개별 세포 유형의 전사 프로파일 링을위한 도구로 레이저를 이용한 이외에 Microdissection (LAM)

요약

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

초록

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

서문

조직 수준에서 수행 전사 연구에서 매우 전문화하지만 희귀 세포 유형의 전 사체는 종종 더 풍부 주변 세포에 의해 마스크된다. 이러한 고도로 전문화 된 세포 유형에 대한 예는 식물에서 여성의 생식 계통 (생식 세포)의 세포이다. 여성 생식 계열은 꽃 ^{1, 2의} gynoecium 내부 개발 난자 내 씨의 전구체를 지정합니다. megaspore 모 세포 (MMC)는 여성 생식계의 첫번째 셀이다. 그것은 감​​소 megaspores의 테트라을 형성하는 감수 분열을 거친다. syncytium에, 즉, 일반적으로 이러한 megaspores 중 하나만이 살아과 세포질 분열없이 mitotically 나눕니다. 세 antipodals 두 synergid 세포, 난자, 중앙 셀 : 유사 분열이 전형적으로는 네 종류의 세포로 구성된 성숙 배우체를 형성 cellularization 뒤 따른다. 계란과 중앙 세포는 DOU 동안 두 개의 정자 세포에 의해 수정 된 얻을 여성의 생식있다BLE 시비 현상 시드 ^1,2 배아 및 배유을 야기한다. 80 씨앗 밀접한 관련 속 Boechera에 꽃 당 개발 - 약 50 동안 성적 모델 시스템 애기 장대에서 만 ~ 50 씨앗은 꽃마다 개발한다. 따라서 암컷 생식선은 휴대 사양과 분화 발달 과정 등을 연구하는 우수한 모델을 만드는 몇 매우 특별한 종류의 세포로 구성된다.

또한, 식물의 재생을 지배하는 유전자 조절 과정에 대한 통찰력은 응용 가치가있을 수 있습니다. 식물, 씨앗 (무수정 생식)을 통해 모두 성적과 무성 생식가 발생할 수 있습니다. 유성 생식은 인구의 유전 적 다양성을 생성하는 동안, 어머니 공장에 유 전적으로 동일 클론 자손의 형성에 리드를 무수정 생식. 따라서, 무수정 생식은 복잡한 산모의 유전자형이 할 수있는, 농업과 종자 생산에 응용 프로그램에 대한 큰 잠재력을 가지고여러 세대 ^3,4,5를 통해 변경되지 않은 유지 될 수있다. 무수정 생식 자연스럽게 주요 작물에 발생하지 않기 때문에, 작물의 무수정 생식의 공학은 큰 관심의 ^3,4,5이다. 그러나, 이러한 장기 목표 무수정 생식의 근본적인 유전 및 분자 기초는 충분히 상세히 ^6에서 이해되지 않기 때문에 달성하기 어렵다.

레이저를 이용한 미세 절제 (LAM) 및 차세대 시퀀싱 (NGS)를 사용하여 apomictic 재생, 세포 유형 특정 전사 프로파일 링을 지배하는 전사 기준에 대한 통찰력을 확보하는 것은 매우 강력한 방법 ^7,8를 나타냅니다. LAM 먼저 동물과 생물 의학 연구를 위해 설립되었습니다. 지난 몇 년 동안 LAM은 식물학 ^6,9,10 적용되었다. 개별적인 세포 및 조직 유형의 프로파일을 허용하는 다른 방법들과 대조적으로, LAM 마커 라인 ^6,9,10의 생성을 필요로하지 않는다. 따라서, 애플리케이션이 될 수있다이전 분자 지식없이 세포 또는 조직 유형에 거짓말. LAM의 또 다른 장점은 셀이 위치 및 / 또는 구조적 특성에 기초하여 건조 부에서 인식 될 수있는 것이 긴 어떠한 세포 유형에 적용 할 수 있다는 것이다. LAM은 처리 중에 전사 프로파일의 변화를 방지 고정 조직을 사용하는 추가적인 장점을 갖는다.

