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요약

세포 내 기록의 전기 생리 기술 시연과 나비의 화합물 눈에 하나의 광 수용체 세포의 스펙트럼 감도를 결정하는 데 사용됩니다.

초록

세포 내 기록 단일 셀은 주어진 자극에 응답 할 수 있는지 결정하는데 사용될 수있는 강력한 기술이다. 비전 연구에서는 세포 내 기록은 역사적으로 오늘날 사용되는 다른 빛의 자극에 각각의 광 수용체 세포의 민감도를 연구하는 데 사용되는 일반적인 기술하고있다. 그러나, 눈에 세포 내 기록 실험을 복제하고자하는 연구자의 문헌에서 상세한 방법론의 부족이 남아있다. 여기에 우리가 더 일반적으로 눈의 생리를 조사하기위한 모델로 곤충을 제시한다. 곤충 시각 세포는 눈의 표면 근처에 위치하기 때문에 달성하기 용이 한 시각에 관련기구의 대부분은 동물 phyla의 걸쳐 보존되어있다. 우리는 전자에 약간의 사전 경험이있는 연구자들에게이 기술을 더 접근 할 수 있도록 목표로, 나비의 눈에서 광 수용체 세포의 생체 내 세포 내 녹음을위한 기본 절차를 설명lectrophysiology. 우리는 단일 셀에 유리 미세하고, 마지막으로 기록 절차 자체를 삽입하는 방법, 녹화 라이브 나비을 제조하는 방법에 필요한 기본 장비를 소개한다. 또한 각각의 세포 종류의 분광 감도를 판정하기위한 원료 응답 데이터의 기본 분석을 설명한다. 우리 프로토콜 분광 감도를 결정하는 단계에 중점을두고 있지만, 다른 자극 (예를 들면, 편광) 및 상기 방법의 변형이 설정에 적용될 수있다.

서문

이러한 신경 세포 등의 전기적 특성은 전압 또는 전류의 변화로 세포막을 가로 지르는 이온의 흐름을 측정함으로써 관찰된다. 전기 생리 다양한 기술 세포 생체 이벤트를 측정하기 위해 개발되었다. 동물의 눈에있는 뉴런 액세스 할 수 있습니다 및 회로는 전기 생리 연구를 위해이 세포 좋은 후보를 만들고, 뇌보다 자주 덜 복잡하다. 눈에서 전기 생리학의 일반적인 응용 프로그램은 전위도 (ERG) 1, 2, 미세 세포 내 기록을 포함한다. ERG는 또는 동물의 눈에 전극을 배치하는 광 자극을인가하고, 모든 주변 셀 3-6의 응답의 합과 같은 전압에서의 변화를 측정하는 것을 포함한다. 하나의 개별 시각 세포의 분광 감도 특성에 특별히 관심이 있다면, 종종 여러 종류의 세포를 동시에 주어진 자극에 다른 힘에 반응; 따라서를눈의 스펙트럼과 유사한 시각 세포의 여러 가지 종류가 특히 ERG 데이터에서 특정 세포 유형의 감도를 결정하기 어려울 수있다. 하나의 잠재적 인 해결책은 눈 R1-6 대부분 세포에서 발현 관심 감광체 (옵신) 유전자로 형질 전환 된 초파리 만들고 ERG의 7 수행하는 것이다. 이러한 방법의 잠재적 인 단점은 감광체 단백질 (8)의 저 발현에는, 형질 전환 동물의 생성 및 스크리닝 긴 시간 프레임을 포함하지 않는다. 스펙트럼 별개의 광 수용체의 적은 종류의 눈에 들어, 컬러 필터와 눈의 적응함으로써, ERG 일부 세포 유형의 기여를 낮추는 분광 감도 최대 9의 추정을 허용 도움이 될 수 있습니다.

세포 내 기록 미세 전극 셀 impales 다른 기술되고 자극이인가된다. 전극 레코드는 해당 개인 노멀idual 세포의 반응은 기록 및 다수의 개별 셀을 분석하는 것은 생리 학적으로 서로 다른 세포 유형 10-14의 특정 감도를 얻을 수 있도록. 우리의 프로토콜은 분광 감도의 분석에 초점을 맞추고 있지만, 날카로운 전극 기록 세포의 기본 원칙은 다른 응용 프로그램에 대한 수정이다. 예를 들어, 시료의 다른 제제를 사용하여 날카로운 석영 전극을 이용하는 경우, 하나의 요구되는 문제에 따라서, 뇌 광섬유 로브 또는 다른 지역의 깊이에서 기록 할 수있다. 예를 들어, 각각의 감광 셀 (15)의 응답 시간은 광 세포 활성은 19과 같은 유사한 기술로 기록 될 수 있고, 또는 컬러 자극 편광 20로 대체 될 수있다 (16) (얇은, 골수 또는 lobula 17), 머리 (18) 또는 다른 신경 로브 -22 또는 운동은 23, 24을 자극.

