의식 설치류에서 신장 기능의 경피 평가

요약

Determination of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional procedures to measure this parameter are cumbersome and require a large investment of time. Here we describe a faster and minimally invasive method to determinate GFR transcutaneously.

초록

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and time-consuming. In addition, serial blood or urine samples are required, with the associated stress for the experimental animals. A recent technique significantly reduces the investment in time and resources, minimizing the invasiveness and the animal stress, but being equally valid as the traditional approaches. The method measures transcutaneously renal function. Using an optical device and the exogenous renal marker fluorescein isothiocyanate (FITC)-sinistrin, this technique is capable of measuring the elimination kinetics of the marker through the skin. With neither blood nor urine samples nor the associated laboratory assays needed, the results of the transcutaneous measurement are almost instantaneously available. The method has been already validated in different species and successfully applied in several models of renal pathology. Moreover, due to its minimally invasive characteristics, it is suitable for sequential measurements within the same animal. Here is provided a detailed protocol to carry out the transcutaneous assessment of renal function in rodents.

서문

사구체 여과율 (GFR)은 전체 신장 기능을 평가하는 가장 좋은 파라미터이다. GFR을 결정하는 황금 표준은 이눌린 ^1과 외인성 신장 마커의 소변 또는 혈장 클리어런스에 의존합니다. 그러나, 이러한 절차는 시간이 걸리고 복잡한 그 분석 일련의 혈액 및 / 또는 소변 샘플 후방 실험실 분석의 수집을 요구이다. 또한, 이러한 방법은 측정을 반복 할 수있는 시간과 주파수의 개수를 제한하는 동물에 대한 침습 스트레스이다. ^대안적인 접근 방법은 GFR을 결정하는 전형적인 절차 단순화하기 위해 개발되었지만, 아직 소변과 혈장 샘플 ^2-4에 의존 및 / 또는 신장의 혈류 역학 및 기능 ^{(7)에 영향을} 미치는 것으로 알려져 깊은 마취 ^5,6 필요 ^8. 이러한 크레아티닌 같은 대사의 최종 제품은 널리 신장 기능을 평가하는 데 사용된다. 그러나, accur 것으로 알려져이러한 내생 마커 ACY 더욱이 그들을 분석, 소변 또는 혈액 채취도 불가결 최적 아니고.

여기에서 우리는 의식이있는 동물에서 신장 기능을 평가하기 위해 경피적 방법을 설명합니다. 이 방법은 전통적인 방법뿐만 아니라 단지 최소 침습보다 간단하고 빠르다. 소형화 된 광학 기기와 외인성 신장 마커 형광 이소 티오 시아 네이트 (FITC) -sinistrin를 사용하여이 기술에 의해, 혈장 또는 소변 샘플링 및 약물 투여를위한 외과 용 도관없이 필요없이 거의 실시간으로 신장 기능을 결정할 수있다. 때문에 이러한 특성으로, 상기 방법은 동일한 동물에 연속 측정을 수행하기에 적합하다.

FITC-sinistrin가없는 관 재 흡수 또는 분비와 자유롭게 사구체에서 여과 신장 마커입니다. 소형화 된 장치의 광학 부품들은 두 개의 발광 다이오드 여기 (LED에) 구성투여 마커 및 포토 다이오드가 피부를 통해 방출 된 형광을 검출한다. 기록 된 데이터가 장치에 내장 된 내부 메모리에 저장되어 그들은 FITC-sinistrin 제거 역학 곡선을 생성하는데 사용될 수있다. 전력은 소형 리튬 이차 전지가 제공된다. 장치와의 개별 구성 요소에 대한 자세한 내용은 슈라이버 등. ^(9)를 참조하십시오. 이 장치는 쉽게 광학 부품 용 투명 창을지지하는 양면 접착 패치를 사용하여 동물의 몸체에 장착된다. 그 결과, 기록 기간이 끝난 후 즉시 가능하다.