관심, 예를 들어, 꽃 조직의 조직은, 이전에 파라핀 왁스에 매립 비 가교 고정액에 고정되어있다. 파라핀 왁스에 포함 설립 프로토콜 ^9,11 다음, 수동으로 수행 할 수 있습니다. 그러나, 왁스의 침투와 탈수를위한 자동 조직 프로세서의 사용은 일반적으로 RNA 품질 및 조직 형태의 보전의 관점에서 높은 재현성을 초래한다. 수지 조직을 포함하는 대안의 전략은 성공적 LAM ⁸ 세포 유형 특정한 분석을 위해 사용되어왔다. 그러나, 자동 게이트의 사용많은 샘플 일단 시간의 실질적인 최소 요구 처리 될 수있는 왁스 매립 ated 조직 프로세서는 시간이 매우 효과적이다. RNA의 질 전형적으로 상당한 손실이 고정 및 매립시 발생하는 동안, 마이크로톰 얇은 부분의 제조 및 특히는 LAM에 사용 frameslides에 장착하면 RNA 품질의 보존을위한 중요한 단계 남아있다. 이는 앞서 언급 한 내용 및 테이프 이송 시스템의 이용이 단계 ^(12)에서 더 RNA 품질 결과를 설명 하였다. 그러나,이 슬라이드의 제조시 추가의 시간 소모적 인 단계를 추가하고 또한 특별한 장치를 필요로한다. 설명 최적화 된 프로토콜은 재현성 GeneCHIPs 및 차세대 시퀀싱 (NGS)이 ^{7,11,13,14 접근과} 전사 프로파일에 충분한 품질의 RNA를 생성합니다. 또한, 사용되는 레이저 미세 절제 현미경 단리 세포 유형의 고순도 ROUT은inely은 ^{7,11,13,14을} 생산했다.

속 Boechera는 apomictic 재생의 주요 단계를 공부를위한 훌륭한 모델 시스템입니다. Boechera에서, 상이한 성적 apomictic 가입 나 다양한 식별되고, 비교에 사용될 수 ^{15, 16, 17은} 해석한다. 성적 애기 장대와 apomictic Boechera에서 여성의 배아에서 세포의 세포 유형 별 전 사체의 비교에서, 우리는 이에 ⁷ 무수정 생식에 적용되는 규제 프로세스의 새로운 측면을 식별 차별적으로 발현되는 유전자와 경로를 확인했다. 또한,이 연구는 세포 유형 특이 적 전사 대 LAM의 적합성 작은 ​​희귀 세포 유형의 분석을 확인 하였다. 이미 식물 종의 다양한 상이한 세포 유형의 분석이 프로토콜을 사용하지만, 종 - 상기 프로토콜 조직 - 특이 적 변형은 특정한 경우에 요구 될 수있다.

프로토콜

참고 :이 프로토콜은 조직 준비, 레이저를 이용한 미세 절제하고, 전사 프로파일 링을위한 RNA 추출을 설명합니다. 항상 프로토콜의 모든 단계에 걸쳐 장갑을 사용합니다. 연구 및 사용 된 각 화학 물질에 대한 안전 지침을 고려하십시오. 크 실롤은 유해와 장갑을 관통 할 수 있으며 메탄올은 독성이 있음을 특히 명심하십시오. 사용되는 모든 악기를 들어, 따라서 사용 설명서를 참조하시기 바랍니다.

유리 및 기타 장비에서의 RNAse 활동 1. 제거

1. 사용하기 전에, 종래의 RNAse 무료로 품질을 보장​​하기 위해 180 ℃에서 ~ 8 시간 동안 소성을 알루미늄 호일에있는 유리를 바꿈.
2. 금속 표면 처리 (예를 들어, 핀셋의 쌍)뿐만 아니라 워크 벤치와 적절한의 RNAse 오염 제거 용액을 가열 플레이트. 그 후, 제 염액을 제거의 RNA 분해 효소가없는 물을 가진 표면을 세척한다. 그 후, 70 % EtOH로 추가로 표면을 청소합니다.
3. 모든 플라스틱으로를 사용하여틱 소모품 (예를 들어, 튜브) 아주 새로운 어떤 전처리없이. 가능한 경우, 무료의 RNase하는 인증 플라스틱 소모품을 사용합니다.