Phototransduction, 프로세스의 광에 의해에너지를 흡수하고 전기 신호로 변환, 거의 모든 오늘날 동물 문 (phyla) (25)에 공통 고대 특징이다. 광 수용체 세포에서 발견 비주얼 phototransduction을 시작 책임이 시각 색소는 로돕신입니다. 모든 동물 Rhodopsins 망막 또는 유사한 분자 (26, 27)에서 파생 옵신 단백질 7 트랜스 G 단백질 결합 수용체 부류의 구성원과 연관된 발색단으로 구성된다. 아미노산 서열 및 발색 구조 옵신 광의 상이한 파장에 로돕신의 흡수에 영향을 미친다. 광자 발색단에 의해 흡수되면 로돕신은 궁극적으로 막 결합 이온 채널 (28)의 개구부를 리드 셀 G 단백질 캐스케이드를 개시 활성화된다. 대부분의 신경 세포와는 달리, 감광 셀은 빛 자극 변화에 응답하여 진폭 상대적인 변화로 측정 할 수있다 그레이드 전위 변화를 겪는다. 일반적으로 주어진감광체 종류 하나만 옵신 유전자 발현 (예외 8,10,29-31 존재하지만). 정교한 색각는 다양한 척추 동물 및 절지 동물에서 발견되는 종류의 각각은 하나 이상의 때때로 로돕신 유형을 나타내는 시각 세포 수백 또는 수천의 복소 눈으로 달성된다. 시각 정보는 컬러 및 모션 완전한 화상의 인식 결과 눈과 뇌 신경 신호 전달 복합체 하류를 통해 감광 모자이크 통해 응답을 비교함으로써 캡처된다.

세포 내 기록 통한 광의 상이한 파장에 대한 시각 세포의 원료 응답을 측정 한 결과, 분광 감도를 계산할 수있다. 이 계산은 시각 세포의 반응이 아니라 그것이 흡수 된 광자 (32)의 특정 특성에,이 흡수 된 광자의 수에 의존한다고 Univariance의 원리에 기초한다. abso 어떤 광자응답의 동일한 종류를 유도 할 것이다 로돕신 의해 rbed. 실제로, 이것은 셀의 원료 응답 진폭 (로돕신 높은 확률 그 파장을 흡수) (흡수 이상의 광자)의 광 강도의 증가 중 인해 증가 또는 피크 감도 향해 파장 시프트에 것을 의미한다. 우리는 알려진 강도와 다른 파장에서 반응 동일한 파장과 같은 강도하지만 알 수없는 상대 감도 세포 반응을 관련이 원리를 사용합니다. 세포 유형은 종종 파장에서 자신의 감도 피크로 식별됩니다.

여기에서 우리는 넓은 연구 커뮤니티에이 방법이 더 접근하기를 중심으로, 세포 내 기록과 나비의 눈에서 광 수용체의 분광 감도의 분석을위한 하나의 방법을 보여줍니다. 세포 내 기록 특히 곤충 색맹에 대하여, 문헌에 공통 남아 있지만, 우리는 그쪽 발견대상 및 방법의 t 설명은 일반적으로 기술의 재생을 허용하기에 너무 짧은 있습니다. 우리는 쉽게 복제를 허용의 목적으로 비디오 형식에서이 방법을 제시한다. 우리는 또한 쉽게 얻을 수 저렴한 장비를 사용하는 방법을 설명합니다. 우리는 새롭고 복잡한 기술을 최적화 할 때 연구를 느리게 자주보고되지 않습니다 일반적인주의 사항을 해결합니다.

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프로토콜

모든 동물을 인도적으로 가능한 처리 하였다. 곤충은 코스타리카 곤충학 공급, 코스타리카에서 번데기로 제공되었다.

1.에 Heliconius 번데기 케어

  1. 꽉 모든 번데기는 곤충 핀을 사용하여 가습 실에서 2~3cm 간격을두고.
  2. 우화 후, 날개 후 건조 가습 챔버 내에서 적어도 하루 동안 살아 나비를 유지하고 기록하기 전에 매일 묽은 꿀 솔루션을 공급 할 수 있습니다.
    1. 볼륨 약 20 %의 꿀 용액에 물과 꿀을 희석하고, 얕은 페트리 접시에 붓는다.
    2. , 페트리 접시에 하나씩 개별 나비를 가져옵니다. 자신의 앞에 tarsi와 솔루션을 터치하면, 나비는 자동으로 proboscides을 확장하고 페트리 접시에서 마신다. 자신의 코가 자동으로 확장되지 않으면 밖으로 코를 끌어와 꿀 솔루션을 소개하는 집게를 사용합니다.