방법 및 여기에 제공된 프로토콜로, 우리는 현재 골드 표준 연구뿐만 아니라 임상 분야에서뿐만 아니라, GFR을 결정하기 위해 대체 할 수있는 유망한 기술을 소개합니다.

프로토콜

프로토콜을 개발할 필요 실험 국내 규정에 따라 수행하고, 로컬 과학 윤리위원회 (칼 스루 Regierungspräsidium)에 의해 승인되었다.

FITC-sinistrin 주입 솔루션 1. 준비

1. 원액을 제조 생리 식염수 FITC-sinistrin을 녹인다. 래트에서 5 mg을 / 100g BW-FITC sinistrin 바람직 동안 마우스 권장량은 7.5 밀리그램 / 100g 체중 (BW)이다. 쥐를 40 mg / ml의 농도로 준비하는 동안 마우스의 경우, 15 ㎎ / ㎖로 FITC-sinistrin 스톡 용액의 용액을 제조 하였다.
   주 : FITC-sinistrin 스톡 용액을 미리 제조하고, 빛으로부터 보호 -20 ℃에서 저장 될 수있다.

2. 동물 준비

1. 모든 실험에서의 도입 전에 최소 1 주일 동안 동물을 순응.
2. 5 L / 분에서 ₂ O 5 % 이소 플루 란을 이용하여 동물을 마취 2 분 동안 흐른다.
3. 동물이 제대로 느린 깊은되고 그것의 호흡을 관찰하여 마취되어 있는지 확인하고, 발가락 응답의 부족으로 응답하지 않는 문제를 확인합니다.
4. 동물이 잠되면, 2 L / 분 O ₂ 배달 속도로 2.5 %의 이소 플루 란으로 마취를 줄이고 BW를 취할.
5. 전기 면도기를 사용하여 동물의 뒷면의 측면에서 모피를​​ 제거합니다. 3cm X 6cm의 치수를 갖는 양면 접착 패치에 의해 점유되는 영역보다 약간 큰 면적을 면도.
6. 그 후 남아있는 털을 제거하기 위해 짧은 기간 (2 ~ 3 분)에 대한 제모 크림을 적용합니다.
7. 크림이 완전히 제거 될 때까지 크림 자체가 형광 될 수 있으므로 철저하게 지역을 씻으십시오.
   참고 : 자극 / 부종을 생산할 수있는 동물의 피부를 긁는 피하십시오. 면도 한 영역이 피부에 색소 침착을 표시하는 경우에 대한 비 착색 자리까지 더 큰 면적을 면도장치의 광학 부분이 발견된다. 마취 노출을 최소화하기 위해 사전에 24 시간을 면도하는 것이 좋습니다.

3. 장치 준비

1. 보호 호일 대향 부를 떠나는 상기 투명 창 (도 1) 위의 광학 부품의 위치를 상기 양면 접착 패치의 한쪽면에 신장 기능을 측정하는 광학 장치를 배치했다.
   주 : 작은 설치류 작업 할 때,도 2에 도시 된 바와 같이, 패치의 크기를 감소시킨다.
2. 도 3에 도시 된 바와 같이, 전지에 일치하는 크기의 양면 접착 패치의 일부를 첨부.