2. 조직 고정

1. 농부의 고정액 10 ml의 준비 (3 : 1, v / V를 에탄올 : 아세트산) 얼음에 신선한 15 ML 튜브에. (항상 사용하기 전에 신선한 농부의 정착액을 준비). 다른 비 - 가교 고착성 에탄올 : 아세트산 (5 : 1, V / V) ^(18)를 사용할 수있다.
2. 관심의 발달 단계에 꽃 봉오리를 수집하는 핀셋의 벌금 쌍을 사용합니다. 즉시 얼음처럼 차가운 정착액에 싹 잠수함. ~의 고정을 위해 애기 장대 또는 Boechera 20 싹이나 꽃을 고정액 10 ㎖를 사용하여 참고 :. 그 전에 고정에 작은 조각을 생성하는 면도날과 꽃을 해부하는 것이 좋습니다 큰 꽃과 식물 종을 사용하는 경우.
   1. inflor 3 큰 꽃 봉오리 - 성숙 배우체를 얻기 위해서는,이 무기력수확하기 전에 이일 escence.
3. 얼음과 함께 습기 제거제의 바닥을 채우십시오. 직접 그들이 넘어 질 수없는 방법으로 얼음에 넣어 또는 적절한 홀더를 사용하여, 샘플, 예를 들어, 꽃이 들어있는 튜브를 열고 얼음에 배치합니다. 진공은 진공의 출시에 앞서 15 분 동안 침투.
   1. 15 분 동안 한 번 진공 침투를 반복합니다.
4. 얼음에 진공 저장 하룻밤 (~ 12 시간)을 놓습니다. 뚜껑 또는 알루미늄 호일로 얼음 통을 덮고 해동에서 얼음을 방지하기 위해 4 ° C 형 방이나 냉장고에 양동이를 저장합니다. 참고 : 고정 시간을 연장하지 않는 것이 좋습니다.

