개발<em&gt; 체외</em&gt; 안구 플랫폼은 콘택트 렌즈를 테스트하는

요약

콘택트 렌즈 CLS () 및 기타 눈 관련 응용 프로그램을 평가하는 현재 시험관 모델은 심각하게 제한됩니다. 제시된 안 플랫폼은 생리적 눈물 흐름, 눈물 양, 공기 노출과 기계적 마모를 시뮬레이션합니다. 이 시스템은 매우 다목적이고 CL에서 분석하여 시험 관내에서 다양한 적용 할 수있다.

초록

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,^1-6 which fail to mimic physiological tear volumes.⁷ The traditional model also lacks the natural tear flow component and the blinking reflex, both of which are defining factors of the ocular environment. The development of a novel model is described in this study, which consists of a unique 2-piece design, eyeball and eyelid piece, capable of mimicking physiological tear volume. The models are created from 3-D printed molds (Polytetrafluoroethylene or Teflon molds), which can be used to generate eye models from various polymers, such as polydimethylsiloxane (PDMS) and agar. Further modifications to the eye pieces, such as the integration of an explanted human or animal cornea or human corneal construct, will permit for more complex in vitro ocular studies. A commercial microfluidic syringe pump is integrated with the platform to emulate physiological tear secretion. Air exposure and mechanical wear are achieved using two mechanical actuators, of which one moves the eyelid piece laterally, and the other moves the eyeballeyepiece circularly. The model has been used to evaluate CLs for drug delivery and deposition of tear components on CLs.

서문

콘택트 렌즈 (CL) 내의 관심 분야의 두 가지 중요한 부분이 불편 CL 및 신규 애플리케이션의 개발을 포함한다. CL의 불편 함을 기본 메커니즘을 해명하는 것은 수십 년 동안 필드를 회피 한 문제입니다. ⁸ 소설의 개발은 이러한 약물 전달 장치 ^1,3,9 및 바이오 센서 등의 기능 CL에서, ^{10-12 성장} 관심의 영역입니다, 상당한 잠재 시장과. 두 경우에, 시험 관내 모델에서 정교한는 개발 단계에서 렌즈 재료 및 디자인 특성 적절한 선택을 지원하기 위해 적절한 정보를 제공 할 것이다. 불행하게도, CL에서 다른 눈 관련 응용 프로그램을 평가하기위한 시험 관내 모델에 전류가 상대적으로 원유와 단순한입니다. 전통적으로, 눈물 성막 또는 약물 전달을 평가하는 시험 관내 연구 CL은 고정 된 부피의 유체를 포함하는 정적 대량 튜브에서 수행되는 GREATLY 생리 양을 초과합니다. 또한,이 단순한 모델은 천연 눈물 흐름 성분과 안구 환경 인자를 정의하는 둘 점멸 반사를 없다.

정교한, 생리 학적으로 중요한 눈 "모델"의 개발은 멀티 - 징계 접근 방식을 필요로하고 생체 검증에 상당한 필요합니다. 이러한 이유로, 우리의 생체 외 눈 모델에 대한 기본 골격 모델이 차후의 업그레이드 및 변조를 통해 개선 될 수있는, 범용성이 높은 것이다. 최신 모델은 눈물 양, 눈물 흐름의 기계적 마모 및 대기에의 노출을 시뮬레이션 할 수있다. 목표는 생체 내 및 생체 관측에 예측하고 무료로 의미있는 결과를 제공 할 것 체외 모델을 만드는 것입니다.

프로토콜

모든 실험은 대학의 워털루의 동물 연구 윤리위원회에 의해 설명 된 모든 관련 지침에 따라 준수에 완료되었다. 소 눈이 넉넉한 지역 도살장에서 기증된다.