동물의 장치 4. 고정

1. 동물의 체중에 기초하여 분사의 적절한 부피를 계산한다.
2. 이전 섹션 2.1-2.3에 나타낸 바와 같이 이소 플루 란 동물을 마취.
3. 관 모양의 탄성 거즈 붕대 오의 조각을 잘라F 양면 접착 패치의 폭보다 긴 약 1cm가 사용될 수있다.
4. 발견 면도 영역을 떠나, 그 뒷면에있는 동물과 장소의 머리 위에 탄성 거즈 붕대를 당깁니다.
   , 또는 단지 접착 테이프를 사용하여 장치를 해결하지만, 장치에 과도한 압력에주의해야합니다.
5. 장치에서 해당 포트에 전지 커넥터를 연결하여 장치에 배터리를 연결합니다. 그 후 패치의 단편으로부터 보호 호일을 제거하고, 장치 (도 4a)의 상부면 상에 배터리를 탑재. 배터리가 제대로 장치가 깜박이기 시작 있음을 확인하여 연결되어 있는지 확인합니다.
   주 : 래트에서, 배터리는 다음과 같은 장치 (도 4b)에 첩부에 직접 부착 될 수있다.
6. 작동 장치와 패치에서 보호 덮개를 분리하고 그것을 들고 동물의 뒷면에있는 면도 영역에 배치제대로 고정 될 때까지의 가장자리.
7. 패치의 접착면에 부착 된 관형 탄성 거즈 붕대 (도 5)와 장치 커버.
8. 제대로 사지를 자유롭게 이동할 수 있도록, 동물의 복부에 관 붕대를 스트레칭.
9. 더 고정되고 장치의 보호를 위해, 장치의 형태에 따라 상기 배터리의 전선 피복 접착 테이프의 스트립을 적용한다.
10. 장치에 압력을주지 않고 1 분, 3에 대한 배경을 측정

5. FITC-sinistrin 관리 및 측정 절차

1. 필요한 경우, 주입 또는 모든 절차를 따라 온도 조절 가열판 전에 따뜻한 물을 사용하여 동물의 꼬리 워밍업.
2. FITC-sinistrin 주식 솔루션의 적절한 볼륨 정맥 꼬리를 주입한다. 주입 부피는 동물 BW에 의존하며 따라서 각각의 단점에 대해 계산되어야1.1 절에서 언급 한 원하는 용량과 원액의 농도를, idering.
3. 모든 FITC-sinistrin 솔루션은 정맥이 아닌 피하 투여되어 있는지 확인합니다.
   참고 : 또는 FITC-sinistrin 설치류 또는 쥐 레트로 궤도를 통해 주입 목덜미에서 종료 사전 주입 정맥 카테터를 사용하여 투여 될 수있다.
4. 이 운동의 유물을 소개하는 것처럼 조심스럽게, 강한 움직임과 장치에 어떤 압력을 회피 홈 케이지에 동물을 반환합니다.
5. 동물이 방해되는 것을 방지하기 위해 조용한 장소에서 홈 케이지를 놓습니다.
6. 마우스와 2 시간 쥐를 사용하여 작업하는 경우 최소한 1 시간 동안 측정을 수행합니다. 이 기간 동안, 상기 광학 장치는 피부를 통해 FITC-sinistrin 의해 방출되는 형광을 측정한다.
   주 : 기록 기간 동안 동물 단독 호스팅되어야한다. 또한 급수뿐만 아니라, 돌출이러한 와이어 뚜껑과 같은 구조로 인해 개체에 미치는 영향에 전자 장치 및 이동 유물의 손상을 방지하기 위해 제거해야합니다.

6. 장치 제거

1. 기록 기간이 종료되면, 마취없이 장치를 제거; 필요한 경우, 2 분 동안 5 L / min의 O ₂ 전송 속도로 5 % 이소 플루 란 하에서 간단히 동물을 마취.
2. 조심스럽게 다음 관 붕대, 먼저 접착 테이프를 떼어.
3. 부드럽게 피부의 양면 접착 패치를 분리하고 정상적인 가정 케이지에 동물을 반환합니다.

