기능 보완 분석 (FCA) : 설계 및 생화학 적 경로의 교육을 보완하기 위해 구현 된 실험실 운동

요약

생화학 적 경로에 관여하는 효소 활성의 유효성 기능성 상보성 분석 (FCA)를 사용하여 설명 될 수있다. 아미노산, 세균 엄격한 반응 세균 펩티도 글리 칸의 생합성의 대사에 관여하는 효소의 효소 활성을 보여주는 FCA 분석이 논문에 설명한다.

초록

기능성 상보성 분석 (FCA)는 널리 유전자 / 효소의 기능 / 역할을 규명하기 위해 사용되는 생체 내 분석이다. 이 기술은 생화학, 유전학 및 기타 여러 분야에서 매우 일반적입니다. 기술의 포괄적 인 개요 펩티도 글리와 세균 엄격한 응답이 원고에보고 산, 아미노에 관련된 생화학 적 경로의 가르침을 보완합니다. 라이신 (L, L-디아 미노 아미노 전이 효소 (DAPL)과 티로신 및 페닐알라닌의 대사에 관여하는 티로신 아미노 전이 효소 (tyrB)의 대사에 관여하는 모델 식물 생물 애기 장대에서 두 cDNA를가 강조 표시됩니다. 또한, 세균 펩티도 글리 신진 대사 경로는 십자가에 포함 된 세균 Verrucomicrobium spinosum 등의은 UDP N -acetylmuramoyl-L-알라 닐 D-글루탐산 염 메소 -2,6- 디아 미노 리가 아제 (무레) 유전자의 분석을 통해 강조펩티도 글리의 -linking. 세균 엄격한 응답도. RSH (R 영어 / s의 냄비 시간 omolog) 박테리아 Novosphingobium 특검팀의 하이퍼 점액 표현형에 대한 책임 관능 성 유전자의 분석을 통해보고 FCA의 네 가지 예를 제시한다. 동영상 즉 리신, 펩티도 글리 칸과 반응 엄격한 이들 세에 초점을 맞출 것이다.

서문

유전자의 기능 (들)을 해명 / 역할 (들)의 맥락에서 기능적 상보성은 상동 야생형 상태로 관찰 표현형으로 특정 돌연변이를 복원하는 특정 동종 또는 orthologous 유전자의 능력으로 정의된다 또는 orthologous 유전자 돌연변이 배경으로 시스 또는 트랜스에 도입된다. 이 기술은 넓게 분리 및 기능 (들)는 많은 유전자 / 역할 (들)을 식별하는 데 사용되어왔다. 하나의 특정 예는 S. URA3의 돌연변이를 사용하여 칸디다 알비에서 orotidine -5- 인산 라제의 분리 및 식별이며 cerevisiae의와 E.의 pyrF 돌연변이 대장균. ^한 저자는 아미노산, 펩티도 글리 칸과 그 연구 프로그램에서 엄격한 반응의 대사에 관여하고 B에서의 교시 프로그램에이 기술을 도입 한 유전자의 기능을 규명하기 위해이 기술을 사용한iotechnology 및 분자 생명 과학 (BMB) 기술의 로체스터 대학 (RIT)에서 프로그램.

원칙과 사례 (BPP) (허드슨 / Savka)는 RIT에서 BMB 프로그램에서 두 개의 상 부문 과목 실험실 기초 과정 : 저자는 식물 생화학 / 병리학 (FPBP) (허드슨)와 Bioseparations의 기본을 가르친다. 과정에서 설명하는 주제 중 일부는 자신의 연구 분야에 소속되어 있기 때문에, 저자는이 두 실험실 기반의 과정으로 각각의 연구 프로그램에 사용되는 기술과 실험 도구의 대부분을 포함하고있다. 이러한 하나의 예는 식물, 펩티도 글리 칸과 세균에서 엄격한 반응 대사로부터 대사 산 아미노기에 관한 강의 자료를 강화 실험실 운동 기능성 보완한다.

