시려면.
5. permeabilization 솔루션을 제거하고 PBS와 1X의 50 μl를 씻어. 30 분 동안 블록 ~ PBS (BSA-PBS)에 10 % 소 혈청 알부민의 50 μl의 10 %가 RT에서 PBS에 당나귀 혈청 삶은.
6. 다시 1X PBS로 씻어. 실온에서 1 시간 동안 1 % BSA-PBS에서 : (신경 세포의 신원을 확인하기 위해 1000 βIII의 tubulin의 1) 차 항체의 50 μL에 커버 슬립을 품어, 어두운 데에서.
7. PBS로 3 배 5 분 세척을 수행합니다. 튜 불린 (1 : 400)에 대한 스펙트럼-별개의 이차 항체의 50 μL에 커버 슬립을 품어, 형광 팔로이 딘 (여기에 따라 다릅니다 : 100 일에서 488 팔로이 딘 : 400, 647 팔로이 딘 1에서) 1 시간 동안 1 % BSA-PBS에서 .
8. 1X PBS로 3 배 5 분 세척하고 설치 미디어의 슬라이드 위에 커버 슬립을 탑재합니다.
9. 명확한 매니큐어로 커버 슬립과 씰의 가장자리에서 진공 초과 장착 매체.
10. 40 배 1.4NA의 목적, epifluorescent 기능과 EM-CCD와 거꾸로 현미경에 위드 표면 형광 이미지를 수집합니다.
    1. 수동 ImageJ에를 사용하여 분기 분석 할 수 있습니다. 창에 파일을 드래그하거나> 열기> 파일 이름 (그림 4A 인세 1에게) 파일로 이동하여 ImageJ에있는 이미지 열기 스택.
    2. 라인> 분할 줄을 사용하여, 소마 (- 3도 4a 인세 2)에서 연장이 가장 긴 신경 돌기로 정의 축삭을 추적.
    3. 분석> 도구> 투자 수익 (ROI) 관리자를 사용하여 관심 영역으로 추적 축삭을 저장합니다. 추적 및 길이에 신경 돌기 ≥20 μm의 정의 각 축삭 지점을 저장합니다. 분석 (- 4도 4a의 삽입 3)에서 (직접 축삭에서 돋의 outgrowths) 만 주요 지점을 포함합니다.
    4. 를 눌러 'm'은 관심의 저장 영역을 측정하고 μm의 길이를 계산하기 위해 스프레드 시트로 픽셀 단위로 길이를 전송합니다.
    5. 100 μm의 길이 엑손 당 분기 수를 얻기 위하여 100 μm의 분할에서 엑손의 길이만큼 길이가 ≥20 ㎛의 축삭 분기 수를 나눈다.

결과

시험관 내 생화학 적 기법을 활용하는 것은. 뉴런의 인구 SDS 방지 SNARE 복합체의 양을 분석 그림 1 SNAP-25, syntaxin1A 및 VAMP2에 대한 프로브 SDS 방지 SNARE 복잡한 분석의 결과 웨스턴 블롯 다음 완료를 보여줍니다.

기저 세포막에서 TIRF 현미경 단셀의 개체 exocytic 융합 이벤트의 높은 해상도 이미지를 제공?...