데이터 중 7 읽기

1. 장치에서 배터리를 분리하고 접착 패치를 제거합니다.
   주 : 새로운 측정을 시작할 때까지 데이터는 장치에 저장된다. 배터리가 연결되어 있으면 상기 저장된 데이터는 새로운 기록으로 덮어 쓰기한다. 따라서에서 데이터를 다운로드하기 전에 배터리를 다시 연결하지 마십시오장치. 전지의 실수 재접속위한 10 초의 유예 기간이있다.
2. 마이크로 USB 케이블을 사용하여 PC에 장치를 연결하여 제공된 소프트웨어를 사용하여 데이터를 다운로드. 출력 파일은 개방 및 스프레드 시트 프로그램을 수정할 수 .csv 파일이다.
3. 광 소자를위한 특정 소프트웨어를 사용하여 데이터 파일을 열고 소프트웨어 프로토콜을 이용하여 제거 반응 속도 곡선을 생성한다.
4. 광학 장치와 함께 제공되는 지침에 따라 곡선을 분석합니다. 곧, 데이터의 평가를 위해, 각각 마우스 및 래트에서, 백그라운드 신호 전에 FITC-sinistrin 투여 측정 보통 15 분 및 볼 루스 주입 후 45 분에 발생 마커의 지수 배출 단계의 시작을 표​​시 설정 .
   주 : 소프트웨어가 자동으로 비교 예 1에 의해 결정된 ^R이 값과 함께 FITC-sinistrin 반감기 (t _1/2), 표시tment 모델입니다. t _1/2가 변환율 ^9,10하여 GFR을 계산하는데 이용 될 수있다.

결과

경피 측정의 설치가 매우 간단하고 신속하다 : 장치는 전지를 제조하고, 양면 접착 패치 (도 1)에 배치되고 (도 2) 필요에 따라 크기가 조정된다 (도 3)에 접속 (도 4).

신장 기능을 평가하는이 방법은 이미 플라즈마 통관 ^9,11,12의 전통적인 접근 방식과 비교하여 다른 종에서 검증되었습니다. 여기에 노출 된 프로토콜에 따라, Schreiber의 외. 모든 그룹에 대한 경피적 측정 혈장 클리어런스 간의 매우 유사한 결과를 나타내는 다른 마우스 모델에서 기술의 유효성을 증명은 (표 1) ⁽⁹⁾ 연구. 이 연구에서 얻어진 t _1/2 마우스 특정 반 경험적 변환을 사용하여 GFR로 전환되었다인자.

신장 기능의 경피 평가의 일관성은 또한 쥐의 다른 균주를 사용하여 입증되었다. 동일한 동물을 3 일 이내에 연속 측정은 3.0-6.2 % ^(13)의 변동 계수를 나타내었다. 본 연구에서는이 GFR에는 변환 없었다하지만 결과는 표현 t _1/2의 관점에서 직접 해석했다.

거의 실시간으로 결과를 가질 가능성이 방법의 가장 큰 장점 중 하나입니다. 기록 기간 후에, 결과는 분석을 위해 즉시 이용할 수 있으며, 제공된 소프트웨어를 FITC-sinistrin 배설 곡선 순간적으로 (도 6)을 표시한다. 직접 GFR 환산 변환의 신장 기능을 평가하는 변수로서 사용할 수 FITC-sinistrin의 _{1/2 t를} 얻을 수있다 같은 소프트웨어 내.도 7 은 신장 손상과 동물에 transcutaneously 측정 된 FITC-sinistrin 배설 곡선을 보이는 방법을 보여줍니다. 신장 기능은 물질의 배출을 감소 곡선 변화의 출현으로 인해, FITC-sinistrin t _1/2의 증가에 영향을 때. 일반적으로 측정 된 곡선은 다시 배경 수준으로 와서 곡선에 따라 증가 된 영역을 제공하지 않습니다. 동일한 동물 포스트 부상 사전에서 측정 인해 감소 배설 의한 마커의 축적의 최대 형광 강도의 증가를 경험할 수있다. 신부전의 존재에서, FITC-sinistrin의 transcutaneously 측정 곡선으로 인해 심각하게 손상 기능 (그림 7B)에 정상 상태를 표시 할 수 있습니다.

다른 건강 상태와 설치류의 몇몇 균주의 소형 장치의 사용은이 기술 D 적절한 변경을 검출하기에 충분히 민감하다는 것을 보여준다UE 신장 질환과 노화. 표 2는이 방법으로 현재까지 연구 된 쥐 모델을 요약하여 보여줍니다.