FPBB 과정에서 논의 식물에서 아미노산 경로의 세 가지가 있습니다 그 라이신 (리스)의 티로신(티르) 및 페닐알라닌 (프). 동물리스 드 노보 합성에 유전 장치가 부족하기 때문에리스 통로 때문에 모든 동물, 특히 인간을위한 필수 아미노산과 같은 아미노산의 중요성 과정에서 강조된다. 또한, 최근에는 식물 세균과는 크게 다르다리스의 합성을위한 경로를 사용하는 것이 발견되었다. 이 발견은 부분적 E. 기능적 보완에 의해 촉진 된 콜라이 디아 미노 (DAP) 모델 식물 애기 장대에서 효소 1,1- 디아 미노 아미노 전이 효소 (DAPL)를 코딩하는 유전자를 사용하여 ^{돌연변이.이} 중간체 디아 미노 통해리스의 합성 변형 경로가도 1에 도시되어있다. 또 ,리스의 합성 고도로 조절되는 아미노산 아스파르트 유도 패밀리를 통해 용이하게한다. ³ 단백질 SYNT의 중요성에 더하여hesis, 티르와 프에 대한 경로는 phenylpropanoid 화합물의 동화에 대한 전구체 화합물로서 자신의 중요성을 같은 식물 방어 화합물의 합성에 관여 주어 강조 표시됩니다 :. 알칼로이드, 리그닌, 플라보노이드, 이소 플라보노이드, 다른 사람의 사이에서 히드 록시 산을 ⁴ 티르 및 프 경로는 또한 식물과 박테리아 신진 대사 경로의 차이를 보여주기 위해 강조 표시됩니다. 식물에서 효소 티르 및 프의 이화 작용에 주로 관여 이들 아미노산의 동화 작용에 관여되지 않은 반면, 박테리아, 효소 타이로신 아미노 전이 효소 (TyrB)은 두 아미노산의 동화 작용에 관여한다. (그림 2). ⁽⁴⁾

그람 양성 및 그람 펩티도 글리 (PG)의 구조에 대한 음성 세균 사이의 차이는 FPBP 과정에서 강조 표시됩니다. 그람 음성 박테리아의 PG는 사실에 기초한 식물 병리학 관한 관심의 대부분이식물 병원균은 그람 음. 상위 10 세균 피토 - 병원균에 대한 최근 평가는 모든 그램 부정적인 것으로 나타났습니다. 박테리아는 장군으로부터있었습니다. 슈도모나스, Ralstonia, 아그로, 크 산토, 에르 위니아, Xylella, Dickeya 및 Pectobacterium 화학적 차이 ⁵ 1 그램 네거티브 및 그람 양성 세균의 PG 줄기 비교 가교 아미노 차이 인 두 가지 유형의 산. PG의 다른 가교의 초기 단계는 PG의 동화의 세포질 단계에서 발생하고 효소은 UDP N -acetylmuramoyl-L-알라 닐 D-글루탐산 염 메소 -2,6- 디아 미노 리가 아제에 의해 촉진된다 (무레) (그림 3A). 무레 대부분의 그람 음성 세균에서, 펩티드 줄기 번째 ^{위치.도 6에서,} 특정 디아민 화합물의 첨가 반응을 촉매, 끝에서 두 번째는리스 (메소 -diaminopimelate을 전구체 m의 -DAP)의 역할 가교 아미노산 LYS 것은 대부분의 그람 양성균의 PG (도 3B)에서 동일한 역할 역할을한다. ^(7)이 m의 -DAP 및 LYS 모두 두 아민을 가지고 있다는 사실에 기인 그룹 및 펩타이드 줄기 가교 두 펩티드 결합을 형성 할 수있다.

Bioseparations에서 : 원칙과 사례 (BPP) 과정으로 인해 환경 변화에 박테리아의 배양 방법과 영양 수준 모두 시스템에서 크게 변경됩니다 오픈과 폐쇄 시스템의 차이점은 설명합니다. 이 이벤트는 "아래로 이동"또는 "최대 이동"라고 규정 변경에 링크 된 기아 또는 아미노산 또는 에너지의 적절한 공급에 의해 트리거. 박테리아 문화가 하나의 탄소 소스와 화학적으로 정의 된 매체에 풍부하고 복잡한 매체에서 전송 될 때 "아래로 이동"응답이 발생할 수 있습니다. 환경의 변화는 급속한 cessa에 이르게의 tRNA와 rRNA의 합성 기. 아미노산의 생합성이 상향 조절 되더라도 리보솜 단백질 및 DNA 합성의 부족이 중단 결과.