3. 조직 임베딩, 얇은 단면 및 LAM을 위해 슬라이드에 장착

1. 조직 삽입.
   1. 순수 에탄올과 RNAse가없는 물로 제조 70 % 에탄올에 정착액을 교환한다. 추가 처리 될 때까지 얼음에 샘플을 남겨주세요. embe 시작샘플 설정된 뒤 같은 날. 어떤 조직 가공 기계를 사용할 수없는 경우, 다른 곳에서 ^{9,11 설명 된대로} 수동 삽입으로 진행 단계 3.1.11를 계속합니다.
   2. 부드럽게 핀셋으로 조직 매립 카세트에 샘플을 옮긴다. 단단히 카세트를 닫습니다. 중요한 단계 :이 단계에서 시료의 경우에도 부분적인 건조를하지 마십시오. 핀셋으로 샘플의 압박하지 마십시오.
      참고 : 이상적으로 카세트의 경사면에 작성하여, 연필을 사용해야 카세트 레이블을 지정하려면.
   3. 모든 재료가 카세트에 전송되고, 내장 시스템이로드 될 때까지 70 % 에탄올의 싹이나 꽃으로로드 삽입 카세트를 저장합니다. 이를 위해, 70 % 에탄올로 채워진 유리 염색 통을 사용한다.
   4. 기계의 증류기에서 티슈 프로세서의 바스켓을 제거하고 상부에 대향하는 경사면과 동일한 방향으로 바구니 매립 카세트 옮긴다. CRI광 케이블 (optical) 단계 : 조직의 건조를 방지하기 위해 신속하게이 작업을 수행합니다. 한 번에 여러 삽입 카세트를 처리 할 경우, 이전에 샘플을로드에 70 % 에탄올로 가득 적절한 RNAse가없는 용기에 바구니를 배치합니다.
   5. 바구니에 뚜껑을 넣고 레토르트에 다시 바구니를 넣어. 레토르트를 닫습니다.
      참고 : 조직 프로세서가 자동으로 샘플을 탈수 크 실롤에 용매를 변경하고, 녹은 파라핀 왁스와 함께 침투 않습니다. 일반적으로이 밤새 이루어집니다.
   6. 조직 프로세서의 프로그램을 시작합니다. 권장 표준 설정이 침투 한 후, 1 시간에 70 % EtOH로 세 번으로 1 시간 90 % EtOH로 세 번, 1 시간 100 % EtOH로 2 배, 1 시간 100 % 크 실롤, 한 번에 1 시간, 실온에서 15 분 100 % 크 실롤있다 두 번 1 시간 56 ° C ^(11)에서 3 시간 동안 한 시간 파라핀 왁스.
      참고 : 차단 스테이션이 녹은 왁스와 준비가되어 있음을 보장하기 위해, 시작하기 전에 몇 시간에 컴퓨터를 켜거나대략의 개시 시간을 선택하기 위해 타이머 기능을 사용한다.
      참고 : 경우 조직은 56 ° C에서 대신 3 시간 56 ° C에서 즉시 이후에 가능 파라핀 왁스에 이상 배양 시간을있다 처리 할 수​​ 없습니다. 기기의 사용 설명서를 참조하십시오. 은 "빈 레토르트"명령이 승인 될 때​​까지 일반적으로 조직과 카세트가 자동으로 녹은 왁스를 유지합니다. 조직 처리를 시작할 때 왁스가 용융하지 않으면, 레토르트 70 % 에탄올로 채워지고 시작할 준비가 될 때까지 프로그램은 보류 상태로 유지.
   7. 레토르트 비우기 즉시 차단 역에서 56 ° C에서 파​​라핀 왁스 목욕에 샘플을 전송합니다. 바구니에서 뚜껑을 제거하고 그 뚜껑 차단 스테이션의 파라핀 욕조 커버.
   8. 바구니에 카세트 있기 때문에 차단 역의 표면에 더미 많은 신선한 균형 트레이는 56 ° C로 가열.
      참고 : 에탄올에 강한 영구 마커를 사용 할 수 있습니다d는 균형 트레이의 바닥에 레이블을합니다. 아세톤에 강한 영구 마커는 권장되지 않습니다.
   9. 차단 스테이션을 사용하여 56 ° C에서 녹은 파라핀 왁스와 함께 미리 예열 신선한 플라스틱 균형 트레이를 입력합니다. 파라핀 조의 뚜껑을 들어 한 번에 하나의 카세트를 픽업하여 핀셋을 사용하여 균형을 트레이 56 ° C에서 유동 파라핀 왁스 카세트로부터 샘플을 옮긴다.
      중요한 단계 : 신속하게 협력하여 카세트를 처리하는 동안 샘플을 둘러싼 왁스의 경화를 피하십시오.
      1. 왁스의 경화 전에 준비 바늘을 사용하여 필요에 따라 모든 샘플을 놓습니다. 일반적으로, 여러 꽃 개별적으로 각 방향으로 약 1cm 간격 균형 트레이에 배치되어있다.
      2. 모든 샘플이 전송 될 때까지 단계를 반복 3.1.9.
   10. 다시 조직 프로세서에 바구니를 놓고 적절한 프로그램을 (사용 설명서 참조)를 사용하여 레토르트를 청소하십시오.
   11. 조직 프로세서와 차단 역을 끕니다. 단계 3.1.13를 계속합니다.
   12. 경우에는 조직 침윤 기계없이 매립 작업대가없고, 56 ℃로 파라핀 왁스를 용융하는 가열로를 사용한다. 벤치에서, 플라스틱 균형 트레이에 녹은 왁스를 작성 왁스로 샘플을 전송하고, 샘플의 위치를​​ 준비 바늘을 사용합니다.
