분화 및 세포 사멸 항상성을 통해 성인 유기체에있는 지방 세포의 숫자의 규제의 메커니즘

요약

Adipose tissue (AT) can influence whole body homeostasis, therefore understanding the molecular mechanisms of adipocyte differentiation and function is of importance. We provide a protocol for gaining new insights into these processes by analyzing adipocyte homeostasis, differentiation and hypoxia exposure as a model for induced adipocyte apoptosis.

초록

Considering that adipose tissue (AT) is an endocrine organ, it can influence whole body metabolism. Excessive energy storage leads to the dysregulation of adipocytes, which in turn induces abnormal secretion of adipokines, triggering metabolic syndromes such as obesity, dyslipidemia, hyperglycemia, hyperinsulinemia, insulin resistance and type 2 diabetes. Therefore, investigating the molecular mechanisms behind adipocyte dysregulation could help to develop novel therapeutic strategies. Our protocol describes methods for evaluating the molecular mechanism affected by hypoxic conditions of the AT, which correlates with adipocyte apoptosis in adult mice. This protocol describes how to analyze AT in vivo through gene expression profiling as well as histological analysis of adipocyte differentiation, proliferation and apoptosis during hypoxia exposure, ascertained through staining of hypoxic cells or HIF-1α protein. Furthermore, in vitro analysis of adipocyte differentiation and its responses to various stimuli completes the characterization of the molecular pathways behind possible adipocyte dysfunction leading to metabolic syndromes.

서문

세계 보건기구 (WHO)에서 2014 보고서에 따르면 세계 성인 인구의 39 %가 과체중이며, 13 %가 비만 ^한 것이다. 가까운 미래에, 사람들이 과체중 노인 인구의 상당 부분을 포함 할 것이다. 비만과 노화의 중요한 특징은 이환율과 ^사망률이 관련 지방의 조절 곤란하다. Adipokines는 지방 조직 (AT)에 의해 분비되는 단백질, 비만 등 대사 증후군을 유발하고 당뇨병 ^(3)를 입력 할 수 있습니다. 대사 질환은 대부분 확장 ⁴ AT의 결과 지방 세포의 지질 방울에 과도한 에너지 저장에 의해 발생합니다. 따라서,를 제어 할 기회를 찾기 위해 AT 원인과 확장의 분자 메커니즘을 결정 관심사이다.

위에 영양 두 가지 이벤트에 의해 조절된다 AT 확대로 이어진다 과도한 에너지 저장 지방 세포의 지질 소적으로, 공정또한 지방 세포 증식 ^5로 알려진 (지방 세포 크기 증가), 증가 된 지방 조직은 비대로 이어지는. 지방 조직은 지방 세포로 다 능성 중간 엽 줄기 세포 (MSC)의 분화 과정이다. 첫째, 중간 엽 줄기 세포는 확약 단계에서 전구 지방 세포로 발전. 둘째, 전구 지방 세포는 또한 성숙한 지방 세포 ^(6)의 기능적 특징을 취득 구별. 여러 전사 인자는 징크 핑거 단백질 423 (Zfp423) 초기 B 세포 인자 1 (Ebf1) 등의 지방 전구 세포 검지 마스터 레귤레이터로 확인되었다. Zfp423 초기 노력을 유도하는 반면, Ebf1은 지방 세포의 전구 세포 ^(6)의 생성이 필요합니다. 말단 분화 단단히 페 록시 좀 증식 제 - 활성화 수용체 γ (PPARγ)의 필수 전사 인자 ^칠해진다 전사 캐스케이드에 의해 제어된다. 또한 키 전사 요소 (C CCAAT / 증강 인자 결합 단백질이다/ EBP) 가족 (즉, C / EBPα, C / EBPβ 및 C / EBPδ), 크 룹펠 같은 요인 (KLFs), 캠프 응답 요소 바인딩 단백질 (CREB) 및 초기 성장 응답 20 (Krox20) ^6.

최근에는 활성제 단백질 1 (AP-1) 패밀리는 지방 세포 분화 과정에 관여 ^8,9 것이 밝혀졌다. 는 AP-1 패밀리는에 Fos 이세 및 / 또는 활성화하는 전사 인자 (ATF) 부재로 이루어진 이량 체 단백질 복합체에 의해 형성된다. FOS 관련 항원 1 및 2 (FRA-1 및 프라-2) 지방 세포의 분화를 조절할 수있다. 훌라-1 훌라-2 제어 지방 세포 회전율 ⁹ 반면, / EBPα ⁸ C를 억제함으로써 지방 세포 분화를 저해. 훌라-2는 이에뿐만 아니라 지방 세포 분화시 PPARγ2 식을 억압하여 지방 세포의 수를 감소뿐만 아니라, 저산소증 유도 인자 (HIFs) 식의 직접적인 억제를 통해 지방 세포의 세포 사멸을 감소시킨다. HIF 제품군은 HETE입니다HIF-1α, HIF-2α와 HIF-1β로 구성 rodimeric 전사 인자 복합체. 이종는 산소에 민감한 HIF-α 단백질 (HIF-1α 또는 HIF-2α)와 산소를 구분하지 HIF-1β 서브 유닛 ^(10)으로 구성되어 있습니다. normoxia 동안, HIF-α 단백질은 폴리 ubiquitinylated하고 마지막으로 프로 테아 좀 ^(11)에 의해 분해된다. 확장시 AT에서 발생하는 저산소 조건에서 HIF-α 단백질은 더 이상 수산화 없습니다. 그들은 따라서 구조적으로 표현 HIF-1β와 안정 및 양식 이합체된다. HIF 응답 소자를 제어하는 유전자의 전사 활성은 혈관 형성, 대사 및 염증 ^(12)의 조절에 관여한다. 실제로, HIF-1α는 글루코스 내성을 유도하는 에너지 비용 및 지질의 사용 억제 주변뿐만 아니라, 렙틴에 의해 레벨과 HFD 유도 간 지방증 ^(13)을 증가시킴으로써 부전 AT 촉진한다. 또한, HIF-1α는 adipocy을 조절테 세포 사멸의 생체 내 및 생체 외 ^9인치

본 프로토콜은 성인 쥐의 지방 세포 항상성의 분자 특성을 해명하는 상태에서 공부에 대한 방법을 설명합니다. 그것은 세포 사멸, 증식 및 생체 내 및 생체 외 지방 세포의 분화가 저산소증에 의해 조절 될 수있는 방법을 보여줍니다. 이를 위해, 우리는 Fabp4-CreERT 마우스 ^(9)와 훌라-2 floxed 대립 유전자를 운반하는 쥐를 교차에 의해 생성 된 훌라-2의 지방 세포 특정 삭제와 마우스를 사용합니다. Fabp4-Cre 호텔 ERT 마우스를 사용하여 결실은 지방 세포 타목시펜 주입 ^(14)에 의한 비와 유도된다. 성인 모델의 경우 타목시펜의 내부 복강 주사 6 주 세의 나이에 시작하는 연속 5 일 동안 수행된다. 분석이 완료되기 전에 따라서, 마우스 6 주 동안 정상식이 또는 고지방식이 요법을 실시한다. 본 연구에 사용 된 마우스는 남성 같은 에스트로겐과 같은 여성 호르몬을 피하기 위해 C57BL6 배경 근거한신체 지방 분포 ^(15)를 규제하는 도시. 다른 유전 적 배경을 사용하여 인해 지질 관리 ^(16)의 변형과 관련된 차이로 대사 표현형을 변경할 수 있습니다.