은 "다운 시프트"반응에 따라, 기존의 변이는 중간 또는 환경에서 더 이상 사용할 수있는 아미노산을 합성하는 신규 효소를 생산하는 데 사용된다. 일정 기간 후, rRNA의 합성 및 새로운 리보솜 조립하고 박테리아 세포의 인구는 감소 속도 비록 성장하기 시작합니다. 사건의 과정은 "엄격한 반응"또는 "엄격한 제어"라고 글로벌 세포 조절의 예이며, 필요한 기질, 에너지 수요의 유용성을 보완하기 위해 셀의 생합성 장치를 조정하기위한 메커니즘으로 생각 될 수있다 . ⁸ 엄격한 반응 따라서 환경의 영양소의 광속에 빠르게 응답하는 세균을 가능 기여 ENH영양소 및 또는 기판의 가용성에 관해서 빠르게 변화 할 수있는 환경에서 경쟁하는 박테리아의 능력을 또한 여러개. ^8-9

엄격한 반응은 아미노산, 탄소, 질소, 인산, 및 지방산의 이용이 제한되어 유전자 발현에 필수적인 역할을 갖는다. ^8,10-14이 엄격한 응답 개의 뉴클레오티드, 구아노 신 tetraphosphate 포스페이트 (ppGpp) 및 구아노 신으로 배위 pentaphosphate (pppGpp)는 일반적으로 alarmone (P) ppGpp으로 함께 언급했다. 예를 들어, 아미노산이 제한된있는 경우, 구아노 신 3 인산 5 인산의 동화에서 파생 된 구아노 신 3,5- (비스) 피로 인산 포스페이트 (ppGpp)는 (pppGpp)는 축적 단백질 합성 - 더 alarmone의 병목 현상으로 이어질 수 있습니다 셀이다. (p) ppGpp 레벨의 변화는 직접적으로 세포의 성장과 developmen는 관여하는 환경에서 기판의 부족을 극복하기 위하여 반응을 조절하는 유전자의 발현에 관여티. 이 과정에 관여하는 유전자 중 두 RELA 및 지점이라고합니다. RELA 아미노산 제한의 결과 비 대전 된 tRNA의 누적에 대한 반응에 관여하는 리보솜 연결된 (p) ppGpp 합성이다. 관능 성 (P) ppGpp 합성 및 가수 분해 효소 등의 스팟 기능. SPOT의 합성 효소 활성 탄소와 지방산 기아의 부족에 대한 응답에 참여하고있다. RELA / 스팟 동족체는 식물과 박테리아에서 광범위하고 R 영어 / S 냄비 시간 omologs에 대한 RSH라고합니다 ^{8. 8, 10 -12,16} 최근 원고 박테리아 Novosphingobium SP는 Rr을 2-17에서 이러한 alarmones 합성에 관여하는 특정 RSH 단백질이 있다는 것을 보여 주었다. ¹⁷

여기에서 우리는 기능 보완 분석에 닿는 네 생화학 적 경로를 제시한다. 이 논문에서 설명하는 보완 분석은 EXPL하는 수단을 제공합니다광석 알 / 추정 기능 (들) 또는 티칭 도구 생화학 적 경로의 가르침을 보충하면서 가질 것으로 예상되는 효소를 식별하거나 특징 짓는 수단으로서 본 생체 내 분석을 이용.

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프로토콜

참고 : 저자는 관심이있는 개인을위한 교육 목적을위한 기능 보완 분석의 통합을 용이하게하기 위해 균주 및 재조합 플라스미드를 제공하고자합니다. 기능적 보완 실험을 용이하게하기 위해 사용 된 플라스미드는하기 표 1에 나열되어있다.