1. 아이 모델

1. 설계 및 금형 ^(13)의 제조
   1. 인간의 성인 눈의 평균 생리 학적 차원에 따라 눈 모델을 디자인합니다. ⁽¹³⁾
   2. 안구와 눈 모델의 눈꺼풀 조각 사이에 250 ㎛의 간격을 둡니다. 컴퓨터 지원 설계 (CAD) 소프트웨어를 사용하여 각 금형을 설계한다.
   3. 의 AutoCAD 또는 솔리드 웍스의 새로운 .cad 파일 또는 .sldprt 파일을 만듭니다. 인간의 안구 / 눈꺼풀의 3D 모델을 생성합니다. 모델의 금형을 만들고 .STL 파일로 금형을 저장합니다.
   4. 3D 프린터 소프트웨어로 가져 오기 .STL 파일 (replicator2에 대한 예를 들어, makeware). 인쇄의 매개 변수 (위치, 희소성, 크기, 방향, 부드러움 등을 지정 ) ^13.
   5. 3D 프린터는 읽기위한 G 코드 파일로 파일을 저장합니다. 이러한 PLA (폴리 락트산), ABS (아크릴로 니트릴 부타디엔 스티렌), PC (폴리 카보네이트), 또는 이들의 조합으로서 선택 물질은 몰드 ^(13)를 인쇄한다.
   6. 선택의 재료의 원하는 필라멘트를 설치합니다. 읽을 수있는 3D 프린터에 G 코드 파일을 가져옵니다. 금형을 인쇄합니다.
      주 : 눈 모델에 매끄러운 표면이 요구되는 경우 또는, (CNC) 머신을 제어하는​​ 컴퓨터의 수치를 이용하여 눈 금형을 생산한다. CNC 몰드 생산 용 금형 재료가 더 이상 열적 플라스틱에 한정되지 않지만, 금속, 세라믹, 폴리 테트라 플루오로 에틸렌과 같은 화학적 저항성 중합체로 연장된다.
   7. 절단 드릴에 연결되어있는 CNC 소프트웨어 인터페이스를 엽니 다. 전면, 상단, 측면 및 제어 소프트웨어 인터페이스에서 이전에 건설 안구 / 눈꺼풀 모델 금형의 사시도에 따라 3D 금형을 구축합니다. 에 적합한 매개 변수를 선택가공 (비트 크기, 기판 소재, 재료 두께) 금형을 잘라 진행합니다.
2. PDMS를 사용하여 접안 렌즈의 합성
   1. 주사기를 사용하여, PDMS (폴리 디메틸 실록산) 염기 10 ml의 부피를 측정하고, 15 내지 50 mL의 원심 분리 튜브로 채운다. PDMS의 총 중량 엘라스토머 솔루션의 V / w는 10 %를 추가합니다. 교반 막대를 사용하여 용액 잘 섞는다.
   2. 안구 및 눈꺼풀 금형에 PDMS 솔루션을 따르십시오. PDMS의 RT는 O / N에 정착 할 수 있도록 (또는 적어도 12 시간)하여 중합을 시작하고, 기포가 중합체로부터 분해 할 수 있도록.
      참고 : 상승 또는 확장 할 수있는 PDMS에 남아있는 기포가 없는지 확인합니다.
   3. 그 후, 1 시간, 5 분 동안 150 ° C (302 ° F)의 75 ° C (167 ° F) 오븐에 금형을 넣어. 부드러운 젤의 경우, PDMS이 완전히 중합 적어도 48 시간 동안 실온에서 앉아 보자.
   4. 몇 분 동안 냉동실에 샘플을 넣어; 이는 PDMS를 축소하고 단순화몰드로부터 표본을 제거. 얇은 주걱을 사용하여 금형의 접안 렌즈의 압축을 풉니 다.