이 프로토콜은 조직학을 사용하여 저산소증에서 AT를 분석하는 방법과 면역 조직 화학 및 프로파일 링 분석 유전자를 사용하여 생체 내에서 지방 세포의 세포 사멸, 증식 및 분화를 정량화하는 방법을 보여줍니다. 이 연구는 저산소증에 노출에 의해 변경 주 지방 세포 분화 및 세포 사멸을 분석하는 방법을 보여주는 시험 관내 실험에 의해 완성된다.

프로토콜

윤리 선언문 : 동물은 독일의 동물 복지법의 지침에 따라 표준화 된 조건에서 보관되어 있습니다. 동물은 표준식이 요법과 물 광고 무제한을 공급하고 12 시간 주 / 야 사이클에 보관됩니다. 동물들과 함께 모든 실험은 지역 윤리위원회에 의해 승인된다.

성인 남성에서 지방 세포 항상성의 생체 분석 1.

1. (: 25 g을 마우스에 1.5 mg의 주사 예를 들어)을 60 밀리그램 / 인트라 복강 고체 pimonidazole 염산염 kg 체중 주입 먼저 마우스의 체중을 결정 생체 내 저산소증 정량화. Pimonidazole 단백질, 펩티드와 아미노산의 티올 그룹과 부가 물을 형성하고, 특정 항체에 의해 검출되는 유효 저산소 마커이다.
2. 쥐를 희생하고 perigonadal 지방 패드 (그림 1)를 제거합니다.
   1. 45 분 주사 후, CO ₂ 질식 이후 자궁 경부 탈구로 쥐를 희생.
   2. (도 1에 도시 된 바와 같이) 마우스의 사지를 핀 복강을 열고. 왼쪽과 복강 내 오른쪽 perigonadal (부고환) 지방 패드를 제거합니다.
      참고도 1에 나타낸 바와 같이 지방 패드가 복막 전단에 의한 부고환에 바인딩 (perigonadal 지방 패드는 화살표로 표시된다).
   3. 지방 패드에서 성선 조직을 제거하는주의하십시오. 지방 패드 중량 (g) 체중 (g) 당 : 비를 계산하기 위해 지방 패드 가중치를 결정한다.

그림 1 : 마우스의 복강에 perigonadal 지방 패드의 위치. 희생 후 성인 마우스에서 perigonadal 지방 현지화의 그림입니다. Perigonadal 지방 패드는 화살표로 표시됩니다. V 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전을 서평.

3. 정량적 유전자 발현 프로파일을 컴파일, RNA를 분리 한 perigonadal 지방 패드를 사용한다. 참고 : 조직이 처리 될 때까지 -80 ° C에서 액체 질소에서 RNA 안정화 솔루션에 저장 조직 샘플.
   1. 지방 패드를 균질화 구아니딘 이소 티오 시아 네이트와 페놀의 1 ㎖의 단일 - 상 용액을 지방 패드를 추가한다. (30 초 일시 중지와 함께, 2 회 20 초) 6,500 rpm으로 균질의 조직을 분쇄하기 위해 세라믹 구슬 (1.4 mm)를 포함하는 튜브를 사용합니다.
   2. (Chomczynski 및 사키 ^(17)에 의해 단일 단계 방법)는 다음과 같이 RNA를 분리.
      1. 실온에서 5 분 원심 분리기 5 분 12,000 XG에 부화, 15 초 동안 흔들어, 상을 분리 microcentrifuge 관에 균질화 지방 패드를 전송, 0.2 ml의 볼륨 클로로포름을 추가합니다. 새로운 microcentrifuge 관에 RNA를 포함하는 상 수상 (약 400 μl를), 전송합니다. 인클루드하지 마십시오 DNA를-포함보내고 계면 또는 단백질 함유 페놀 단계.
      2. (가 -20 ° C에서 밤새 배양하는 것도 가능하다) 혼합 4 ° C에서 15 분 동안 품어,의 RNA를 침전 이소프로판올 1 볼륨을 추가합니다. 10 분 동안 12,000 XG에 원심 분리기. 조심스럽게 이소프로판올 뜨는을 제거합니다. 10 분 동안 12,000 × g으로 원심 분리 단계의 75 % 에탄올로 두 번 세척 하였다.
      3. 실온에서 약 10 분 동안 침전 된 RNA를 건조시킨 후, 50 μL에 용해 H ₂ O (의 RNase가없는). 이를 용이하게하기 위해, 65 ℃에서 2 분간 배양한다.
         주 : -80 ° C에서 또는 장기간 저장을 위해 액체 질소에 75 % 에탄올에 RNA를 보관.
      4. (최적의 몫이 1.8 내지 2.2 사이이다)를 _{260/280으로} RNA 제제 정량화 및 ₂₆₀ 농도를 구한다
         
   3. DNA의 오염을 방지하기 위해, RNA 조제 1 μg의 다이제스트10 μL의 볼륨에서 37 ° C에서 30 분 동안 1 U의 DNase I와. 10 분 동안 65 ° C에서 비활성화.
      참고 :이 단계는 선택 사항입니다.
   4. 정량적 PCR 응용에 적합한 단일 가닥의 cDNA를 생성하는 역전사 반응을 1 μg의 RNA를 함유하는 RNA 제제의 10 μl를 사용한다. 구성 요소 및 그 금액은 표 1에 나열되어 있습니다.
   5. 정량적 실시간 PCR 반응에 대한 PCR 마스터 믹스를 사용합니다. 전체 지방 패드의 대사 변화를 확인하려면 AT 항상성 (표 2) 표 3에 나와있는 PCR 조건에 관련된 유전자 특정 프라이머를 사용합니다.
   6. 실시간 PCR 데이타 분석.
      1. 베이스 라인 (그림 2), 형광 신호의 변화가없는 한 15 일반적으로 사이클을 정의합니다. 실시간 PCR 소프트웨어 결과 기준선 형광 및 내부 기준 ROX 염료를 특정 형광 신호를 정규화프라이머에 의해 특정 된 신호의 크기 델타 Rn의 (ΔRn).
      2. 증폭 곡선의 기하 급수적 단계에서 임계 값을 설정합니다. 교차는 임계 값주기 (CT)를 정의합니다. CT 값에 기초하여 상기 기준 식 (ΔCT) 및 배 변화 (ΔΔCt)을 계산한다 :
         
         

구성 요소	볼륨 μL / 반응
10 배 RT 버퍼	2.0
25 배의 dNTP 믹스 (100 밀리미터)	0.8
10 배 RT 랜덤 프라이머	2.0
MultiScribe 역전사 효소	1.0
뉴 클레아 제 무 H 2 O	4.2
1 μg의RNA	(10)
총 당 반응	(20)

표 1 : 단일 가닥의 cDNA를 생성하는 역전사 반응을위한 각 볼륨 요소.