   13. 4 ° C에서 샘플을 저장하기 전에 3 시간 - 파라핀 왁스 ~ 1 상온에서 경화 할 수 있습니다. 샘플은이어서 신선 가공 또는 수 개월까지 저장할 수있다.
2. LAM 얇은 섹션과 슬라이드의 준비.
   1. 아래에서 왁스 블록을 조명 라이트 테이블에, 주변의 플라스틱 트레이에서 샘플 파라핀 왁스를 제거합니다. 상기 조직을 함유하는 왁스 제곱 블록 해부 예., RN 아제 (RNase) 자유 면도날을 사용하여 또는 꽃 봉오리. 이를 위해, 항상 왁스 블록의 상단을 향해 샘플의 방향 (또한 참조 그림 1).
      1. 한번에 LAM 사용해야 모든 시료의 왁스 블록을 준비한다.
   2. 강화 된 파라핀 왁스로 가득 카세트를 포함 처리 할 블록을 탑재 : 에탄올 램프를 사용하여 적절한 주걱의 끝 부분에 작은 조각 또는 파라핀 왁스의 방울을 녹여 포함 된 조직으로 (지원에 블록을 해결하기 위해 뜨거운 왁스를 사용 위쪽).
      1. 왁스는 4 ° C에서 적어도 20 분 동안 경화 할 수 있습니다.
   3. 빛 테이블에 면도날로 샘플을 둘러싼 과잉 왁스를 제거합니다. 병렬 가장자리 (그림 1 참조) 사각 표면을 유지해야합니다.
   4. 42 ° C까지 가열 플레이트를 설정합니다.
   5. 안전하게 마이크로톰에 샘플을 탑재하고 6 준비 - 10 μm의 두께 섹션. 마이크로톰을 사용하여 제조업체의 지침을 참조하십시오. 참고 : 얇은 섹션은 종종 더 나은 구조 해상도, highe의 RNA의 큰 금액을 줄 것이다 동안R 품질 두꺼운 부분으로 얻을 수있다. Boechera의 세포가 배우체 성숙한 위해 우리는 기본으로 7 μm의를 사용합니다. 마이크로톰 나이프를 통해 샘플 오히려 천천히 이동하면 종종 더 나은 조직 학적 결과.
   6. LAM 슬라이드에서 그들을 배치하기 전에 바닥에 검은 종이와 플라스틱 상자에 15cm - 항상 약 10의 길이에 파라핀 리본을 전송합니다.
   7. 가능하면 해부 스코프 하에서, 예를 들어 관심의 세포 - 또는 조직 유형, 난자를 함유하는 파라핀 스트립의 부분을 사전에 선택하고 나머지를 버린다.
3. LAM의 슬라이드 준비.
   1. 가열 접시 위에 평평한 표면 - 금속 프레임 슬라이드의 필요한 양 (10 일반적으로 5)을 놓습니다.
   2. 피펫 1 ~ - 슬라이드의 플라스틱 부품에 RNAse가없는 물 2 ㎖. 플라스틱 윈도우에 걸쳐 충분한 길이 5cm - 면도날을 사용하여, 약 4의 짧은 조각 파라핀 리본 잘랐다. 유핀셋 이상적 파라핀 스트립 슬라이드 플라스틱 창에 서로 평행하게 배치하는 준비 SE는 바늘. 조심스럽게 물을 제거하고 다시 슬라이드를 배치 한 끝에 슬라이드를 올립니다.
      1. 대안 적으로, 화학적 후드 가열판 장소. 표면을 습윤하기에 충분한 슬라이드의 플라스틱 부품의 메탄올 소량 적용 (이 슬라이드의 약간의 주름이 발생할 수있다). 슬라이드에 파라핀 스트립을 놓습니다.
         참고 : 가능하면 독성의 이유로, 메탄올의 사용을 피하십시오. 그러나,이 단계에서 메탄올의 사용은 물에 장착함으로써 달성 품질이 충분하지 않은 경우에, RNA의 질을 개선한다. 달성 RNA 품질 조사에서 세포 유형과 종류에 따라 변화로는, 새로운 프로젝트의 시작이 대안을 테스트 할 가치가있다.
   3. ~ 12 시간 동안 42 ° C에서 하룻밤 가열 접시에 슬라이드를 건조시킵니다. 와 가열판 커버슬라이드를 만지지 않는 플라스틱 뚜껑. 플라스틱 뚜껑은 공기의 교환을 방해하지 않도록하십시오. 이 뚜껑은 목표 피펫 박스 또는 유사한 배치 될 수있는 해제한다.
      1. 대안 적으로, 2 시간의 최소 또는 조직이 완전히 건조 나타날 때까지의 건조 시간을 줄인다. 콜렉션 시간 슬라이싱에서의 감소는 RNA의 품질을 향상시킬 수있다.
   4. 화학 후드에서, 탈 왁스 슬라이드에게 적절한 슬라이드 홀더를 사용하여 크 실롤에서 10 분 동안 2 회. 완전히 건조 된 상태로 유지되며 금속 프레임의 넓은 끝을 터치하여 슬라이드를 제거 할 수 있습니다 만 그러나 각 슬라이드의 플라스틱 부품 잠수함해야합니다.
   5. 슬라이드가 LAM 이전에 화학 후드 ~ 10 분을 건조하도록 허용합니다.
      참고 : 즉시 처리하지 슬라이드 조직이 몇 시간까지 가입 향 42 ° C에서 다시 가열 접시에 배치 할 수 있습니다. 이는 추가 처리 될 때까지 RNA의 품질을 손상시키지 어떠한 습기를 방지한다.