2. 광학 트랙, 교정 및 지표 성과실험 빛 조건의 장담

  1. 주택 및 범용 전원 공급 장치 및 밝은 백색광을 제공 할 하나 이상의 미터 길이의 테이블의 한쪽 끝에 부착 된 집광 렌즈 어셈블리와 150 W 크세논 아크 램프를 배치합니다.
    주의 : 크세논 아크 램프는 강력한 UV 강도와 매우 밝은 빛을 생산하고 있습니다. 보안경 언제나 사용할 것 및 대기 산소와 UV 광의 상호 작용에 의한 오존의 축적을 방지하기 위해 제조자의 지시에 따라 램프가 사용되어야한다.
  2. (그림 1)를 통과 하우징 어셈블리를 빠져 나가는 빛의 길이 광학 트랙 일m을 설정합니다.
    1. 떨어져 대략적인 거리와 광학 트랙에 다음과 같은 순서로 장소 : 1) 40cm 콘덴서 어셈블리에서 볼록 실리카 또는 석영 렌즈, 2) 또한 함께 빛의 경로에 현재없는 필터) 22cm와 감광 필터 휠 ( 트랙, 3) 드라이브 유닛과 셔터 ND 필터에서 14cm의, 4) 오목 실리카 또는 석영 렌즈 트랙의 끝을 따라 6cm 더 바로 셔터 다음과 인접하고, 5) 평행 빔 프로브.
    2. 평행 빔 프로브 직경 600 μm의 광섬유 케이블을 고정.
      주 : 광 강도에 따라 직경 5~10mm 광섬유 케이블을 다른 상태로 준비 충분한 광을 제공하기 위해 요구 될 수 있고,이 대체 될 수있다.
    3. 조립체를 빠져 나가는 광 빔 높은 강도 가능하도록 간격, 높이, 각 광학 소자의 각도를 조정한다.
    4. 광학 트랙 요소가 다른 응용 프로그램과 약간 다를 수 있으므로, 모든 요소가 UVA와 가시 범위 (315-700 nm의)에 빛을 투과 있는지 확인합니다.
  3. 광 선로가 조립되면, 분광기를 이용하여 설치 통과 광을 측정한다. 제 알려진 스펙트럼 제조업체의 소프트웨어 교정 램프를 이용하여 분광계를 보정.
    노트: 우리는이 (예를 들면 Avantes)을 명확하지만, 다른 제조업체 오션 광학 제품을 사용하여 설정 다음 설명 유사한 제품을 판매합니다.
    1. 측정하기 전에 텅스텐 교정 램프에 적어도 45 분을 돌립니다.
    2. 보정하려면, 설치 관련 소프트웨어를 컴퓨터에 USB를 통해 분광계를 연결합니다. 그리고 UV-볼 송신 코사인 보정을 통해 텅스텐 교정 램프 분광계를 연결합니다.
    3. "파일"탭에서 "새 절대 조도 측정"을 선택하고 같은 분광계 선택 "소스를."
    4. 새로운 보정 "CAL"파일을 만들 지시를 따릅니다. 프롬프트되면, 자동 분석 장치의 출력으로부터 상기 보정 스펙트럼을 계산 소프트웨어로 가시광 영역 (300 ~ 800 ㎚)에서 교정 텅스텐 램프 공지 스펙트럼 제공된 데이터 파일을로드.
    5. 교정 파일을 저장합니다. 때 initi이 파일을로드분광계를 사용하여 빛 스펙트럼의 모든 미래의 측정을위한 소프트웨어를 지향 모델.
  4. 분광계를 보정하면 실험 장치로부터의 광 스펙트럼을 기록 할 때 사용. 소프트웨어가 열릴 때 이하, "새 절대 조도 측정"을 선택하고 이전에 저장된 교정 파일을로드합니다. 다음 분광계 모든 빛을 차단하여 어두운 스펙트럼을.
    1. 현재 바람직한 실험 조명 조건을 측정하는 분광계, 적분 시간 (4 밀리 초)을 조정, 검사 (5) 평균하고, 박스 카 폭 (5)이므로 스펙트럼 적절히 스케일링 및 평활화되어있다. 다른 측정에서의 광 강도가 비교 될 수 있도록, 모든 스펙트럼 측정에 대해 동일한 설정을 유지합니다.
  5. 모든 감광 필터는 실험시 사용 되려면 감쇄 백색광 스펙트럼을 측정하고, 각각의 대역 통과 간섭 필터 (도 2).
    1. 엠분광계 단계 2.2.2에서 광섬유 케이블의 자유 단부를 부착하여 광 경로의 필터없이 백색광 스펙트럼을 easure. 단계 230에서로드 교정 파일, 텍스트 파일 분광계의 소프트웨어를 사용하여 백색광 스펙트럼을 저장한다.
      주 : 스펙트럼 저장된 텍스트 파일 목록으로 파장 (X 좌표) 및 하나의 열 번째 열에서 빛의 강도 (y 좌표)에서, 데이터는 단계 2.6 스프레드에로드 될 수 있도록.
    2. 단계 2.5.1과 동일한 설정을 사용하여, 광학 트랙 (ND) 필터 휠 감광 회전하여 실험 동안에 사용 된 각각의 광학 밀도 (OD) (0-3.5 OD)으로부터 스펙트럼을 기록하고 대한 텍스트 파일을 저장 각 OD.
    3. 단계 2.5.1과 동일한 설정을 사용하여, 광로에 의해 10 nm의 절반 대역 간섭 필터를 배치하고, 각 필터의​​ 관측 스펙트럼을 기록한다. (41) 다른 간섭 필터의 각 w에 대해이 절차를 반복합니다i 번째 피크의 투과율은 300 내지 700 nm의 매 10 nm의 간격. 더 떨어져 (20 나노 미터) 간격 필터는 대부분의 응용 프로그램에 대한 허용 (스펙트럼을 위해, 그림 2 참조).
  6. 빛의 강도의 차이에 대한 정확한 간섭 필터는 광 경로에 배치되는 경우. 각각의 간섭 필터는 광자의 다른 갯수가 통과 할 수 있고, 일부의 필터 모두 낮은 송신 필터 광자 동수 허용되도록 어려운 더 강도를 감쇠시킬 수있다.
    1. 각각 10 nm의 대역 간섭 필터 상대 강도 (I)를 계산하기 위해, T는 (2.5.3부터) 각각 10 nm의 간섭 필터의 분광 곡선 아래의 면적 인 식 I이 = T / 초에서 I 풀기 및 S는 각각의 필터 (520 nm에서의 예를 들면도 2 참조)의 피크 파장에서 백색광의 최대 절대 조도 (2.5.1에서 저장 한 텍스트 파일의 Y 값)이다.
    2. 모든 계산 intensit 나눈다2.6.1에서 산출 된 최대 휘도 값에 의해 IES한다 (단계 6.4 참조)을 정규화 한 각 파장의 감도에인가 원시 보정 팩터로서 사용하기에 상대적으로 정규화 된 값의 역수를 취한다.
  7. 한 번만 실험 세트 전에 단계 2.6을 통해 2.1을 수행합니다. 실험의 과정을 통해 주기적으로 빛 자극의 강도가 변경되지 않도록하기 위해, 밝은 빛과 중성 밀도 필터에서 크세논 아크 램프의 절대 조도를 기록합니다.
  8. 간섭 필터를 투과 한 광에 대한 세포 반응이 최대 진폭 응답에 근접하는 경우의 실험 과정에서, 상기 신호를 감쇠시키는 ND 필터를 사용한다. ND 필터는 실험시 사용하는 경우, 분광 감도를 계산하는 동안 강도의 대응 감소를 차지한다.
  9. 실험을 시작하기 전에 광학 트랙, 교정 및 필터 일 또는 몇 주를 설정합니다. 필터 유지먼지 축적을 방지하기 위해 덮여있다.