	공식 이름	상징	순서 3 '-> 5'
			앞으로	역
지방 생성	델타 같은 1 상 동체 (현-1)	Dlk1	GACACTCGAAGCTCA CCTGG	GGAAGGCTGGGACGG GAAAT
	초기의 B 세포 인자 1	Ebf1	CCACCATCGACTACGG CTTC	TCCTGGTTGTTGTGGGG CATC
	징크 핑거 단백질 423	Zfp423	GTGCCCAGGAAGAAGA CGTA	GGCGACGTGGATCTGA ATCT
	지방산 결합 단백질 4 (AP2)	Fabp4	TCACCTGGAAGACAGCT CCTC	AAGCCCACTCCCACTTC TTTC
	CCAAT / 인핸서 결합 단백질 (C / EBP), α-	Cebpa	AAGAGCCGCGACA AGGC	GTCAGCTCCAGCACCT TGTG
	CCAAT / 증강 인자 결합 단백질 (C / EBP) 베타	Cebpb	TTTCGGGACTTGATGC AATC	CCGCAGGAACATCTTT AAGG
	단백질 1을 결합 캠프 응답 요소	Creb1	ACTCAGCCGGGTACT ACCAT	TTGCTGCCTCCCTGTT CTTC
	CCAAT / 증강 인자 결합 단백질 (C / EBP), 델타	Cebpd	CAGCGCCTACATTGAC 유해 화학 물질 관리법	GTTGAAGAGGTCGGCG AAGA
	크 룹펠 같은 요인 4	Klf4	GCAGTCACAAGTCCCC TCTC	TAGTCACAAGTGTGGG TGGC
	초기 성장 응답이 (Krox20)	Egr2	AGGCGGTAGACAAAATC CCAG	GATACGGGAGATCCAG GGGT
	퍼 옥시 좀 증식 활성화 수용체 감마	PPARG	AGAGGTCCACAGAGCTG ATTC	GATGCACTGCCTATGAGC ACTT
지방 생성	아세틸 코엔자임 카르 복실 알파	Acaca	TGGGGACCTTGTCTTCA TCAT	ATGGGCGGAATGGTCTC TTTC
	지방산 합성 효소	FASN	ACATCCTAGGCATCC 어리석은	CCGAGTTGAGCTGGGT TAGG
	스테아 코엔자임 A는 (1) 불포화	Scd1	CGGGATTGAATGTTCTTG TCGT	TTCTTGCGATACACTCTG GTGC
지방 분해	파타 틴 같은 포스 도메인 containiNG (2)	Pnpla2	AAGGACCTGATGACCA CCCT	CCAACAAGCGGATGGT 가그
지방산 흡수	지단백 리파제	LPL	GTATCGGGCCCAGCAA CATTATCC	GCCTTGCTGGGGTTTTC TTCATTC
	CD36 항원	CD36	GTCTTCCCAATAAGCATGT CTCC	ATGGGCTGTGATCGGA ACTG
저산소증	저산소증 유도 성 인자 1 알파 서브 유닛	Hif1a	CCTGCACTGAATCAAGAG GTGC	CCATCAGAAGGACTTGCT GGCT
	(라고도 : HIF-2alpha) 내피 PAS 도메인 단백질 1	Epas1	CAAGCTGAAGCTAAAG CGGC	TTGGGTGAATTCATCG GGGG
	폰 Hippel-Lindau의 종양 억제	VHL	ACCGAGGTCATCTTTG GCTC	TTCCGCACACTTGGGT AGTC
	(라고도 : HIF-1β를) 아릴 탄화수소 수용체 핵 translocator	ARNT	TGGGTCATCTTCTCGC GGTT	TGTCCTATCTGAGCAT CGTG

표 2 : 지방 세포의 항상성을 분석에 사용 된 각 프라이머의 서열과 유전자의 목록.

단계			온도 (° C)	시간 (분 : 초)
중합 효소 활성화		보류	(95)	10시
PCR	40주기	Denaturize	(95)	0시 15분
		소둔 / 확장	(60)	1시
융해 곡선			60-95	0.5 ° C / 초

표 3 : 실시간 PCR 조건.