기능 보완을위한 플라스미드 1. 건설

1. 기능 보완을위한 디아 미노 아미노 전이 효소 (DAPL)의 클로닝.
   1. V.에서 DAPL 오픈 리딩 프레임 (ORF)를 증폭 A.에서 spinosum 등 및 cDNA를 장대와 C. PCR에 의한 reinhardtii에서. 15 초 동안 94 ° C의 30주기, 30 초 동안 60 ° C, 2 분 동안 72 ° C이어서 2 분 94 ° C에서 1주기를 사용합니다. 각각의 프라이머 12 pmole의 포함, 1 mM의 _황산, 0.5 mM의 4 옥시 뉴클레오티드의 트리 포스페이트의 각, 그리고 템플릿 DNA의 0.5 NG와 PFX 1 부DNA 폴리머 라제.
      참고 : 공장 A.로부터 3 DAPL의 orthologs의 재조합 복제에 관한 완전한 설명 장대 (-dapL에서), 박테리아 Verrucomicrobium spinosum 등 (대 -dapL)와 조류 인 Chlamydomonas reinhardtii에서 크롬 (Cr -dapL가) 이전에 출판되었습니다. ^2,18-20
      참고 : 다음과 같이 DAPL의 orthologs의 복제에 사용 된 프라이머는 다음과 같습니다 :
      DAPL F- 대 5'- CCCCGAATTCATGGCCCTCATCAACGAAAACTTCCTCAAG-3 '
      DAPL R 대 5' CCCCGTCGACCTACTTCAGCGCGGCGATACGGCGGCAGAC-3 '
      DAPL F-에서 5'-GGGGCATTGGAAGGAGATATAACCATGGCAGTCAATACTTGCAAATGT-3 '
      에서 DAPL R-5' GGGGGTCGACTCATTTGTAAAGCTGCTTGAATCTTCG-3 '
      CR DAPL F-5' CCCCCGAATTCATGCAGCTCAACGTGCGGTCCACCGCCAGC- 3 '
      CR DAPL R -5'- CCCCCAAGCTTCTAGTTACGCTTGCCGTAGGCCTCCTTAAA-3 '
   2. t로 PCR 단편을 복제그 pET30A이 재조합 플라스미드를 생산하는 플라스미드, pET30A :: 대 DAPL, pET30A :: DAPL 및 프라이머, 제한 효소와 T4 DNA 리가 아제를 사용 pET30A :: CR DAPL에서.
      1. 간단히 삽입의 50 NG와 1 배 리가 버퍼 벡터의 20 ng의 하룻밤 17 ° C에서 T4 DNA 리가 아제의 1 단위를 품어. E.으로 내고 변환 LB 플레이트에서 콜로니에 대한 대장균 DH5α 세포와 스크린은 24 시간 동안 37 ℃에서 배양하여 50 μg의 / ㎖ 카나마이신으로 보충 ^{-1. 18-20}
   3. 제한이 pET30A :: CR DAPL 위해를 XbaI 및 SalI로과를 XbaI과 HindIII로 효소와 기능 보완을위한 플라스미드를 만들려면 DAPL 플라스미드에서 pET30A :: 대 DAPL 및 pET30A을 :: 소화. 플라스미드 : pBAD33 대 DAPL 생산 T4 DNA 리가 아제를 사용하여 플라스미드 내로 삽입 pBAD33을 결찰; pBAD33 :: DAPL 및 pBAD33 : CR DAPL에서.
      1. 삽입의 50 NG 20 NG를 품다1 배 리가 버퍼 벡터 하룻밤 17 ° C에서 T4 DNA 리가 아제의 1 단위의. E.으로 내고 변환 LB 플레이트에 식민지에 대한 대장균 DH5α 세포와 화면이 24 시간 동안 37 ° C를 배양하여 34 μg의 / ㎖ ^-1 카나마이신으로 보충. ⁽²⁰⁾
2. A.에서 티로신 아미노 전이 효소 (tyrB)의 클로닝 기능 보완을위한 장대.
   참고 : A.에서의 cDNA의 복제에 관한 자세한 At5g36160은 전술 한 궤적 태그로 주석 장대. ⁽⁴⁾
   1. PCR에 의해 cDNA를 증폭. 15 초 동안 94 ° C의 30주기, 30 초 동안 60 ° C, 2 분 동안 72 ° C이어서 2 분 94 ° C에서 1주기를 사용합니다. 각 프라이머 12 pmole을 포함 1mM의 _황산, 0.5 mM의 네 개의 데 옥시 뉴클레오티드 트리 포스페이트를 각각, 및 주형 DNA 0.5 NG 및 PFX DNA 중합 효소 1 단위.
      주 : CL에 사​​용되는 프라이머다음과 같이 At5g36160의 oning은 다음과 같습니다 :
      tyrB F-에서 5'-CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 '
      AttyrB R-5' CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 '
   2. EcoR1 및 Sal1 함께 PCR 단편을 절단함으로써 재조합 플라스미드 pET30A :: At5g36160를 생산하는 플라스미드 pET30A로 단편 클론; 후술 T4 DNA 리가 아제를 사용 pET30A에 단편에 결찰. ⁽⁴⁾