4. 레이저를 이용한 이외에 Microdissection (LAM)

참고 : LAM에 대한 절차는 사용하는 기기에 따라 달라집니다. 이 프로토콜의 특정 세부 사항은 특정 악기와 정전기력의 모자를 만드는 사용에 대한 샘플을 수집하는 기술에 적용된다. 또한, 세부 사항은 심지어 소프트웨어의 다른 버전 사이에 다를 수 있습니다. 자세한 설명과 장비 및 소프트웨어에 대한 특정 지침은 제조업체의 지침과 사용자 핸드북을 참조하십시오.

1. LAM (컴​​퓨터, 현미경, 레이저 제어 상자)에 대한 장치에서 전환합니다.
2. 현미경과 레이저를 조종 프로그램을 시작합니다.
3. 컨트롤 박스에 해당하는 버튼을 눌러 레이저를 전환합니다.
4. 캡 홀더에 (디퓨저없이 0.5 ml의) 모자를 놓고 악기에 위치.
5. 현미경 유리 슬라이드와 LAM 슬라이드를 지원합니다. 그 확인과 슬라이드의 평탄면부착 된 조직을 유리 슬라이드에 직면 해있다.
6. 아래에있는 유리 슬라이드와 악기에 슬라이드를 놓습니다.
7. 4 배 목표를 선택합니다. 프로그램에서 "최대"위치로 캡을 이동하고 슬라이드의 스캔을 진행하기 위해 선택합니다.
8. 슬라이드를 통해 검색 및 관심있는 구조를 식별합니다. 정확하게 및 절단 공정의 정확한 위치로 다시 이동할 수 있도록 슬라이드에 자신의 위치를​​ 저장한다.
9. 해당 목적 (예 : 40X 또는 60X)을 선택합니다.
10. 필요한 경우, 레이저 속도, 초점 레이저 전력을 조정하고, 또한 기기의 사용자 매뉴얼을 참조하여 상기 스테이지 이동을 보정. 계정이 관심있는 특정 조직에 대해 설정되면, 설정을 재사용 할 수 있습니다.
11. 이상적으로는 조직없이 막의 일부에, 프로그램의 "레이저 샷"버튼을 누름으로써 하나의 슛 레이저의 위치를​​ 확인한다.
    1. 필요한 경우, 제 따라 레이저의 위치를​​ 보정기기의 전자 제조업체의 지침.
12. 누르면 마우스 오른쪽 버튼을 유지, 모니터의 소프트웨어 윈도우의 네 모서리에 명백한 구조를 이동하여 목적의 교정을 확인합니다. 명백한 구조에 대한 손의 위치가 네 모서리에서 동일한 지 확인합니다. 그렇지 않으면 소프트웨어 설명서 다음 목표를 교정.
13. '아래'위치에있는 캡으로, 세포 유형 또는 관심의 조직, 예를 들면, 계란 셀의 경계를 표시하기 위해 '손으로 펜'도구를 사용합니다. '컷'을 압박하여 레이저와 관심의 세포를 해부하다. 참고 : 종종 요구 절편하는 것은 반복되는 셀의 테두리 전체가 한 번에 절개되지 않은 경우. 이 경우, 자동 표준 단면의 두 반복을 수행하는 소프트웨어를 설정할 것을 추천한다.
14. 뚜껑을 들어 올려 관심의 구조와 다음 저장된 위치로 이동합니다. 단계를 반복 4.13하나의 슬라이드에서 관심의 모든 세포가 수집 될 때까지 절차의 다음 셀 섹션을 해부한다. 확인 캡은 새로운 섹션은 캡의 빈 위치에 붙어있는 방식으로 배치되어 있는지 확인합니다.
    참고 :이 조직의 큰 조각을 분리하는 것이 좋습니다 (예를 들어, 전체 꽃이나 그것의 부분 부분) 신선한 캡에 단일 셀 부분의 분리 후 각 슬라이드에서. 이들은 RNA 품질 관리에 사용될 수있다.
15. 슬라이드를 제거하고 단계 4.4 반복하여 다음 슬라이드를 계속 - 4.14 4.9 및 4.13.
16. 모든 슬라이드에서 관심의 세포 유형까지 단계를 반복 4.15 및 관련 단계는 고립되었다. 참고 : 4 ~보다 오래 수확하지 않는 것이 좋습니다 - 같은 캡에 5 시간.
17. 시각적으로 시료의 불특정 오염을 제외 LAM 후 캡 표면을 검사합니다. 비 해부 조직을 호일로 보호되는 반면, 먼지로 인해 정전 밀착성을 표면에 부착 할 수있다.
    1. 티오 시각적으로, 뚜껑을 검사 장비에서 슬라이드를 제거합니다. '아래'위치에 캡 홀더를 배치하고 4 배 목적으로 표면을 검사합니다.
    2. 먼지의 작은 조각을 볼 수 있습니다 경우, 작은 (2 μL) 피펫 팁을 제거합니다. 또한, 다시 악기의 슬라이드 마운트 슬라이드 (NO 조직)의 자유 부분에 뚜껑을 배치하고 완전히 레이저를 사용하여 오염을 파괴한다.
18. 닫기 모자와 더 사용할 때까지 -80 ° C에서 건조 섹션을 동결. 필요한 경우, 샘플 수 주까지 저장 될 수있다. 그러나이 단계에서 신속하게 진행하는 것이 좋습니다.