그림 2 :. 실시간 PCR 증폭 곡선의 특성 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 지방 세포의 항상성의 조직 학적 분석을 수행하려면 두 번째 perigonadal 지방 패드를 사용합니다. 조직을 건조하는하지 마십시오!
   1. 3.7 %에 파라핀에 포함 하룻밤 PBS 버퍼 포름 알데히드, 지방 패드를 고정 (다른 곳에서 ¹⁸ 설명 된대로 지침에 따라) 및 2-5 μm의 두께 섹션 (최대 5 μm의)에 포함 된 조직을 잘라.
   2. 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E) 염색 후 밝은 필드 현미경 필드와 지방 세포의 크기에 따라 지방 세포의 수를 결정합니다 <올>
   3. 자일 렌에서 5 분간 3 회 세척 100 % 에탄올에서 2 분 96 % 에탄올에 2 분 2 회 섹션 2 번 재수에 의해 Deparaffinize 섹션. 마지막 5 분 동안 증류수 H ₂ O에 섹션을 씻는다.
   4. 실온에서 10 분 동안 증류수로 H ₂ O 5, 5 분 동안 H ₂ O로 세척 : 헤 마톡 실린으로 염색 1 희석. 에오신 용액으로 30 초 동안 염색 (20 ㎖, 5 % 에오신 Y는 / 210 ml의 H ₂ O / 25 μL의 빙초산을 증류수)와 5 분 동안 H ₂ O로 다시 세척 하였다.
   5. 5 분 동안 2 분, 크실렌을 3 회 96 % 에탄올 및 100 % 에탄올을 2 회 반복하여 각 부분을 탈수. 무수 장착 에이전트 섹션을 탑재합니다.
   6. 밝은 필드 현미경 섹션을 평가합니다. ImageJ에 1.48v ¹⁹ 지방 세포를 분석하는 방법의 대표적인 예를 도시한다. 3 : 면적당 세포 (μm의 ^2)의 수를 셀 영역 (× ¹⁰³ μm의 ² ), 셀 크기 (μm의).
      1. ImageJ에의 1.48v와 섹션의 사진을 엽니 다. 영상의 파라미터가 아닌 길이의 부 화소에 표시하는 경우, 배율을 조정한다.
      2. 도구 모음에서 * 직선 *을 선택하고 규모 모음을 참조하여 알려진 거리에 선을 조정합니다. 분석으로 이동 -> 설정 스케일 라인의 거리를 픽셀 단위로 표시된다. 알려진 거리와 길이의 단위, 예를 들어, μm의를 추가합니다. OK를 눌러 확인합니다. 화상의 크기 및 매개 변수 분석을 소정 길이의 단위로 표시된다.
      3. 지방 세포의 매개 변수를 확인하려면 임계 값을 조정합니다. 이미지로 이동 -> 조정 -> 임계 값이 임계 값 창을 엽니 다. 다음 설정을 선택 임계 화 방법 : 기본, 임계 값 색상 : B & W를, 색 공간 : HSB를. 그림은 이제 흑백 나타낸다. 조정밝기는 흰색 지방 세포를 취소도 같이 검은 세포 간 공간을 닫습니다. 도 3b.
      4. 도구 모음의 * 멀티 포인트 * 선택과 μm의 ² (그림 3E) 당 지방 세포의 수를 계산하고 계산을위한 각 셀을 표시합니다.
      5. 지방 세포의 크기를 확인하려면 도구 모음에서 다시 * 직선 *를 선택하고 지방 세포 (도 3c)의 직경을 그립니다. 분석으로 이동 -> 측정 및 새 창이 나타납니다 μm의에서 지름의 길이.
      6. 지방 세포 영역을 확인하려면, * 지팡이 (추적) 도구 *를 선택하고 지방 세포 내부를 클릭합니다. 지방 세포의 내벽은 적색 (도 3d)으로 선택된다. 분석으로 이동 -> 측정 및 새 창이 나타납니다 μm의 ^2에서이 지방 세포의 면적.
5. immunohist에 대한다음과 같이 ochemistry, 항체 및 TDT-중재 dUTP를 비오틴 닉 엔드 라벨 ​​(TUNEL) 염색에 대한 섹션을 준비 :
   1. 자일 렌에서 5 분간 3 회 세척 100 % 에탄올에서 2 분 96 % 에탄올에 2 분 2 회 섹션 2 번 재수에 의해 Deparaffinize 섹션. 마지막으로, 증류수 H ₂ O에 섹션을 씻어
   2. 항원의 검색을 위해, 용액을 작동 테 K 37 ° C에서 30 분 동안 조직 절편 다이제스트 (10 mM 트리스 / 염산, pH를 7.4-8 20 ㎍ / ㎖), PBS로 씻어.
6. 젖은 챔버에서 항체 염색을 수행합니다 :
   1. 내인성 퍼 옥시 다제를 차단하기 위해,이어서 PBS에서 5 분간 2 회 세정하고, 10 분 동안 PBS에서 3 %의 과산화수소를 사용한다. 항체의 비특이적 결합을 차단하기 위해, PBS 중 10 %의 혈청을 사용한다. 이 경우, 염소에서 이차 항체의 호스트의 혈청을 사용한다.
   2. 염색의 경우, 세포 사멸, 증식과 저산소증 검출 용 항체를 (사용 표 4). PBS / 10 % 염소 혈청에서 항체를 희석. 밤새 4 ° C에서 품어. PBS에서 5 분 동안 섹션 3 회 반복한다.
   3. 신호가 표 5에 나열된, 저산소증의 검출을 위해. 희석과 더불어, 바이오틴 차 항체를 사용하는 이차 항체로 HRP 접합 된 토끼 항 FITC를 사용하여 강화합니다. 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션. 섹션 2 번 PBS로 5 분 씻으십시오.
      참고 :) FITC-MAb1와 저산소증 염색의 경우, 단계 1.4.4.4를 건너) 단계 1.4.4.5를 계속합니다.
   4. 각 슬라이드를 실온에서 30 분 동안 과산화 H 비오틴 50 μl를 50 μl의 아비딘 용액 (이 방법은 또한 아비딘 / 비오틴 ABC 복합 제제 함) 예비 부화 한 후 다른 45 분 동안 부분에 추가한다. PBS로 5 분간 2 회 반복한다.
   5. 염색 (5 분 10 사이) 더 강렬한 될 때까지 퍼 옥시 다제 기질 용액에 섹션을 품어. 증류수로 5 분 동안 세척H ₂ O
   6. 실온에서 10 분 동안 증류수로 H ₂ O 5, 5 분 동안 H ₂ O로 세척 :으로 대조, 헤 마톡 실린으로 염색 한 희석.
   7. 5 분 동안 2 분, 자일 렌 96 % 에탄올 및 100 % 에탄올에 3 회 2 회 각 섹션 탈수. 커버 슬립 무수 장착 에이전트 섹션을 밀봉합니다. 밝은 필드 현미경 섹션을 평가합니다.
7. TUNEL 분석에 의해 세포 사멸을 결정하고 제조업체의 지침을 따르십시오 :
   1. 450 μL 라벨 용액에 50 ㎕의 효소 솔루션을 추가합니다. 그런 다음 조직 학적 섹션에 50 μl의 TUNEL 반응 혼합물을 적용하고 어둠 속에서 가습 분위기에서 +37 ° C에서 60 분 동안 품어. 5 분 동안 PBS로 섹션을 3 회 세척하고 형광으로 대조를위한 DAPI (4 ', 6-diamidino-2-페닐 인돌)를 포함하는 매체를 장착 마운트.
   2. 100 배 MAGNIFICAT과 형광 현미경으로 평가 부 이온. 형광 측정 용 488 나노 미터의 여기 파장을 사용하여 515-565 nm의 (그린 레이저) 사이에서 검출; DAPI는 약 360 nm에서 흥분과 DNA (블루 레이저)에 결합 할 때 약 460 nm에서 방출한다.
   3. DAPI 및 형광의 오버레이를 정량화 :
      

도 3. 지방 패드 부에서 지방 세포의 특성을 분석하는 명 시야 현미경으로 고지방식이 (HFD) 또는 일반식이 (ND)으로 처리 수컷 생쥐 perigonadal 지방 패드의 단면 사진 (a); ImageJ에의 1.48v로 정량화, 영역 (D) 및 mm ² (E) 당 지방 세포의 세포 수, 임계 값은 검은 색과 (b)는 흰색과 지방 세포의 크기 (C 길이)로 조정된다.F = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig3large.jpg"대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

	주식 농도	노동 희석
세포 사멸	절단 된 카스파 제 -3 (Asp175) (5A1E) 토끼 단클론 항체	1 : 2,000
분아 증식	정제 된 마우스 반대로 인간의 기-67 클론 B56 (RUO)	1시 50분
저산소증	HIF-1 알파 항체	1 : 100
	FITC-MAb1	1 : 100

표 4 : AT 섹션의 면역 조직 염색에 사용되는 각각의 희석 된 항체.