   5. 안구 및 눈꺼풀 편 사이의 공간에 용액을 전달하기 위해, 1/16 "동일 다리 결합기 튜브 커넥터 1/16"X 1/8 "폴리 테트라 플루오로 에틸렌 튜브를 연결하고 튜브 구멍의 눈꺼풀 피스에 부착 .
3. 아가로 오스를 사용하여 안구 조각의 합성
   주 : 안구 조각을 아가 로스 등의 다른 중합체를 사용하여 합성 할 수있다. 다음 절차는 또한 PDA (포테이​​토 덱 스트로스 배지) 또는 SDA (사부로 포도당 한천)로서 한천 유형의 다양한 눈 조각을 생산하도록 변형시킬 수있다.
   1. 2 % (2 ㎍ / 100 ㎖) 겔 측정 아가 2 g의 생성 및 초순수 100 ㎖와 혼합한다. 아가로 오스가 완전히 용해되도록 종기 (100 ° C)에 대한 해결책을 가져옵니다. 용액을 5 분 동안 식히십시오.
   2. 안구 금형에 솔루션을 붓고 솔루션은 3 냉각 할 수 있도록RT에서 0 분. 주걱으로 안구 조각을 제거합니다. A의 안구 한천 보관 -20 나중에 사용하기 위해 ° C 냉장고. 미생물학 연구의 경우, 고압 증기 멸균 및 / 또는 자외선 조사에 의한 안구 금형을 소독.
4. PDMS 안구에 소 각막의 설립
   참고 :.이 프로토콜은 Parekh 씨 등에서 적응하고있다 ⁽¹⁴⁾
   1. 층류 후드 무균 조건에서 소 각막 절개 및 혼합을 수행한다. 눈을 취득하고 당일을 해부.
   2. 사용하기 전에 10 분 동안의 흐름 후드를 켜고 70 % 에탄올 알코올로 소독. 모든 자료 및 악기는 273 ° F / 45 분 동안 133 ° C에서 고압 증기 멸균에 의해 멸균하고, 흐름 후드 입구에서 더 이상 4 인치 위치에 있는지 확인합니다.
   3. 2 분 동안 희석 된 포비돈 요오드 용액을 넣은 비커에 소 눈 담근다. 인산염 완충 식염수를 넣은 비커에 눈 린스 (PBS) pH 7.4. 사용 포셉 부드럽게 유리 페트리 접시, 각막면이 위를 향에 눈을 넣습니다.
   4. 무딘 끝 해부 가위로 공막 부착 지점에서 절단하여 과도한 근육과 지방 조직을 제거합니다. 동물 폐기물 지정된 멸균 비이커에 초과 조직을 폐기하십시오.
   5. 마이크로 가위를 사용하여 눈의 결막을 제거합니다. 윤부로부터 최소 1 cm의 거리를 유지, 멸균 거즈로 눈을 감 쌉니다.
   6. 기본 맥락막 및 유리체의 침투를 방지하며 표면으로되도록 메스를 사용하여 약 2mm 윤부 영역으로부터 공막 절개. 조심스럽게 자연 곡률에서 각막을 변형없이 메스 또는 해부 가위를 사용하여 360 °로 절개를 확장합니다.
   7. 미세 집게로, 눈의 각막을 제거합니다. 집게를 사용하여 조심스럽게 부착 포도막 조직을 제거하고 PBS로 각막을 씻어.
   8. 문화 멸균 용기에 31ºC에서 각막을 저장매체 (매체 (199)와 같은) 조직의 수분과 영양 세포를 유지하기 위해 3 % 소 태아 혈청을 함유.
   9. 실험에 앞서, PDMS의 안구에 절제 각막 휴식, 그리고 전문 클립 - 온과 함께 두 조각을 고정.