양면 접착 패치의 장치의 배치는도 1. 장치가 첩부 위치에 투명 윈도우에서의 광학 부품을 장착된다.

도 2 소형 설치류 첩부 적응이. 작은 동물에 사용하기 패치의 크기를 줄이는 것을 권장한다. A는 : 제대로 패치를 잘라 가이드로 장치를 사용하십시오. B는 : 원하는 크기가 획득되면, 디바이스는 패치의 접착 표면 상에 배치 될 수있다. P임대이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

배터리의 그림 3. 준비. 장치에 배터리를 연결하려면, 양면 접착 패치 (A와 B)의 작은 조각을 잘라 배터리 (C)의 표면에 놓습니다. 을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전.

측정하는 동안 상기 배터리의 연결 및도 4를 요구함. (A)로 인해 감소 된 공간 예컨대 쥐 작은 설치류에서, 배터리는 장치의 상부에 배치한다. 전지 C 큰 동물 (B)가 다음 장치에 배치 될 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

쥐의 관 모양의 탄성 거즈 붕대 그림 5. 배치. 관형 붕대는 동물의 편안함을 위해 사지의 자유로운 이동을 방해하지 않고 양면 접착 패치를 포함해야한다. 의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림.

FITC-sinistrin의 제거 곡선의 그림 6. 대표 이미지입니다. FITC-sinistrin에 의해 생성 된 신호는 transcu를 검출taneously 상기 디바이스의 내부 메모리에 저장된다. 기록 데이터가 PC에 다운로드 될 때, 소프트웨어 이미지에 나타난 것과 유사한 곡선을 생성한다. X 축은 시간 [분]의 측정 시간을 나타낸다 Y 축, 주입 된 FITC-sinistrin 마커에 의해 방출 된 기록 형광 강도 [AU]을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

신장애 동물 FITC-sinistrin의 소거 곡선도 7 대표 화상. (A) 감소 된 신장 기능을 가진 동물의 FITC-sinistrin 제거 곡선은 일반적으로 내부 기준에 도달하는 곡선 무능력하에 증가 된 영역을 나타낸다 정상 측정 기간 . transcutaneously 측정 곡선은 신부전을 나타내는 정상 상태를 표시 할 수 있습니다 심각하게 손상 동물에서 (B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

기존의 혈장 클리어런스와 비교하여 경피 측정 표 1. 검증. 신장 기능의 경피 측정은 다른 마우스 모델에서 검증되었습니다 (건강하고 일방적 (UNX) C57BL / 6-129 SV 마우스와 nephronophthisis의 마우스 모델을 (하거나 신장 혈장 클리어런스와 비교하여 PCY)). 값은 SD ± 수단이다. GFR, 사구체 여과율 ^(9).

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표 2. 쥐 모델은 경피적 측정을 이용하여 연구 UNX가 일방적으로하거나 신장.; ACE, 안지오텐신 전환 효소; T ^{gumodwt / 중량,} 형질 전환 uromodulin 녹아웃, SD, 스프 라그 돌리 쥐; PKD, 다낭성 신장 질환.

토론

본 논문은 소형 장치와 외생 신장 마커 FITC-sinistrin을 사용하여 의식 설치류에 신장 기능을 확인하는 절차를 설명합니다. 앞서 언급 한 바와 같이,이 방법은 소변과 혈장 클리어런스의 전통적인 방법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 그 중 하나는, 동물 응력 소모품 시간적으로 큰 절약에 이르게하고, 당연히 혈액과 소변 시료 채취로부터 독립이다.