항독소	노동 희석
비오틴 방지마우스 IgG (H + 1)	1 : 200
비오틴 항 마우스 IgG를 (H + 1)	1 : 200
HRP는 토끼 항 FITC 공액을	1 : 100

표 5 : 면역 조직 염색에 사용되는 희석과 이차 항체.

지방 세포 항상성의 생체 외 분석 2. 저산소증의 영향

1. 쥐를 희생하고 피하 지방 조직을 제거합니다.
   1. CO ₂ 질식 이후 경추 탈구로 쥐를 희생.
   2. 그림 4에 도시 된 바와 같이. 생쥐의 사지를 고정 상부 다리, 허리 및 측면에서 피부를 분리하고 그림 4와 같이 바늘을 아래로 핀. 다음의 기지에 후방있는 피하 지방 조직을 제거 도 4에 도시 된 바와 같이 (사타구니 림프절 주변 뒷다리, 좌 : 피하 지방 패드화살표로 나타내는 s는; 우 : 화살표 서혜부 림프절).

그림 4 : 피하 지방 패드의 위치. 피하 지방 패드의 사진; 왼쪽 화살표 피하 지방 패드를 표시하고 오른쪽 화살표가 서혜부 림프절을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 분리 된 지방 유래 줄기 세포 (ADSC)는 앞서 설명한 ^20.
3. 시드 ADSC 이글 개변 둘 베코 4,000 세포 / cm ² 중간 햄 F-12 10 % 정상 송아지 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 0.5 % 암포 테리 신 B, 16 μM 바이오틴 18 μM 판토텐산 100 μM 아스코르브 산 보충 및 약 70 ~ 80을 합류하는 문화를 성장문화의 4 ~ 6 일 후에 도달 %.
4. 지방 세포 분화를 유도한다.
   1. 치료 트립신 표면으로부터 부착 ADSC를 제거합니다.
      1. (세포 표면에서 분리 될 때까지), 매체를 제거 PBS로 씻어 0.025 % 트립신 솔루션을 추가 2 분 (37 ° C로 예열). 즉시 매체를 추가하고 세포를 씻는다.
   2. 노이 바 우어 챔버를 사용하여 세포를 카운트.
      1. 노이 바 우어 챔버의 중앙 영역에 유리 덮개를 넣는다. 세포 현탁액 1:10 희석 세포 현탁액 희석 10 μl를 함께 실을로드합니다. 코너에 위치한 4 개의 사각형, 16 작은 사각형으로 구성된 각 셀을 계산합니다. ml의 당 세포 수를 계산 :
         
   3. (4-6 일 후에 도달) 12- 웰 배양 플레이트 (2.2 점에서 설명)과 약 70 내지 80 %가 합류하는 배양 성장 시드 ADSC.
   4. adipoge을 유도5 μg의 / ㎖ 인슐린, 1 μM 덱사메타손 및 배양 5 μM 3- 이소 부틸 -1- 메틸 크 (IBMX)을​​ 첨가하여 분화 NIC. 2 일마다 배지를 갱신. 세포는 완전히 7 일 후 차별화됩니다.
5. 지방 세포 분화, 성숙 지방 세포의 중성 지방을 얼룩 오일 레드 O와 얼룩을 분석합니다.
   참고 : 작업은 흄 후드에서 수행해야합니다!
   1. , 매체를 제거 PBS로 부드럽게 지방 세포를 씻어 2 ml의 10 % 포르말린 60 분 동안 세포를 고정합니다.
   2. 오일 레드 O 염색 용액을 조제 증류수 2 부와 적색 오일 O 스톡 용액 (100 ㎖ 99 %의 이소프로판올에 용해 된 300 mg의 적색 오일 O 분말) H ₂ O 3 부를 혼합하고, 실온에서 10 분 동안 배양. 0.2 μm의 주입 필터를 통해 오일 레드 O 작업 솔루션을 필터링합니다.
      참고 : 작업 용액을 2 시간 동안 안정하다.
   3. 석유 레드 O 염색 들어, 포르말린을 제거 H ₂ 지방 세포를 씻어 O, 5 분 동안 2 ml의 60 % 이소프로판올로 부화 이소프로판올을 제거하고 5 분 동안 2 ml의 오일 레드 O 작업 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 물이 깨끗해질 때까지 수돗물 세포를 씻어. ) 포인트 1.4.4.5에서와 같이 헤 마톡 실린과 Counterstain과.
   4. 100 배 배율의 위상차 현미경 판을 평가한다. 지방 세포의 지질이 빨간색으로 표시되고 핵은 파란색 표시됩니다.
6. 선택 단계 : shRNA를 가진 형질 전환에 의해 관심의 유전자를 침묵입니다.
   1. 매체를 변경하고 무 혈청 배지를 추가합니다.
   2. 지방 세포의 형질를 들어, 리포 펙을 사용합니다. 제조업체의 지침에 따라 12 웰 조직 접시 당 1 μg의 shRNA를 사용합니다. 지질-DNA 복합체의 첨가 후, 37 ° C에서 48 시간 동안 지방 세포를 배양한다.
7. 저산소증 실시 지방 세포를 분석하는, 저산소 조건 하에서 세포를 유지하는 저산소 워크 스테이션 또는 저산소 배양기를 사용한다. 연구의 따라, 저산소증의 C0.5, 1 또는 2 %의 산소 수 울드.
   1. FITC 표지 넥신 V 및 세포 계측법 분석 이후의 흐름에 의해 세포 사멸을 분석합니다.
      1. , 여분의 소프트 셀 스크레이퍼로 지방 세포를 수집 PBS로 세척하고 100 μL의 넥신 V 결합 버퍼에 1 × 10 ⁶ 세포를 추가 (10 mM의 헤 페스 / 수산화 나트륨, pH 7.4의 140 mM의 NaCl을 2.5 mM의 염화칼슘 _2). 제조자가 권장 넥신 V-FITC의 양을 첨가하고 실온에서 15 분 동안 배양한다.
      2. 측정 유동 세포 계측법를 들어, 아 넥신 V 결합 버퍼 μL (200)를 추가하고 핵 Counterstain과의 1 μM. 녹색과 보라색 채널에서 형광을 결정합니다. 아 넥신 V ⁺ / 핵 Counterstain과 ⁺ 세포는 보조 괴사 및 아 넥신 V ⁺ / 핵 Counterstain과 같이 정의된다 ^- 세포 사멸 세포로 정의된다 (그림 5).
   2. 정량적 저산소 조건에서 항상성을 결정하는 지방 세포 RN​​A의 수준을 분석한다.
      1. 더하다1 ml의 단상 아니라 각 구아니딘 이소 티오 시아 네이트와 페놀의 솔루션 및 1.3.5.2에) Chomczynski와 사키 ^(17)에 의해 단일 단계 방법 (단계 1.3.2)를 사용하여 상기 RNA를 분리하고 단계 1.3.2.1에서와 같이 진행) .