3. 녹음 장비 설치

  1. 이러한 카아 던 팔 둘레 (다이어그램 그림 3 참조) 패러데이 케이지를 통해 교정에 사용 된 것과 같은 광섬유 케이블을 공급하고, 고니 오 미터 장치에 탑재합니다. 케이블은 약 10cm 떨어진 시험편의 눈에서 것이다.
  2. 전극 홀더를 진동 절연 테이블 금속 단계 장소 미세 조작기의 제어에 따라 스테이지의 바로 위에 (도 4)에 장착. 시료의 헤드 아암의 회전 운동에 의해 생성 구의 중심에 위치하도록 카아 아암 놓는다.
  3. (패러데이 케이지 내부의 준비 근처 headstage) (패러데이 케이지 외부) 앰프와 프리 앰프 시편이 배치됩니다 금속 단계 위의 headstage 마운트를 포함하는 세포 내 프리 앰프 시스템을 사용.
    1. 를 통해 headstage에 동축 케이블을 연결합니다BNC 연결. 동축 케이블의 다른 쪽 끝을 개방 단에 팁을 분할하고, 상기 내부 배선의 케이블의 외부 금속 외피를 분리한다.
    2. 타단에 악어 클립 절연 구리 와이어의 일단 (접지 전위로 유지) 외피 납땜. 이 악어 입 클립 시험편 플랫폼 (단계 5.1.4)의 금속 기준 전극에 접속된다.
    3. 기록 전극의 역할을하는 얇은 은선에 동축 케이블의 내부 와이어를 납땜. 이 전선은 충분히 얇은 단계 5.2.3에서 솔루션 채워진 유리 전극에 공급 될 수 있어야합니다.
  4. 눈에 전극을 낮출에 스윙, 그리고 밖으로 다시 전극이 눈에 한 번 다시 요동 할 수 있도록, 패러데이 케이지 외부 나무 벤치에 스윙 암과베이스에 부착 된 실체를 놓습니다.
  5. 패러데이 케이지가 제대로 접지되어 내부에 있는지 모든 금속을 확인합니다.
  6. 패러데이 케이지 밖에서 preamplif을 첨부(선택 사항) 50 ~ 60 Hz의 잡음 감속기의 입력에 어 및 BNC T-어댑터를 사용하여 오실로스코프의 한 채널에 출력을 연결합니다.
  7. T 어댑터의 다른 쪽 끝을 사용하여, 하드웨어의 한 채널 오실로스코프 통과 신호를 연결한다. 프리 앰프로 기록 응답 컴퓨터 소프트웨어에 의해 판독 될 수 있도록 USB 케이블에 의해 컴퓨터에이 하드웨어 첨부.
  8. 또 다른 T-어댑터를 사용하여 오실로스코프의 제 2 채널에 광학 트랙에서 셔터 드라이버를 부착하고 눈 (단계 5.5)로 전달되는 빛을 점멸의 빈도와 지속 시간을 제어하는​​ 펄스 발생기에 연결합니다.
    참고 : 장비 자체의 설정은 한 번만 수행해야합니다. 녹음을 시작할 준비가 될 때까지 여기에 휴식.

기록의 날 4. 준비

  1. 실험 전에 크세논 램프에 적어도 45 분을 켜고 PUL 전에 유리 미세 전극 풀러 적어도 30 분을 켭니다링 유리 전극.
  2. 모든 녹음 장비 (셔터, 앰프, 소음 제거기, 펄스 발생기, 오실로스코프, 데이터 수집 하드웨어)를 켜고 셔터가 그래서 빛이 광섬유 케이블을 통과하지 기본적으로 폐쇄되어 있는지 확인합니다.
  3. 미세 보로 실리케이트 (또는 알루미 노 실리케이트) 유리 미세 전극 풀러를 사용하여 유리 미소 전극을 (100-250 MΩ 저항이 이상적입니다) 당깁니다. 끌려 단지 몇 시간 이내에 유리 전극을 사용한다.
  4. 3 M 염화칼륨 (KCl을)와 전극을 백필. 분사 염색 등이 용액 연구자의 ​​필요에 따라 변형 될 수 있습니다.