토론

Axon branching is a fundamental neurodevelopmental process and underpins the vast neuroconnectivity of the mammalian nervous system. Understanding the mechanisms involved in localized plasma membrane expansion is integral to our understanding of both normal and pathological neurodevelopment. The use of a multipronged approach incorporating both population level and single cell level methodologies enhances reproducibility and increases spatial and temporal resolution without compromising population level analysis. At the ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well tissue culture treated plates	Olympus Plastics	25-105
glass coverslips	Fisher scientific	12-545-81	12CIR-1.5; must be nitric acid treated for 24 hours, rinsed in DI water 2x, and dried prior to use. Must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells.
Amaxa nucleofection solution	Lonza	VPG-1001	100 ml/transfection
Amaxa Nucleofector/electroporator	Lonza		program O-005
35 mm Glass bottom live cell imaging dishes	Matek Corporation	p356-1.5-14-C	must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells
Olympus IX81-ZDC2 inverted microscope	Olympus
Lambda LS xenon lamp	Sutter Instruments Company
Environmental Stage top incubator	Tokai Hit
100x 1.49 NA TIRF objective	Olympus
Andor iXon EM-CCD	Andor
Odyssey Licor Infrared Imaging System	LI-COR	Odyssey CL-X	Used for scanning blots
Image studio software suite	LI-COR		Used for scanning on the Odyssey Infrared system; Image studio lite used for offline analysis of blots
Metamorph for Olympus	Molecular devices, LLC	version 7.7.6.0	Software used for all imaging and the analysis of DIC timelapse
CELL TIRF control software	Olympus		Software used to control lasers for TIRF imaging
Fiji (Image J)	NIH	ImageJ Version 1.49t
60x Plan Apochromat 1.4 NA objective	Olympus
40x 1.4 NA Plan Apochromat objective	Olympus
Neurobasal media	GIBCO	21103-049	Base solution for both serum free and trypsin quenching media
Supplement B27	GIBCO	17504-044	500 ml/50 ml Serum free media and Trypsin Quenching media
L-Glutamine		35050-061	1 ml/50 ml Serum free media
Bovine serum albumin	Bio Basic Incorporated	9048-46-8	10% solution in 1x PBS for blocking coverslips; 5% solution in TBS-T for blocking nitrocellulose membranes.
10x  trypsin	Sigma	59427C
HEPES	CELLGRO	25-060-Cl
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)+ Ca + Mg	Corning	21-030-cm
Fetal bovine serum	Corning/CELLGRO	35-010-CV
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning/CELLGRO	20-021-CV
NaCl	Fisher scientific	BP358-10
EGTA	Fisher scientific	CAS67-42-5
MgCl2	Fisher scientific	BP214-500
TRIS HCl	Sigma	T5941-500
TRIS base	Fisher scientific	BP152-5
N-Propyl Gallate	MP Biomedicals	102747
Glycerol Photometric grade	Acros Organics	18469-5000
Glycerol (non optics grade)	Fisher scientific	CAS56-81-5
B-mercaptoethonal	Fisher scientific	BP176-100
SDS	Fisher scientific	BP166-500
Distilled Water	GIBCO	152340-147
Poly-D-Lysine	Sigma	p-7886	Dissolved in sterile water at 1 mg/ml
Botulinum A toxin BoNTA	List Biological Laboratories	128-A
Rabbit polyclonal anti human VAMP2	Cell signaling	11829
Mouse monoclonal anti rat Syntaxin1A	Santa Cruz Biotechnology	sc-12736
Goat polyclonal anti human SNAP-25	Santa Cruz Biotechnology	sc-7538
Mouse monoclonal anti human βIII-tubulin	Covance	MMS-435P
Alexa Fluor 568 and Alexa Fluor 488 phalloidin, or Alexa Fluor 647	Invitrogen
LI-COR IR-dye secondary antibodies	LI-COR	P/N 925-32212,P/N 925-68023, P/N 926-68022	800 donkey anti-mouse, 680 donkey anti rabbit, 680 donkey anti goat
0.2 μm pore size nitrocellulose membrane	Biorad	9004-70-0
Tween-20	Fisher scientific	BP337-500
Methanol	Fisher scientific	S25426A
Bromphenol Blue	Sigma	B5525-5G
Sucrose	Fisher scientific	S6-212
Paraformaldehyde	Fisher scientific	O-4042-500
Triton-X100	Fisher scientific	BP151-500
TEMED	Fisher scientific	BP150-20
40% Bis-Acrylimide	Fisher scientific	BP1408-1
Name	Company	Catalog Number	Comments
Alternative Validated Antibodies
Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 clone	Sigma Aldrich	S0664
Mouse Monoclonal Synaptobrevin 2 (VAMP2)	Synaptic Systems	104-211
Mouse Monoclonal SNAP25	Synaptic Systems	111-011