   3. 상기 기능성 보완 플라스미드를 작성 제한를 XbaI 및 HindIII로 효소로 pET30A :: At5g36160 다이제스트와 T4 DNA 리가 아제를 이용하여 재조합 플라스미드 pBAD33 :: At5g3160 생산 동일한 제한 효소 부위를 사용 pBAD33에 삽입물을 결찰한다.
      1. 삽입의 50 NG와 1 배 리가 버퍼 벡터의 20 ng의 하룻밤 17 ° C에서 T4 DNA 리가 아제의 1 단위를 품어. E.으로 내고 변환 LB 플레이트에 식민지에 대한 대장균 DH5α 세포와 화면이 34 μg의 / ㎖ ^-1 chlo 보충24 시간 동안 37 ° C를 배양하여 ramphenicol. ⁽⁴⁾
3. 의 클로닝은 UDP N V.에서 -acetylmuramoyl-L-알라 닐 D-글루탐산 염 메소 -2,6- 디아 미노 리가 (무레) 기능 보완을위한 spinosum 등.
   참고 : V.에서 무레 ORF의 복제 spinosum 등은 이전에 설명되었다. ¹⁸
   1. PCR에 의한 오픈 리딩 프레임을 증폭한다. 15 초 동안 94 ° C의 30주기, 30 초 동안 60 ° C, 2 분 동안 72 ° C이어서 2 분 94 ° C에서 1주기를 사용합니다. 각 프라이머 12 pmole을 포함 1mM의 _황산, 0.5 mM의 네 개의 데 옥시 뉴클레오티드 트리 포스페이트를 각각 주형 DNA 0.5 NG 및 PFX DNA 중합 효소 1 단위. 그런 다음 플라스미드 pET100D :: 대 무레를 생산하는 플라스미드 pET100D으로 복제.
      주 : 다음과 같이 대 무레의 클로닝을 위해 사용 된 프라이머는 :
      무레 F-5' CACCATGACCATTTTGCGCGATCTTATCGAGGGT 대 -3 '
      대무레 R-5' GTCGACTCACTGACGGTCATCCCTCCTTTGGCGTGC-3 '
   2. , 기능 보완을위한 플라스미드를 생산하는 pET100D을 소화하려면 :: 대 무레를
      제한과를 XbaI 및 Sal1 효소 재조합 플라스미드 : pBAD33 대 무레 T4 DNA 리가 제를 사용하여 생산 pBAD33 내로 삽입 결찰.
      1. 하룻밤 17 ° C에서 T4 DNA 리가 아제의 1 단위와 함께 삽입의 50 NG와 1 배 리가 버퍼 벡터의 20 NG를 품어. E.으로 내고 변환 24 시간 동안 37 ° C를 배양하여 34 μg의 / ㎖ ^-1 클로람페니콜 보충 LB 플레이트에 식민지에 대한 대장균 DH5α 세포와 화면. ⁽⁸⁾
4. 기능 보완을위한 Novosphingobium 특검팀에서 RELA / s의 냄비 (RSH)의 클로닝.
   참고 :. Novosphingobium 특검팀에서 RSH의 복제는 이전에 기술 된 ^17.
   1. 599 뉴클레오티드의 upst 외에 RSH의 ORF를 증폭PCR에 의해 종결 부위 하류 개시 시작 부위, 46 개 뉴클레오티드의 묶음. 15 초 동안 94 ° C의 30주기, 30 초 동안 60 ° C, 2 분 동안 72 ° C이어서 2 분 94 ° C에서 1주기를 사용합니다. 각 프라이머 12 pmole을 포함 1mM의 _황산, 0.5 mM의 네 개의 데 옥시 뉴클레오티드 트리 포스페이트를 각각 주형 DNA 0.5 NG와의 Taq DNA 중합 효소 1 단위. 그런을 pCR2.1 :: NSP의 RSH를 생산하는 플라스미드을 pCR2.1에 클로닝.
      1. 증폭 된 PCR 단편의 1 μL,을 pCR2.1 벡터의 1 μL, 소금 용액 1 μL 및 물 1 μl를 품어. 5 분 및 결찰의 2 μL E.으로 25 ° C에서 품어 LB 플레이트에서 콜로니에 대한 대장균 세포 및 스크린 (37)을 배양함으로써 50 μg의 / ㎖ 카나마이신으로 보충 ^-1 24 시간 동안 C를 °.
         주 : 다음과 같이 RSH의 클로닝을 위해 사용 된 프라이머는 :
         RSH F-5' GTTGAAAAACGCCGAATAGC -3 '
         RSH R-5' GAGACCTGTGCGTAGGTGGT -3 '
      2. 기능적 보완 내용을 pCR2.1 플라스미드 : NSP는 EcoR1으로 rsh하여 다이제스트와 T4 DNA 리가 아제를 이용하여 재조합 플라스미드 RSH pRK290 :: NSP 생산 넓은 숙주 범위 pRK290 내로 삽입 결찰.
         1. 삽입의 50 NG와 1 배 리가 버퍼 벡터의 20 ng의 하룻밤 17 ° C에서 T4 DNA 리가 아제의 1 단위를 품어. E.으로 내고 변환 LB 플레이트에 식민지에 대한 대장균 DH5α 세포와 화면 (37)을 배양하여 10 μg의 / ㎖ ^-1 테트라 사이클린 보충 24 시간 동안 C를 °. ⁽¹⁷⁾