5. 시료 준비 및 녹화 절차

  1. 시편 준비
    1. 헤드와 고정되어 상기 튜브의 일단 부로부터 돌출하므로 핫 왁스와 작은 플라스틱 튜브 내부 개별 나비 부착. 코, 안테나, 날개 (그림 5) 아래로 왁스.
    2. t 누른 상태에서그는 왁스의 건조 조각으로 복부와 복부 뒤에 튜브 내부에 젖은 조직을 배치하여 가습 튜브를 유지. 시편이 완전히 고정되어 있는지 확인합니다.
    3. 자기베이스에 부착되는 볼과 소켓 조인트 작은 플랫폼에 왁스의 작은 조각을 사용하여 튜브를 탑재.
    4. 해부 현미경, 기준 전극으로 사용될 구기를 통해 헤드에 0.125 mm 직경은 와이어를 삽입한다. 실험 전에 완전히 플랫폼 기록 용 스테이지에 배치되면 단계 3.3.2의 동선이 클립에 수있는 방식으로 플랫폼에 와이어를 고정한다.
    5. 기준 전극은 적절한 위치에 있으면이를 빠르게 용융하고 와이어 주위 왁스를 냉각하여 장소에 보관 될 수있다.
    6. 작은 조각을 파괴 탄소 강철 면도날, 블레이드 홀더 블레이드의 그립 부분을 사용하고 끊다하면 각막 절삭에 사용.
    7. ~ (10 ommatidi을 작은 구멍을 잘라왼쪽 각막 직경) 탈수를 방지하기 위해 바셀린과 구멍을 면도칼을 사용하여 밀봉.
  2. 각막이 절단되면, 눈 체액이 신속하게 경화되므로 최대한 빨리 눈에 기록 전극을 삽입 불가능 전극을 삽입 할 수 있습니다. 가능하면 녹음이 일어날 장비에 절개를 수행합니다.
    참고 :이 광학 디 포커스 바와 같이 바셀린은 눈의 나머지 부분에 번지 수 없습니다.
    1. 아니 이미 무대 경우, 녹음 장비의 무대에 탑재 된 표본과 플랫폼을 배치합니다. 악어 클립을 사용하여 표본 플랫폼에서 기준 전극 단계 3.3.2에서 headstage 접지선을 연결합니다.
      참고 : 동물을 조명하는 빨간색 필터를 사용 가능합니다.
    2. 눈에 기록 전극을 낮추면서 입체경에서 표본을 간단히 불을 구즈넥 첨부 파일이있는 광원을 사용합니다.
    3. 에서유리 미세 전극의 뒷면에서의 KCl 용액에 단계 3.3.3에서 headstage에 연결된 실버 와이어를 르트. 전극 홀더에 유리 전극을 탑재합니다.
    4. 미세 전극 이전에 각막 위의 mm에 대해, 각막 잘라 구멍 바로 위에 있도록 전극 홀더를 조정합니다. 오실로스코프의 전위 (MV)의 큰 변화에 의해 나타낸 바와 같이 회로가 완료 될 때까지 미세 조작기를 사용하여 눈에 미세 전극을 낮춘다.
  3. 일단 눈, 패러데이 케이지 외부 입체경 스윙하고, 표본을 조명 광원의 전원을 끄십시오. 눈이 적응 어두운가되도록 방은 어두운 보관해야합니다.
  4. 앰프에서 1 nA의 전류를인가 전압의 변화에​​ 주목하여 전극의 저항을 확인합니다. 저항은 통상적으로 100 내지 250 MΩ의 범위에 있어야한다. 높은 저항은 차단 또는 전극의 굽힘 및 ELECTR의 낮은 저항을 나타내는입니다송시 파손.
  5. 셔터 50 msec의 지속 기간을 가진 광의 플래시 매 0.5 초를 허용하도록 열리고 펄스 발생기를 활성화하고 실험 기간 동안 점멸 지속 할 수있다.
    1. 이 50 밀리 초 시간의 섬광을 할 수 있도록 펄스 발생기를 조정합니다. 깜박 간의 지속 시간 0.5 초 일시 정지는 실험 기간 동안 가능한 적응 어두운 근처로 표본을 유지합니다. 오십 밀리 긴 플래시 지속 시간 등의 반응 동일한 진폭을 유도 할 가장 짧은 플래시 지속 시간에 가깝습니다.
    2. 시작과 실험 (단계 5.16)의 끝에서 모두 다시 측정 응답. 약 이십분 실험 과정 동안,이 플래시 설정 시간 이상 반응을 저하시키지 않는다. 다른 준비합니다 다음 플래시 설정을 조정해야 할 수 있습니다.
  6. 광섬유 케이블의 눈을 향해 지향되도록 카아 아암을 위치.
  7. 각각의 빛 플래시와 전압 변화에 대한 오실로스코프를 확인합니다.전압의 음의 변화는 전극이 아직 셀을 입력하지 않았 음을 의미한다.
  8. 이 최대 전압 응답이있는 눈에 각도로 위치 할 때까지 시편 주위에 카아 던 팔을 이동합니다.
  9. 가볍게 전극 홀더의베이스를 탭 또는 전치 증폭기에 버즈 기능을 사용하는 동안 양 방향으로 매우 작은 전극의 수직 움직임을 야기 앞뒤로 미세 조작기를 돌린다. 탈분극 광 응답 오실로스코프 (그림 6)에 표시 될 때까지 작은 조정을 계속합니다.