5. RNA의 분리 및 품질 관리

주 : RNA는 RNA 소량에 적합한 임의의 방법에 의해 분리 될 수있다. 이 프로토콜에서 RNA 소량 위해 지정된 RNA 분리 키트를 이용하여 설명한다. 제조업체의 지침을 따르십시오.

1. 부착 된 샘플 튜브를 사용캡 직접 또는 -80 ° C에서 제거 후.
   1. 튜브를 열고 조심스럽게 필터 팁을 사용하여 각 튜브의 벽에 추출 버퍼의 11 μl를 피펫. 샘플 사이의 팁을 변경합니다.
   2. 뚜껑을 닫고 튜브의 캡까지 추출 버퍼를 흔들어.
   3. 42 ° C로 예열 가열 오븐에서 아래로 캡으로 튜브를 놓습니다. 제조업체의 지침에 따라 30 분 동안 품어.
2. 열 준비를 위해 제조업체의 지침에 따라 튜브의 하단에있는 추출물을 수집.
   1. 개별적으로 각각의 튜브 / 캡 5.1.2 - 하나 이상의 캡의 재료가 하나의 샘플로 결합해야하는 경우, 단계 5.1.1를 진행합니다.
   2. (제조업체의 지침 참조) 그 후, 하나의 튜브에서 하나의 샘플의 추출을 풀과의 EtOH의 동등한 양을 첨가하기 전에 피펫으로 풀 추출물의 양을 측정한다.
   3. 확인이 잇의 양OH 열을로드하면 풀 추출물의 부피와 동일하기 전에 추가했다.
   4. EtOH로 RNA 침전 후, 제조업체의 지침에 따라 열 부하에 신속하게 진행합니다. 100 XG에 원심 분리 단계와 프로토콜을 계속합니다.
   5. 각각의 수집 튜브의 내용을 컬럼에 통과 한 후, 플로우 스루 다음 제조사의 지시 사항을 제거하는 30 초 동안 16,000 × g으로 원심 분리 공정을 수행한다.
   6. 제조업체의 지침에 따라 RNA 추출 및 정제를 계속합니다.
   7. 컬럼에 용출 버퍼의 로딩 후 열이 1 분 동안 품어 할 수 있습니다. 제조업체의 지침의 지침에 따라 원심 분리기에 튜브를로드하기 위해 계속합니다. 주 : 앞서 용출 100 XG에서 1 분 동안 원심 분리 추가적인 단계 용출의 효율을 높일 수있는 프로토콜에 나타낸 바와 같이.
3. 계속에서 RNA를 추출단계이 프로토콜의 5.2.7 5.1 다음 RNA 품질 관리에 대한 rols (큰 조직 섹션).
4. RNA 품질 관리 부하 1 μL 제조업체의 설명서에 따라 RNA 피코 칩을 사용하여 Bioanalyzer에 각 컨트롤 샘플의 희석 총 RNA.
   주 : 추출 된 RNA는 선형 증폭과 마이크로 어레이 또는 RNA-SEQ ^{7,11,13,14을} 이용하여 전 사체 분석을 위해 사용될 수있다. 이상적으로, 품질 관리는 공급 업체의 수를 증폭에 적합한 키트를 제공 적어도 7의 RNA 무결성 번호 (RIN)을 적절한 예는 ^9에 제시되어 표시해야합니다.