그림 5 : 유동 세포 계측법에 의해 지방 세포 사멸 분석. V-FITC와 지방 세포의 TO-PRO-3 염색 넥신.에 대한 FACS의 도트 플롯 프리젠 테이션 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

결과

우리의 예를 사용하여 생체 내 및 생체 외 지방 세포의 항상성을 결정하는 방법을 보여 훌라을-2 ^{FL / FL} 야생형 한배 새끼에 비해 Fabp4-CreERT 마우스. 우리의 프로토콜은 증가 된 지방 세포의 세포 사멸에 의해 지시 된 바와 같이 저산소증에 의해 증가 HIF의 발현이 지방 세포의 기능 장애와 관련되는 방법을 정의합니다.

고지방 다이어트에 증가 된 지방 세포의 크기와 영역 (HFD) 처리 된 마우스

과잉 영양, 다른 요인들, 지질 방울에 과도한 에너지 저장에 의한 지방 세포의 비대, 발생합니다. 지방 세포의 크기와 영역은 비대의 지표이다. 정상에서 지방 패드의 섹션 (ND;도 6a)와 높은 지방 다이어트 (HFD도 6B) 육주 후 지방 세포의 크기와 지역의 마우스뿐만 아니라 정량화 명확하게 표시 지방 세포의 비대HFD 처리 된 마우스 (도 6c 및 d) 증가 지방 세포의 크기에 의해 표시된다 HFD의 S.

성인의 지방 조직 (AT)에서 증가 저산소증 프라 -2- ^{FL / FL-Fabp4} CreERT 마우스 증가 HIF-1α의 레벨 및 지방 세포 자멸사에 이르게

AT에서 저산소증의 생체 상태를 확인하려면 훌라-2 ^{FL / FL} Fabp4-CreERT 마우스 12 주 세의 나이에 훌라-2 삭제 후 육주 분석 야생형 한배 새끼와 비교된다. Pimonidazole 복강 효과적인 저산소증 마커와 마우스에 투여; 그 독성 및 AT에 분배 할 수있다. 생체 내에서 AT에서 저산소 지방 세포는 면역 항체 염색 (도 7a)에 의해 정의된다. 또한, 쥐에서의 증가 된 AT 저산소 상태가 증가 HIF-1α 긍정적 ADIP 수반HIF-1α 발현 및 대상 유전자 ^(9)의 정량화에 의해 확인 된 면역 염색도 7b)로 나타낸 바와 같이 ocytes. 또한, 훌라-2에서 AT 섹션의 TUNEL 염색 ^{FL / FL} Fabp4-CreERT 마우스 및 제어 한배 새끼 (그림 7C) 지방 세포의 세포 사멸이 저산소증과 HIF-1α 식의 존재와 상관 관계가 증가 보여줍니다.

저산소증에 의한 지방 세포의 세포 사멸을 통해 차 지방 세포에서 HIF-1α 발현을 증가

다른 ²⁰ 바와 같이 시험 관내 지방 세포 사멸을 분석하기 위해 피하 지방 패드에서 생성 된 지방 세포를 사용한다. 예상대로, 지방 세포에서 HIF-1α 발현은 저산소증 (그림 8a)의 24 시간 후에 증가한다. 상기 HIF-1α 활동 HIF 표적 RNA의 수준을 분석이러한 iNOS의 (유도 성 산화 질소 합성 효소)와 같은 유전자 qPCR에 의해 정량화된다.도 8b는 저산소 상태에서 HIF-1α의 발현 증가는 iNOS의 mRNA 발현 증가에 이르게 것을 보여줍니다. 우리가 이미 지방 세포에서 HIF-1α 발현을 증가 지방 세포의 세포 사멸과 관련이 증가 생체 내 (그림 8)에 도시 한 이후, 세포 사멸은 저산소 조건에서 넥신 V 염색으로 체외 문화에서 계량입니다. 생체 데이터 (도 7)과 일치하는, 증가 된 HIF-1α의 레벨은 저산소 조건에 의해 유도되는 증가 된 지방 세포가 아폽토시스 (도 8b)를 수반한다. 또한, 그 저산소에 의한 세포 사멸을 증명하는 HIF-의존; HIF-1α 또는 HIF-2α는 야생형 또는 훌라-2 결핍 생쥐에서 파생 된 지방 세포에 RNA 간섭에 의해 침묵된다. 넥신 같이 증가 된 지방 세포 사멸은 HIF-1α 또는 HIF-2α 입을 의해 복원 저산소증 센서 HIF-α는 지방 세포 사멸을 조절하는 것을 증명도 8b에 V 염색.

그림 6 : 높은 지방 다이어트 (HFD) 쥐의 지방 세포의 크기와 면적 증가 정상적인 다이어트 (ND)가 공급 남성 야생형 마우스의 perigonadal 지방 패드에서 섹션 (A, B) H & E 염색 (a) 또는 높은. 지방질 다이어트 (HFD) (b)에 육주합니다. 바는 500 μm의를 나타냅니다. (c, d) (b) 6- 주 ND (a) 또는 HFD가 공급 야생형 마우스의 perigonadal 지방 패드에서 지방 세포의 크기 (C) 및 영역 (D)의 정량화. N = 10 데이터는 SEM ±로 평균 값을 나타낸다. 통계 분석은 Student's의 t -test를 사용하여 수행 하였다. *** p <0.0001.: //www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig6large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

훌라-2 ^{FL / FL} Fabp4-CreERT 마우스 성인의 지방 세포에서 증가 HIF-1α 수준 및 세포 사멸 그림 7. 저산소증 (a)와 HIF-1α 남성 훌라-2 ^{FL / FL} Fabp4-creERT 마우스 남성 제어 한배 새끼 육주 후 타목시펜 주입의 AT (b)에서 염색. 배율 20 배는 40X를 삽입합니다. 검은 색 화살표는 저산소 영역과 HIF-1α 양성 세포를 나타냅니다. (c)에서 TUNEL 염색 훌라-2 ^{FL / FL} 타목시펜 주입 후 6 주에 Fabp4-CreERT 마우스 및 제어 한배 새끼. 배율 20 배는 40X를 삽입합니다. 검은 색 화살표는 TUNEL 양성 세포를 나타냅니다. 이 수치는 루터 등에서 수정되었습니다알. ^9. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 8. 저산소증에 의한 차 지방 세포에서 증가 HIF-1α 발현 및 지방 세포 자멸사 저산소 챔버에 넣고 차 지방 세포에서 HIF-1α와 HIFs 대상 iNOS의 mRNA 수준의 (a) 실시간 PCR 분석은 지정된 시점에서 분석 하였다. 분리 주 지방 세포에서 넥신 V FACS 염색에 의한 세포 사멸의 (b)에 정량 훌라-2 ^{FL / 플라이} 쉬 제어 또는 HIF-1α 또는 HIF-2α에 대한 쉬 플라스미드로 형질과 저산소증 아래에 배치 Fabp4-CreERT 마우스 또는 야생 형 제어 24 시간 동안 (1 % O _2). 이 수치는 루터 등의 알에서 수정되었습니다. ^{9. 데이터는 SD 통계 분석은 학생의 T- 테스트를 사용하여 수행 하였다 ±로 평균 값을 나타낸다. * P <0.05 ** P <0.01 상당한으로 인정 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.}