변환을 용이하게하기 위해 전기 관할 균체 2. 제조

참고 : 전기 유능한 세포의 제조는 작은 볼륨 (즉, 250 ㎖)까지 확장 할 수 있습니다 문화의 1.0 L의 프로토콜 26을 기반으로합니다. 이 프로토콜은 ㄱ 수 있습니다전자는 FCA를 용이하게하기 위해이 논문에서 설명하는 능력이 모든 변종을 만드는 데 사용. ⁽²²⁾

1. 플라스크에 하나의 식민지로 액체 배지 50 ㎖를 접종하고이 단계 (표 2)를 시작하기 전에 돌연변이의 유전자형을 확인해야하고, 밤을 통해 성장한다.
2. 하루 두에서 하룻밤 문화의 50 ㎖와 적절한 배지 (LB 대장균 돌연변이 및 PD Novosphingobium 특검팀에 대한) 1.0 L를 접종하고, 30 ℃에서 (위상 로그인) 0.4-0.6로 OD _600로 증가 기음.
3. 4 ℃에서 15 분 동안 5000 × g으로 원심 분리에 의해 수확 된 세포 상등액을 가만히 따르다, 멸균 빙냉 순수한 H ₂ O. 500ml에 펠렛을 재현 탁
4. 원심 분리기는 세포는 4 ° C에서 20 분 동안 5,000 XG에서, 뜨는을 가만히 따르다 및 살균 얼음처럼 차가운 10 % 글리세롤 250 ㎖에 펠렛을 재현 탁.
5. 4에서 20 분 동안 5,000 XG에서 세포를 원심 분리기 ° C, 슈퍼를 가만히 따르다natant, 10 % 글리세롤, 2.0 ㎖에 펠렛을 재현 탁.
6. 드라이 아이스 - 에탄올 욕에서 튜브를 배치하여 즉시 동결 마이크로 원심 분리기 튜브에 50 μl를 전사함으로써 세포를 분취. 전기에 대한 -80 ° C에서 관할 세포를 저장합니다.

보완 플라스미드와 세균 세포의 3 Electroporation에

1. 일렉트로 들어 적격 세포의 분액 (50 μL)으로 재조합 플라스미드 1.0 μL (10-50 NG)를 첨가하고, 5 분 동안 얼음 상에 놓는다.
2. 일렉트로 큐벳에 피펫을 통해 혼합물을 전송하고 다음 설정에 전기 장치를 설정 : 25 μF의 용량, 2.5 kV로, 200 옴 저항 및 펄스를 제공합니다.
3. 15 ML 원뿔 튜브에 피펫을 사용하여 복구 일렉트로 큐벳에 미디어 (LB) 및 전송의 1.0 ML을 추가합니다. 진탕 배양기에서 60 분 동안 부드러운 회전을 복구 할 수 있습니다.
4. RECO에서 문화의 100 μl를 플레이트한천 플레이트 상에 매우 단계는 피펫에 의해 형질 전환 및 멸균 스프레더를 사용하여 확산을 위해 선택합니다.
   주 : 적절한 한천 플레이트를 만들기 위해 항생제와 유전자형을 확인하려면이 단계를 시작하기 전에 표 1과 표 2를 확인해야합니다.