  10. 빛의 플래시 최대 규모의 탈분극 신호를 생성 입사각을 찾기 위해 다시 카아 던 팔을 조정합니다. micromanipulator에 작은 조정하고 전극이 안정적으로 셀을 기록하고 전체 실험 셀에 머물 것입니다 있는지 확인하기 위해 필요에 따라 앰프 버즈 기능을 사용하여 (단계 5.11 참조).
  11. 설정이 안정되면, RECO 시작rding. (: 노이즈 비율 1 신호 적어도 10) 안정된 녹화가 가능한, 낮은 소음, 그리고 지속적으로 큰 탈분극 응답을 휴식에 변화가 거의 있어야합니다.
    1. 컴퓨터의 소프트웨어를 실행, 4 채널 팝업 창을 열 것이다 "새로운 실험을"시작합니다.
    2. 500 MV에 소프트웨어 창의 오른쪽 상단 모서리에있는 전압의 크기를 조정합니다. 제 2 채널이 함수 발생기에 의해 생성되는 사각 파를 기록하는 반면 신호 오실로스코프를 통해 데이터 수집 하드웨어에 공급되는 경우, 셔터가 열렸을 때 제 채널 나타내는, 실시간 전극으로부터 기록 된 응답을 표시 . 다른 두 개의 채널이 불필요하다.
    3. 녹음을 시작하고, 소프트웨어는 실험 기간 동안 실행할 수 있도록 오른쪽 하단에 "시작"을 클릭합니다. 응답이 분명 너무 축 × (시간)와 y (전압)의 줌을 조정합니다.
  12. 첫째, 흰색 빛으로, 3.5 OD (약 5 ~ 10 초)에서 ND 필터 휠 (10) 개별 응답까지 기록한다.
  13. 다음 레코드 OD 0.0까지의 모든 조합에서 OD 3.3에서 반응 동일한 수 후 3.1, 3.0, 2.5, 2.3, 2.1 등. ND 필터 시리즈 이러한 응답 진폭 백화가 발생하면, 제 6에 응답하여 로그 강도 곡선을 제공하는 실험 과정 밝은 자극 적은 점멸을 사용할 것이다.
  14. 간섭 필터를 사용하여 모든 파장에 세포의 반응을 기록한다.
    1. 첫 번째 피크 파장을 찾을 수 있습니다. 광로 (0.0 OD)의 ND 필터없이 광로 UV 투과 필터를 배치하고 간단히 응답 진폭을 관찰한다. 피크 응답 할 영역의 일부 개념을 제공한다 청색 투과 필터, 녹색 송신 필터 및 적색 투과 필터와 반복한다.
    2. 약에 필터를 사용하면 350, 450, 550, 650 nm의은에 최대 감도의 일반적인 영역을 찾을 수단계 5.14.1. 모든 파장은 다음 단계에 기록되기 때문에 정확한 파장이 초기 탐색 단계에서 문제가되지 않는다. 추정치가 최대 민감도 존재하거나 나란히 기록되어있는 경우, 사용 파장 공지 빠르게 응답 피크의 동정을 행 하였다.
    3. 피크 응답 한 번 또는 가까운이 확인 된 경우, 10 응답 (약 5 초)이 파장에서 기록.
    4. 10 nm의 단계에서 300-700 nm의에서, 다른 간섭 필터와 피크 응답, 기록의 파장에서 녹화 후. 피크에서 시작하고 피크 응답이 520 nm의 경우,이 파장 먼저, 다음 510 nm에서 기록적인 응답, 530 다음에 예 (하나의 광 경로 하나에서 필터를 교환하여 모두 짧고 긴 파장 향해 단계 나노 미터, 500 나노 미터, 540 나노 미터, 490 나노 미터, 550 나노 미터 등 없음) 응답이 없을 때까지.
    5. 필터 당 최대 10 개의 응답 (5 초마다)을 가능하게합니다. 간섭 필터를 교환 할 때, 셀 RESP 허용번째 피크 응답이 시간이 지남에 따라 저하 여부를 모니터링하는 데 도움이되는 빛의 경로에있는 모든 필터가없는 백색의 1-2 점멸합니다. 응답 수를 줄이거 나 표백가 발생하는 경우 OD을 증가시킨다.
  15. 간섭 필터 하에서 반응이 0 OD 백색광 하에서 최대 응답에 너무 가까운 경우에, ND 필터를 감쇠. 간섭 필터와 본 실험에 사용 된 광섬유 케이블의 크기는 크게 광 강도를 감쇠 때문에 ND 필터는 일반적으로 필요하지 않다.
  16. 기록 이전 응답 진폭을 확인하기위한 pseudoreplicate 역할을하고 시간이 저하되지 않은 응답을 확인하는 데 도움이 피크 반응 주위 안정한 재 기록 파장이 남아있는 경우. 일단 모든 파장이 기록, 재 녹음 단계 5.12에서와 ND 시리즈에서 응답.
  17. 기록은 소프트웨어에 대한 완전한 클릭 "정지", 그리고 분석을 위해 녹음을 저장하면.
  18. 실험 후, 동결, 또는 신속하게 머리를 절단하고 가슴을 분쇄 한 다음 몇 분 동안 냉각에 의해 개인을 희생.
  19. 모든 장비를 종료합니다. 분석을 수행하기 전에 필요한 경우 여기에 휴식.