토론

지방 세포 인해 과도한 에너지 저장에 의한 지방 세포 증식 및 비대를 공개, 크기, 숫자 및 지역에 따라 표현형 특징을 통해 영양 ^(5). 지방산 조절 곤란 및 후속 대사 증후군 선도 이러한 이벤트는 또한, "정상"지방 확장이라 보존 대사, 증가 체지방량의 상태이다. 예를 들어, Kusminski 등. ^(21)는 대규모 지방 확대와 마우스는 그 지방의 확장이 필요 대사 증후군에 연결하고 지방 세포의 특성을 평가하기 위해 신중하게 판단 할 필요가되지 제안, 대사 건강을 유지 것으로 나타났다. 지방 조직 (AT)는 신체 대사 조절에 중추적 인 역할을한다. AT는 이상 지질 혈증, 동맥 경화증, 고 인슐린 혈증과 고혈당 ^{3에 영향을} 미칠 수있는 가장 큰 내분비 기관이다. 항상성 및 분자 m AT 평가를 조절 echanisms 대사 시스템 장애에 대한 이해를 허용 할 수 있습니다. 그러므로, 지방 세포 분화 조절 기전을 해명, 지방 세포의 크기와 지방 패드 질량은 비만 질환의 새로운 치료를 개발하는 데 도움이된다. 생체 내 및 시험 관내 방법에 사용하면, 지방 세포의 분화와 활성에 식품 및 유전자 발현에 미치는 영향의 역할을 결정할 수있다. 우리 프로토콜은 포도당 및 인슐린 대사 반응 ^22-24을 분석만큼 중요 의해 제안 지방 세포 분화, 증식 및 세포 자멸사의 밸런스를 결정하고, 상기 항상성을 결정한다.

발현 프로파일 차 지방 세포의 지방 생성, 지방 생성, 지방 분해, 지방산 흡수, 저산소증, 사멸 및 증식에 관여하는 유전자 분석 및 내장 AT는 지방 세포의 항상성과 가능한 장애에 대한 개관을 획득하기위한 높은 처리 방법이다.흥미 후보는 또한 웨스턴 블롯 또는 면역 조직 염색에 의한 단백질 수준에서 분석해야한다. 비대칭 시아닌 계 색소를 사용하여 실시간 PCR 시스템으로 최적의 결과를 얻기 위해 1 내지 10 ng의 범위의 cDNA의 농도는 50 내지 900 nm의 범위의 최적 프라이머 농도 비특이적 증폭을 최소화하기 위해 테스트되어야한다. 중요한 성분은 프라이머이다; 각 실행에 대해, 용융 곡선은 엄격 특이성을 확인하기 위해 프라이머 이량 체의 형성을 배제하도록 제어 될 필요가있다. 따라서, 대신의 cDNA의 H ₂ O와 부정적인 컨트롤을 사용하는 것이 좋습니다. 또한, 상용 가능한 비대칭 시아닌 염료 (예 ROX 같이) 수동적 기준 염료를 함유하는 내부 기준 신호를 제공하도록 마스터 믹스로 제공된다. cDNA를 신호는 잘 - 투 - 잘 신호 변동을 해결하기 위해 ROX 신호를 데이터 분석 중에 정규화. 다른 점은 끈적 거리는을 설정하기 위해 고려되어야D qPCR의 시스템은 하우스 키핑 유전자의 선택입니다. 각 조건의 경우, 여러 하우스 키핑 유전자는, 사용 예를 들어, HPRT, β - 굴지, GAPDH, β-2-MG 또는 HSP90.

저산소 조건에 의해 안정화 HIF 단백질 마스터뿐만 아니라 지방 세포 생존을 결정 레귤레이터뿐만 아니라, 글루코스, 인슐린 내성 및 지질 대사 ^11,25,26 같은 대사 변화이다. 지방 패드에서 저산소 영역을 확인하기 위해, HIF-1α는 면역 조직 화학 염색에 의한 부분 AT에서 결정된다. HIF 단백질을 빠르게 정상 산소의 조건 하에서 5 내지 10 분 이내에 분해되기 때문에, 절차 및 조직 학적 분석을 위해 지방 패드의 단단히 고정 대기 시간을 방지하기 위해 제어되어야한다. 따라서,뿐만 아니라 HIF 염색 통해 저산소증을 보장하기 pimonidazole AT는 저산소 영역을 결정하는데 사용된다. 이미 뼈 ^(27)에 도시 된 바와 같이 Pimonidazole는 조직에 배포 할 수 있습니다효과적으로 더 특이 항체 ^(28)를 결합하여 조직 학적 섹션에서 검출 특히 저산소 세포 티올 - 함유 단백질에 결합함으로써 저산소 영역을 표시한다. 그러나, 다른 마커 및 방법은 저산소증 경로를 분석하는데 사용될 수있다. 예를 들면, 수산화 프롤린을 인식 프로 테아 HIF을 중재 폴리 - 유비퀴틴 유도 normoxia 아래 프롤린 잔기의 히드 록 실화를 유도 프 롤릴 수산화 효소 (PHD) 효소뿐만 아니라 폰 Hippel-Lindau의 (VHL) 단백질의 참여 저하는 통로 ^{29, 30의} 전체 개요를 분석 할 필요가있다. 또한, 유비쿼터스 HIFs의 검출은도 ^{31, 32을} 변경할 수있는 단백질 분해 안정성을 결정한다.