AOH1 4. 형질 전환하여 보완 기능을 용이 1,1- 디아 미노 아미노 전이 효소 (DAPL)

1. 보완 분석을 위해, 빈 벡터 (pBAD33)와 AOH1를 변환 및 3.0 절에 설명 된 전기 프로토콜을 사용하여 별도의 변환 이벤트에서 DAPL 발현 벡터와.
2. 50 μg의 / ㎖ ^-1 DAP, 34 μg의 / ㎖ ^-1 클로람페니콜 50 μg의 / ㎖ ^-1 카나마이신으로 보충 LB 한천 배지에 도금에 의해 형질 전환을 선택합니다.
3. LB 날에 줄무늬에 의해 복제 - 도금 식민지로 기능 보완을위한 테스트0.2 %와 50 μg의 / ㎖ ^-1 DAP, 34 μg의 / ㎖ ^-1 카나마이신없이 (w / v)의 아라비 노스와 dium.
4. 24 시간 동안 30 ° C에서 번호판을 품어하고 결과를 관찰합니다.
   주 : 결과는 벡터만을 제어에 비해 돌연변이 만 DAPL 유전자 돌연변이 배경에서 발현되는 유일한 DAP없는 배지에서 성장할 수 있음을 표시한다.

TKL-11 5. 변환은 UDP N의 -acetylmuramoylalanyl-D는 - 글루 타밀 -2,6- 메소 사용 보완 기능을 용이 -diaminopimelate 리가 제 (무레)

1. 빈 벡터 (pBAD33)와 3.0 절에 설명 된 프로토콜을 사용하여 무레 발현 벡터 (pBAD33 :: VsmurE)와 돌연변이 변환.
2. LB 한천 배지에 플레이트를 선택 형질 전환 / ㎖ ^-1 클로람페니콜 50 μg의 / ㎖ ^-1 티민, 34 μg의 보충 및 24 시간 동안 30 ° C에서 접시를 품어.
3. 제어 및 두 개의 LB 매체 플러스 0.2 % (w / v)의 아라비 노스와 50 μg의 / ㎖ ^-1 티민 상 실험 변환 모두에서 식민지 줄무늬 또는 도금에 의해 보완하기위한 시험.
4. 시각적으로 성장 표현형을 평가 한 30 ° C에서 접시와 24 시간 동안 42 ° C에서 다른 품어.
   주 : 결과는 돌연변이가 무레 유전자 벡터만을 제어에 비해 돌연변이 배경에서 발현되는 경우에만 42 ℃에서 성장할 수 있음을 표시한다.

DL39 6. 변환 타이로신 아미노 전이 효소를 사용하여 보완 기능을 용이하게하기 위해 (tyrB)

1. LB 한천 플레이트에 pBAD33 또는 pBAD33 :: At5g36160 중 하나와 DL39 변환, 선택 형질 전환 섹션에 설명 된 50 μg의 / ㎖ ^-1 티로신, 50 μg의 / ㎖ ^-1 페닐알라닌 및 프로토콜을 사용하여 34 μg의 / ㎖ ^-1 클로람페니콜 보충 3.0.
2. 레플리카50 μg의 / ㎖ ^-1 페닐알라닌과 50 μg의 / ㎖ ^-1 티로신, 50 μg의 / ㎖ ^-1 아스 파르 테이트, 50 μg의 / ㎖ ^-1 류신, 50 ㎍ / ml의 ^-1 발린 최소한의 (M9) 미디어 -plate 식민지, / ㎖ ^-1 이소류신 50 μg의, 10 ㎍ / ㎖의 ^-1 우라실 0.5 % 글리세롤 (/ V w), 0.2 % (w / v)의 아라비 노스. 두 판의 같은 식민지 줄무늬에 의해 페닐알라닌과 티로신 부족한 판에 또한 복제 판 식민지.
3. 성장 표현형을 관찰하기 위해 48 시간 동안 30 ℃에서 플레이트를 인큐베이션.
   주 : 결과는 벡터만을 제어에 비해 돌연변이 만 돌연변이 배경에서 tyrB 유전자가 발현되는 경우에만, 페닐알라닌 및 티로신이없는 배지에서 성장할 수 있음을 표시한다.