6. 스펙트럼 민감도 분석

  1. 원시 응답을 기록하는 데 사용되는 소프트웨어로, ND 시리즈 각각의 간섭 필터의 각 필터 (10)의 개별 응답의 평균 응답의 진폭을 계산한다.
  2. 단계에 기록 된 ND 필터 시리즈 5.12-5.13 (그림 7)의 응답 - ​​로그인 강도 (VlogI) 함수를 만듭니다. Y 축은 각 강도 X 축의 강도 (OD), 및 응답의 로그 단위를 플로팅함으로써 이것을한다.
    1. 다른 파장에서 셀의 분광 감도를 유도하기 위해, 일반적으로 단계 6.2에서 데이터에 나카 Rushton 방정식에 맞게, 그리고 서로 다른 파장의 t의 실험적으로 얻은 스펙트럼 응답을 관련이 식을 사용(이 경우 흰색 빛) 일정한 파장에 따라 그 반응을 유도하는 데 필요한 O를 상대 광자.
      참고 : 나카 Rushton 방정식은 다음과 같습니다 나는 자극의 강도는 V / V 최대 = 내가 N / (I N + K의 N), V는 응답 진폭, V 최대 최대 응답 진폭이고, K는 자극이다 ½ V 최대를 제공 강도, n은 지수 기울기이다. 다양한 방법이 곡선 피팅 소프트웨어 또는 코드 기반 통계 패키지를 포함 VlogI 데이터를이 방정식에 맞게 사용될 수있다.
    2. 간단한 계산 및 스프레드 시트 프로그램을 사용 나카 Rushton 방정식을 맞추기 위해 각 자극의 강도에 대한 VlogI 응답 데이터 변환 : 로그 [(최대 V / V) - 1]. 그 다음 최적의 라인의 식을 얻기 위해 변환 된 데이터의 선형 회귀를 수행한다.
      참고 : V 맥스는 측정 된 응답보다 커야합니다; 이 일관성을 유지하기 위해,이 방법은 V 최대 1 % GRE로 추정가장 높은 측정 된 응답보다 ater에.
    3. 회귀 직선의 식 (K)의 y 절편 / n은 음의 기울기를 취함으로써 지수 (N)를 추정 및 로그.
  3. 추정 된 V 맥스, n 및 K의 매개 변수되면, (V)로 주어진 파장에서 측정 된 스펙트럼 반응에 연결하여 각 파장에있는 셀의 스펙트럼 반응을 유도하는 데 필요한 광자와 해결의 상대적인 수를 결정 I.에 대한
  4. 각 파장 (단계 2.4.3)에서 각각의 간섭 필터에 대한 보정 계수함으로써 단계 6.3에서 계산 된 자극의 세기 (I)를 곱한다.
  5. 그들이 비교 될 수 있도록 감도를 얻기 위해 모든 강도는 V 로그-I 곡선과 관련된해야합니다. V 최대 또는 K 1/2 각 파장의 강도를 관련하여이 작업을 수행 할 단계 6.2.3에서 계산.
    1. K. 각 보정 파장의 강도를 (6.4 단계) 빼기
    2. 그런 다음 각 파장의 강도를 들면, "이 추가거리 K "값에서, 및 다중 (-1)로 K합니다.
    3. 다음으로 각 파장에 직렬로 낮은 데이터 포인트의 절대 값을 가산함으로써 포지티브 모든 데이터 포인트를 가져온다.
  6. 단계 6.5.1에​​서 새로 계산 된 농도의 역수를 취함으로써 각각의 파장에서 감도를 찾을 수 있습니다. 감도 스펙트럼은 0과 1 사이에 오도록 데이터를 변환.
  7. 동일한 유형 평균 이상의 셀로부터 표준 오차 막대 또는 95 % 신뢰 구간 (도 8)와 최종 응답 플롯을 기록한 후에.

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결과

녹화 설정의 많은 요소를 들어, 서면 설명은 충분한 정보를 제공하지 않는다.도 1은 완전한 녹화 설정에 관련된 구성 요소의 도면이다. 도 2에서, 스펙트럼 보정 팩터가 필요한 이유를 이해하고 이것이 정정을 계산하기 위해 필요하다 수득 백색광 각 간섭 필터 그려진다. 3 사진 및 이들에 사용되는 카아 아암의 다이어그램을 나타낸다

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토론

세포 내 기록 때문에 관련된 많은 기술적 인 단계를 마스터하기 어려운 기술이 될 수 있습니다. 성공적인 실험을 위해 몇 가지 중요한 점을 고려해야합니다. 우선, 실험을 수행하는 적절를 진동 절연 테이블을 갖는 것이 중요하다. 많은 연구자들은 완전히 우수한 제진주는베이스로부터 분리 탁상 공기 테이블을 사용한다. 우리의 설치는 미세 조작기 / 전극 홀더 / 표본 스테이지 장치를 배치되는 ?...