표 2에 나타낸 바와 같이, 신장 외래 마커 FITC-sinistrin 피부를 통해 제거 동력학 측정은 신장 기능에 신장 병증의 ^영향을 연구 ^{9,10,14-18되도록.} 혈장 클리어런스 또는 신장 질환의 바이오 마커를 평가하기 위해 요구되는 혈액의 일련 컬렉션은 동물에 대한 스트레스 성 가시고 시간이 많이 소요 연구자위한 것이다. 따라서, 동일한 동물 내의 순차 측정 LIM왔다동물과 방법 론적 사유의 복지 높임으로써. 경피 측정 ^(13)의 입증 내 동물 재현성이 그것 때문에 질병의 진행이나 노화로 신장 기능의 변화를 검출하기위한 이상적인 방법을 만든다. 같은 이유로, 또한 치료 방법의 효과를 연구하기가 매우 유용 할 수있다.

이 기술의 성공적인 적용을위한 두 가지 중요한 단계는 동물의 광학 소자 및 상기 마커의 정확한 투여 고정된다. 이 장치는 적절하게 운동 유물을 방지하기 위해 고정해야합니다. 이 동물에의 접착 성 상실 결국 부적절한 고정 발생할 수있는 것을 목적으로, 양면 접착 패치의 착탈을 방지하는 것이 중요하다. 접착 테이프로 피복하여 프로토콜, 고정 광학 소자의 보호에 언급 된 바와 같이 adequat을 보장하는 효과적인 방법은전자 고정. FITC-sinistrin 일시 주사를 수행하는 경우는 정맥 내 피하 아닌 모든 물질을 관리하는 데 중요하다. 피하 조직에서의 마커의 릴리스를 용이하게 FITC-sinistrin 자체의 색상에 의해 생성 된 동물의 꼬리를 돌고 옐로우 링에 의해 식별 될 수있다. 피하 주사는 일반적으로 평평하고 연장 된 곡선 마커 배설 시간으로 나타난다. 이 방법의 수 제한은 기술 자체보다 사용 마커에 더 관련이있다. 부종은 동물의 피부에 존재하는 경우 FITC-sinistrin 배설 역학을 변경할 수있는 추가 함이 있으므로, 신장 기능의 경피 평가는 추천되지 않는다. 유사하게, 피부 색소 인해 FITC-sinistrin 멜라닌의 중첩 여기 및 발광 스펙트럼을 기술의 사용을 제한 할 수있다. 그러나, 패치의 피부 색소 침착과 동물, 문제는 광을 배치함으로써 해결착색 영역에서 장치의 일부.

상이한 동물 종 및 / 또는 방법의 절차를 적용하기 위해 신장 기능의 경피 평가의 다양한 측면을 변경하는 것이 가능하다. 예를 들어, 권장 FITC-sinistrin 투여 또는 측정 길이는 실험과 다른 종 또는 동물 모델의 목표에 따라 조절 될 수있다. 방법이 적응성은 이미 설치류 및 다양한 건강 상태와 균주의 여러 종류의 서로 다른 종에서 성공적인 응용 프로그램에 의해 확인되었다. 또한, 신장 기능의 경피 평가는 최근 개와 우수한 결과와 고양이 ^(12)에 검증되었습니다. 동물 및 설치류의 확실한 차이에 의해, 본 연구는 개, 고양이 모두 FITC-sinistrin의 적절한 투여 량을 측정하고,이 4 시간 대신 1 2시간 사용 훨씬 긴 측정 시간 수행설치류 라.

함께 찍은, 우리를 도울 수있는이 기술의 사용은 신장 질환 진행의 더 나은 이해와 치료의 효과를 포함하여, 신장에보다 정확한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 신기능의 경피 평가의 특징은 장래 인간 및 수의학 임상 분야에 적용될 수있는 적합한 기법으로 배치하고, 기존의 방법을 대체 할 유망 기술로서 고려되어야한다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
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FITC-sinistrin	Mannheim Pharma & Diagnostics GmbH		Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com
Double-sided adhesive patch	Mannheim Pharma & Diagnostics GmbH		Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com
Isis Rodent electric shaver	Braun Aesculap	GT420
Isoflurane	Abbott GmbH	PZN4831850
Leukosilk adhesive tape	BSN medical	102200
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Deltajonin Physiologic solution	AlleMan Pharma GmbH	3366954	Alternatively, it can be used saline or PBS