2. 깜박임 플랫폼

1. 깜박임 플랫폼의 설계 및 생산
   주 : 깜박 플랫폼이 세 가지 기능 부분으로 구성되어있다 : 눈 모델 (섹션 1에서 설명), 기어 시스템, 전자 시스템.
   1. 디자인은 눈 모델 (섹션 1.1)에 기술 된 것과 유사한 CAD 및 3D 인쇄를 사용하여 점멸 플랫폼 제조. 는 접안 렌즈의 횡 방향 및 회전 동작에 모터의 회전 간단한 변환되도록 기어 시스템을 설계한다. ¹⁵
   2. 피니언과 기어기구를 이용하여 눈꺼풀 편에 연결된 피니언의 횡 방향 운동에 스테핑 모터의 회전 운동을 변환.
   3. 사용공액 기어에있어서, 세 개의 다른 안구 피스 세 개 (또는 그 이상)의 회전 운동에 스테퍼 모터의 하나의 회전 운동을 증폭한다.
   4. 둘 사이의 거리가 일정하게되도록, 두 기어 시스템 눈꺼풀 용 및 안구에 대한 하나의 정렬. 마이크로 모터 차폐, 2 개의 모터를 전자 시스템을 조립한다.
      참고 : 깜박이는 운동으로 기어 시스템에 의해 번역됩니다 회전 모터를 제공하는 두 개의 스테퍼 모터를 사용합니다.
   5. 마이크로 컨트롤러에 적층 모터 방패로 구성된 시스템에 두 개의 스테퍼 모터를 연결합니다. 연결 및 오픈 소스 소프트웨어 제품과 함께 작동하는 전자 부품을 구성합니다.
   6. 분당 발사 속도 (RPM), 전방 발사 수, 후방 발사 수 및 회전 스타일 같은 모터 파라미터를 제어하도록 시스템을 프로그램.
      참고 : 자세한 내용은 보충 "아두 이노 코드 파일"을 참조하십시오.
   7. 석사에서 시스템 소프트웨어를 다운로드제조 업체들이 적시 한 '웹 사이트.
   8. 소프트웨어를 설치하고 엽니 다. 원하는 구성에 스텝 모터를 제어하는​​ 코드를 작성한다. 연구자에 의해 정의 된 모터가 원하는 방식으로 이동할 수 있도록 전자 시스템에 전원을 공급하는 공급원과 시스템을 연결한다.
      참고 : 추가 "아두 이노 코드 파일"을 참조하십시오.
2. 미세 유체와 어셈블리 (인공 눈물 솔루션)
   1. 합성 안구와 눈꺼풀 조각을 타고 눈 모델에 대한 해당 클립 기능에 그들을 미끄러. 눈꺼풀 조각 (섹션 1.2.5)과 미세 유체 펌프에 주사기와 결합하고 위치 튜브를 연결합니다. 테스트 플랫폼을 실행하고 일관된 움직임을 확인합니다.
   2. 프라임 튜브와 인공 눈물 액 (ATS)의 꾸준한 흐름을 확인합니다. ATS에 대한 레시피는 이전에보고 된 바있다. ⁽¹⁶⁾
   3. 수동으로 평평한 평면 함께 눈 모델 부품을 이동하도록 상기 안구와 시선뚜껑 접촉하고있다. 원하는 값으로 미세 유체 펌프의 유량을 설정한다. 1.5 μL / 분에 생리 흐름 속도를 설정합니다. ⁽¹⁷⁾
   4. 실험을 시작하기 위해 펌프와 액추에이터를 시작합니다. 약물 전달 실험을 위해, 안구 부분에 약물 함유 콘택트 렌즈를 배치했다.
   5. 플로우를 통해 유체가 12 웰 플레이트에 똑 수 있습니다. 원하는 설정된 시간 간격, 예컨대 UV-비스 분광법이나 형광 검출 등의 일반적인 방법을 사용하여 분석 물 또는 약물 농도를 정량화. ^1,4,18을
   6. 콘택트 렌즈에 눈물 성분의 침착을 평가하는 연구를 들면, "안구"조각에 콘택트 렌즈를 배치합니다. 버려 질 수있는 관류 액을 모은다.
   7. 원하는 시간 간격 후에 안구 부분에서 콘택트 렌즈를 제거하고 같은 초점 현미경으로 추가 분석을 위해 렌즈를 준비한다.

결과

기계 숍에서 3-D 인쇄에서 얻어진 합성 눈 금형은도 1에 나타내었다. 이들 주형은 원하는 특성으로 접안 렌즈를 생산하기 위해, 아가 로스 PDMS와 같은 중합체의 다양한 이용 될 수있다. 미세 유체 주사기 펌프로 눈 모델 플랫폼의 손짓 조립체는도 2에 도시된다.이 플랫폼과 눈꺼풀 피스의 움직임 아웃 횡 통해 안구 부재의 회전, 대기에의 노출을 통?...

토론

거기에 특별한주의를 필요로하는 프로토콜 내에서 세 가지 중요한 단계는 다음과 같습니다 설계 및 금형 생산 (섹션 1.1), 플랫폼 어셈블리 (제 2.2.1-2.2.3)을하고, 실험 실행을 감시 (제 2.2.4-2.2.7 ). 설계 및 금형 (1.1 절)의 제조의 측면에서, 안구 부분은 인간 각막의 크기에 따라 설계되어야한다. 그러나, 완벽한 시판 콘택트 렌즈 (CL)에 맞는 생성 될 수있는 안구 편 전에 몰드의 복수의 원형을 요구할 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arduino Uno R3 (Atmega328 - assembled)	Adafruit	50	Board
Stepper motor	Adafruit	324	Motor and Motor shield
Equal Leg Coupler 1.6mm 1/16"	VWR	CA11009-280	50 pcs of tube connector
Tubing PT/SIL 1/16"x1/8"	VWR	16211-316	Case of 50feet
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation
Agarose, Type 1-A, low EEO	Sigma-Aldrich	A0169-25G
PHD UltraTM	Harvard Apparatus	703006	MicroFluidic Pump
Bovine cornea	Cargill, Guelph/ON
Soldidworks	Dassault Systemes		Software
3-D printing	University of Waterloo - 3D Print Centre
Dissection tools	Fine Science Tools		General dissection tools
Medium 199	Sigma-Aldrich		Culture medium storage for cornea
Fetal bovine serum	Thermo Fisher		Add to culture medium, 3% total volume