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공개

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

감사의 말

우리는 격려를 우리에게 장비를 대출에 대한 카단 팔 둘레, 킴벌리 제이미 슨, 매튜 맥 헨리, 및 라주 Metherate의 제조 후반 루디 림 부르 흐, 감사 및 Almut Kelber와 켄타로 아리카. 이 작품은 ADB에 대한 국립 과학 재단 (NSF) 대학원 연구 KJM에 친목 및 NSF 부여 IOS-1257627에 의해 지원되었다

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Butterfly pupaeSeveral local species available, need USDA permits for shipping. Carolina Bio Supply has several insect species that may be ordered within the U.S. without the need for additional permits
Large plastic cylinderAny chamber that remains humidified will work
Insect pins, size 2BioQuip1208B2
100% Desert Mesquite HoneyTrader Joe'sAny honey or sucrose solution will work
Xenon Arc LampOriel Instruments66003Oriel is now a part of Newport Corporation
Universal Power SupplyOriel Instruments68805Oriel is now a part of Newport Corporation
Optical TrackOriel Instruments11190Oriel is now a part of Newport Corporation
Rail Carrier, Large (2x)Oriel Instruments11641Oriel is now a part of Newport Corporation
Rail Carrier, Small (4x)Oriel Instruments11647Oriel is now a part of Newport Corporation
Thread Adaptor, 8-32 Male to 1/4-20 Male, pack of 10Newport CorporationTA-8Q20-10
Optical Mounting Post, 1.0 in., 0.5 in. Dia. Stainless, 8-32 & 1/4-20 (5x)Newport CorporationSP-1
No Slip Optical Post Holder, 2 in., 0.5 in. Diameter Posts, 1/4-20 (5x)Newport CorporationVPH-2
Fixed lens mount, 50.8 mmNewport CorporationLH-2
Fixed lens mount, 25.4 mmNewport CorporationLH-1
Condenser lens assemblyNewport Corporation60006
Convex silica lens, 50.8 mmNewport CorporationSPX055
Six Position Filter Wheel, x2Newport CorporationFW1X6
Filter Wheel Mount HubNewport CorporationFWM
Concave silica lens, 25.4 mmNewport CorporationSPC034
Collimator holderNewport Corporation77612
Collimating beam probeNewport Corporation77644
Ferrule Converter, SMA Termination to 11 mm Standard FerruleNewport Corporation77670This adapter allows the fiber optic to fit into the collimator holder 
600 μm diameter UV-vis fiber obtic cableOriel Instruments78367Oriel is now a part of Newport Corporation
Shutter with drive unitUniblitz100-2B
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.1 ODNewportFRQ-ND01
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.3 ODNewportFRQ-ND03
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.5 ODNewportFRQ-ND05
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 1.0 ODNewportFRQ-ND10
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 2.0 ODNewportFRQ-ND30
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 3.0 ODNewportFRQ-ND50
LS-1-Cal lampOcean OpticsLS-1-Cal
SpectrometerOcean OpticsUSB-2000
SpectraSuite SoftwareOcean Optics
Interference bandpass filter, 300 nm Edmund Optics67749
Interference bandpass filter, 310 nm Edmund Optics67752
Interference bandpass filter, 320 nm Edmund Optics67754
Interference bandpass filter, 330 nm Edmund Optics67756
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Interference bandpass filter, 350 nm Edmund Optics67757
Interference bandpass filter, 360 nm Edmund Optics67760
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Interference bandpass filter, 400 nm Edmund Optics65732
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Interference bandpass filter, 589 nm Edmund Optics65647
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Interference bandpass filter, 690 nm Edmund Optics65659
Interference bandpass filter, 700 nm Edmund Optics67771
Faraday cageAny metal structure will work that can be grounded and that fits the experimental setup.
Stereomicroscope, 6X, 12X, 25X, 50X magnificationWild HeerbruggWild M5Any Stereomicroscope will do
Microscope stand with swinging arm and heavy baseMcBain InstrumentsAny heavy base with arm will do
Cardan armCustom built, See Figure 4
Fiber-lite high intensity illuminatorDolan-JennerMI-150For lighting specimen
Fiber-lite goose-neck light guideDolan-JennerEEG 2823Any goose-neck light guide will do
Marble table
Raised wooden tableHole should be cut through this table so that the sandbox can rest on the marble table underneath
Wooden box filled with sandcustom built, any box with sand
ManipulatorCarl Zeiss - Jena
Electrode holder
Specimen stage
Alligator clip wires for grounding
Insulated copper wire
Silver wire, 0.125 mm diameterWorld Precision InstrumentsAGW0510
BNC cables
Preamplifier with headstageDagan CorporationIX2-700
Humbug Noise reducerQuest ScientificHumbug
Oscilloscope, 30 MHz, 2 CH, Dual Trace, Alt-triggering, without probeEZ Digitalos-5030
BNC T-adapter
Powerlab hardware 2/20ADI instrumentsML820
Labchart softwareADI instrumentsChart 5
10 MHz Pulse GeneratorBK Precision4030
Glass pipette pullerSutter InstrumentsP-87
Borosillicate glass capillaries with filamentWorld Precision Instruments1B120F-4
Potassium chloride, 3 M
Slotted plastic tube
Low melting temperature wax
Soldering IronWeller
Platform with ball-and-socket magnetic baseHama photo and video
Double edge carbon steel, breakable razor bladeElectron Microscopy Sciences72004
Vaseline
Microsoft ExcelMicrosoft

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