또한, TUNEL 염색에 의한 사료된다하여 증식과 세포 자멸사는 AT 조직 학적 섹션의 염색을 통해 생체 내에서 결정된다. 사료된다 및에 의해 확산의 정량화유동 세포 계측법 분석을 통해 TUNEL 또는 아 넥신 V 염색에 의해 poptosis도 ^33을 수행한다. 증식 물론 이러한 사료된다 양성 세포 측정에 의해 해결되지 않는 지방 세포의 세포주기의 분석과 같은 다른 기법에 의해 측정 될 수있다. FACS는 아폽토시스 세포 사멸 과정 대 괴사의 수준을 결정 넥신 V 및 TOP-PR-3 분석하여 또한 TUNEL 의한 세포 사멸 연구는 완성 될 수있다. 아폽토시스 AT 항상성에 중요한 세포 사멸의 과정을위한 기본적인 과정이다. 사실, 지방 세포의 세포 사멸의 조절 곤란 비만에 기여하는 과정에서 이전에 연루 및 ³⁴ 지방 이상증되었습니다. 또한, 2011 년, Keuper 등의 알. 지방 세포의 세포 사멸에 지방 조직의 염증을 연결. 그들은 식세포 차례로 식세포를 유치 전구 지방 세포와 지방 세포에서 세포 사멸을 유도하는 것으로 나타났다. 대 식세포의 모집은 염증, 어느 제어 방식을 가속포도당과 인슐린 내성 ³⁵ 대사 증후군에 ibutes. 그러나, 지방 세포 사멸이 제대로 공부 현상에 의한 지방 세포의 세포 사멸 체중 감소로 이어질 수 있다는 가설에도 불구하고, 아직도있다.

본 프로토콜은 생체 내에서 증식, 세포 사멸 및 저산소증으로 다른 현상을 연구하기 위해 면역 조직 화학적 방법을 사용합니다. 따라서, 조직은 중요한 단계 4 % 포름 알데히드로 고정 하였다. 확장 된 조직 정착 시간은 상기 항체에 대한 비 액세스 될 에피토프, 변화하도록 이끈다. 반대로, 짧은 정착 시간은 시약 에피토프의 감도를 증가시킨다. 고정의 권장 최적의 시간은 24 시간입니다. 또한, 상기 부분의 두께는 그 에피토프에 결합하는 항체에 영향을 미친다; 최적의 두께는 μm의 2 내지 5이다. 5 μm의보다 두꺼운 부분은 증가 된 결합 부위에 거짓 긍정적 인 결과를 줄 것이다. 대조적으로, s의ections보다 얇은 2 μm의 적은 결합 부위를 포함하고 긍정적 인 부분은 잘 정의되지 않습니다. 또한, 중요한 요소는 에피토프에 결합하는 특정의 품질에 영향을주는 항체 자체, 배양 시간, 농도, 심지어 온도이다. 따라서, 항체 농도와 배양 시간을 확인하는 각 조건에 대한 필요가있다.

연구를 완료하려면, 우리는 다른 치료, 자극 또는 공동 문화에 의해 확장 될 수있는 시험 관내 지방 세포 분화 프로토콜을 제공합니다. 시험 관내 지방 세포 배양에 사용함으로써, 지방 세포 분화 및 기능에 결함을 판별 가능하다. 모든 기본 세포와 같이 ADSCs 및 지방 세포의 건강 행동과 외관이 매우 중요하다, 신뢰할 수있는 결과를 얻을 수있다. 입도, 세포질 vacuolations 및 / 또는 박리 차의 부적절한 매체, 미생물 오염이나 노화를 나타내는 악화의 징후이다세포. 다른 프로토콜 ^(36)에 의해 기술 된 바와 같이, 골수로부터 단리 된 중간 엽 줄기 세포를 사용하는 것도 가능하다 반면,이 프로토콜은 지방 패드 조직으로부터 격리 된 지방 세포를 사용한다. 최근이 지방 세포 분화의 초기 단계에서 발생하는 추가 차별 문제를 반영 할 수있는 기질 전구 세포를 포함, 이것은 현재의 프로토콜에서 누락 될 수 있습니다. 또한 ADSCs 빠르게 (일주일 이내에 10 배 이상) 확장 될 수 있으며, 일부 유로 후의 장기 배양 ADSCs은 여전히 중간 엽 ^{37,38 능성을} 유지한다. ADSCs을 사용하는 다른 이점은 ADSCs 간단하고 최소 침습 방법으로 지방 흡입에 의해 환자로부터 채취 할 수 있기 때문에 용이 한 인간으로 전환 할 수 있다는 것이다.

AT는 내분비 방식으로 여러 다른 장기에 영향을 미친다 같이, 프로토콜 adipokines로 확장되어야한다. 이러한 렙틴, 아디포넥틴, 종양 괴사 인자 α (TNF)를 같은 Adipokines,지방 세포에 의해 분비 된 인슐린 저항성 ND는 지방 대사, 에너지 항상성 및 인슐린 감수성 ^(39)를 제어함으로써 대사성 질환에 영향을 미치는 것으로 알려져있다. 따라서, 혈청 및 지방 세포의 secretome 분석이 수행되어야한다. 이러한 IL-6와 같은 AT 장애, adipokines 및 염증성 사이토 카인의 경우에, 예컨대 췌장, 간, 근육 기능 ^4로 장기의 조절 이상을 초래할 수있다. 전신 장기 부전을 배제하기 위하여, 동물 모델 또는 세포 배양 물은 자극 포도당 흡수를 그들의 응답을 테스트 할 수있다.

여기에서 우리는 AT 및 생체 내에서 지방 세포의 기본 상태를 분석하기위한 프로토콜을 제공하고 체외에서 지방 세포의 항상성 및 기능의 분자 메커니즘을 공개.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNAlater solution	Ambion	AM7021	RNA stabilization solution
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4368813
SYBR Select Master Mix	4472908
Purified Mouse Anti-Human Ki-67	BD Biosciences	550609	Clone B56 (RUO)
Purified Mouse Anti-Human Ki-67 Clone B56 (RUO)	550609	Proliferation marker
FITC Annexin V	BioLegend	640906
Cleaved Caspase-3 Rabbit mAb	Cell signalling	9664S	Clone 5A1E
Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb	9664	Apoptosis marker
Lipofectamine2000 Reagent	Invitrogen	11668-027
TO-PRO-3 Iodide	T3605	Nuclear counterstain, Monomeric cyanine nucleic acid stain, Excitation⁄Emission: 642⁄661 nm
Mayer’s hemalum	Merck	109249	hematoxylin
pegGOLD TriFast	Peqlab	30-2030	TRIzol, single-phase solution of guanidine isothiocyanate and phenol
Percellys Ceramic Kit 1.4 mm	91-PCS-CK14	tubes containing ceramic beads (1.4 mm)
Precellys 24	91-PCS24	homogenizer
HIF-1 alpha Antibody	Pierce	PA1-16601
HIF-1 alpha Antibody, 16H4L13	700505	Hypoxia marker
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein	Roche	11 684 795 001	TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL)
Eosin	Sigma	318906
DNase I Solution (1 unit/µl)	Thermo Scientific	EN0525
biotinylated anti mouse IgG (H+L)	Vector Laboratories	BA-9200
biotinylated anti mouse IgG (H+L)	BA-1000
Vectastain ABC Kit	PK-4000
VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI	H-1200