Hx699 7. 변환은 Hypomucoid 표현형 Novosphingobium의 SP의 기능 보완을 촉진합니다. 스트레인 Hx699

1. 3.0 절에 설명 된 변환 프로토콜을 사용하여 2 개의 별도 변환 이벤트에서 야생 형 변형 Novosphingobium 특검팀 변환. (Rr2-17)와 pRK290와 돌연변이 Hx699 및 pRK290 :: RSH _NSP.
2. 감자 덱 스트로스의 변환 플레이트 (PD) 한천은 10 μg의 / ㎖ ^-1 테트라 사이클린 보충하고, 최소 24 시간 동안 또는 형질 전환이 나타날 때까지 배양한다.
3. 킬 모두 변환 신선한 PD 아가 플레이트에 "X"패턴 30 부화 적어도 4 일 동안 C를 °. 시각적 두 판의 성장 표현형을 조사하여 유일한 벡터 및 실험의 표현형을 관찰한다.
   참고 : 결과는 RSH는 벡터 만 제어에 비해 돌연변이 배경으로 표현 될 때 저자 점액 표현형이 보완되는 것을 보여 주어야한다.

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결과

다양한 기능 보완 분석에 사용 된 균주는 표 2에 나열되어 있습니다.

기능 보완 분석 : L, L-디아 미노 아미노 전이 효소 (DAPL)

E. 이중 돌연변이 대장균 AOH1 (Δ DAPD :: Kan2, dapE6)는 DAPE 유전자의 돌연변이 및 DAPD 유전자의 완전한 결실 (도 1)...

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토론

기술의 로체스터 연구소의 생명 공학 및 분자 생명 과학 교과 과정에 필수적인 과정의 대부분은 과정의 강의 부분에 추가하여 실험실 구성 요소를 가지고있다. 학기 2014에서 2015 사이의 교과 과정은 약 60 %를 차지 실험실 성분을 포함 29있는 48 코스, 총이 포함되어 있습니다. 원칙과 사례 (BPP), 실험실 기초 과정 : 하나의 코스는 식물 생화학 및 병리학 (FPBP), 혼합 강의 / 실험 과정 및 Bioseparations의 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
E. coli mutants	Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)
Electroporator	Biorad-USA	1652100
Electroporation Cuvettes	Biorad-USA	1652082
Temperature controlled incubator	Generic
Microcentrifuge	Generic
Luria Agar	Thermofisher Scientific	22700025
Luria Broth	Thermofisher Scientific	12795084
M9 Medium	Sigma-Aldrich	63011
Potato Dextrose Medium	Fisher Scientfic	DF0013-15-8
Kanamycin	Sigma-Aldrich	K1377
Diaminopimelate	Sigma-Aldrich	92591
Thymine	Sigma-Aldrich	T0376
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378
Tyrosine	Sigma-Aldrich	T3754
Phenlylalanine	Sigma-Aldrich	P2126
Aspartate	Sigma-Aldrich	A9256
Valine	Sigma-Aldrich	V0500
Leucine	Sigma-Aldrich	L8000
Isoleucine	Sigma-Aldrich	I2752
Uracil	Sigma-Aldrich	U0750
Gylcerol	Sigma-Aldrich	G5516
Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
Tetracyline	Sigma-Aldrich	87128
Taq DNA polymerase	Thermofisher Scientific	10342-020
Platinum pfx DNA polymerase	Thermofisher Scientific	11708-013
T4 DNA ligase	Thermofisher Scientific	15224-041
E. coli Dh5-alpha	Thermofisher Scientific	18258012
E. coli Top10	Thermofisher Scientific	C4040-03
pET100D/topo vector	Thermofisher Scientific	K100-01
pCR2.1 Vector	Thermofisher Scientific	K2030-01