결과

샘플 준비 및 LAM은 연속 단계에서 완료

연속적인 단계들의 수는 LAM (도 1)에 의해 선택된 세포 유형에서 전사 분석을 위해 RNA를 준비해야한다. 이 RNA의 인구는 수확 후 변경되지 않도록 꽃과 즉시 고정의 수확을 시작합니다. 조직은 임베디드 구분, 슬라이드에 장착된다. 이 LAM에 의해 세포 하나 또는 ?...

토론

의정서는 다른 세포와 조직에 적합하다

사체와 함께 LAM은 마이크로 어레이 또는으로 분석 RNA-서열은 개발 또는 생리 학적 과정 ^{7-11,13,14을 조절하는} 유전자 활동의 특정 패턴에 대한 통찰력을 얻을 수있는 유용한 도구입니다. 그러나, 특정 세포 타입에 대해,이 방법의 적합성 구조적 문제에 비판적으로 의존한다. 셀은 명확하게 볼 수 있고 LAM에 사용되는 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol	VWR	1,009,861,000	absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP
15 ml falcon centrifuge tubes	VWR	62406-200
2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939AA
Acetic Acid	Applichem	A3686,2500	100% Molecular biology grade
Ambion Nuclease free water	life technologies	AM9932
ASP200 S	Leica	14048043624	tissue processor
black cardboard			can be purchased in special paper shops
DNA- and RNAse-free Frame Slides	Micro Dissect GmbH		1, 4 µm PET-membrane; can also be purchased from Leica
Dumond Forceps	Actimed	0208-5SPSF-PS
ethanol lamp
exsiccator	Sigma-Aldrich	Z354074-1EA	Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment
filter tips 10 µl	Axon Lab AG	AL60010	can be replaced by similar tips
filter tips 1,000 µl	Axon Lab AG	AL60010	can be replaced by similar tips
filter tips 20 µl	Axon Lab AG	AL60020	can be replaced by similar tips
filter tips 200 µl	Axon Lab AG	AL60200	can be replaced by similar tips
forceps precision	VWE	232-1221
glass slide holder	Huber & Co.AG	10.0540.01	Färbekästen nach Hellendahl
glass staining trough	Huber & Co.AG	10.0570.01	Färbekasten
Heated Paraffin Embedding Module Leica	Leica	Leica EG 1150 H	blocking station, similar devises are suitable
Heating and Drying Table	Medax	15501	other models and/or suppliers are suitable
ice bucket	VWR ice bucket with lid	10146-184	similar buckets equally suitable
light table	UVP An Analytical Jena Company	TW-26	white light transluminator
microscope slide	Thermo Scientific	10143562CE	cut edges
microtome blade	Thermo Scientific	FEAHS35	S35 microtome blade disposable
MMI Cell Cut Plus Instrument	MMI (Molecular Machines and Industries)
Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2 ml	life technologies	AM12475
Paraplast X-TRA	Roth	X882.2	for histology
PicoPure RNA Isolation Kit	life technologies	KIT0204	Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit
plastic balancing trays	Semadeni AG	2513
plastic box	Semadeni AG	2971	Plastikdose PS
plastic lid for heating plate			homemade
preparation needle	VWR	631-7159
RNA 6000 Pico Kit	Agilent	5067-1513
RNAse free microfuge tubes	life technologies	AM12400
RNAse ZAP Decontamination Solution	life technologies	AM9780
Semi-automated Rotary Microtome	Leica	RM2245	similar devices are equally suitable
Tissue Loc Histo Screen Cassettes	Thermo Scientific	C-1000_AQ	similar cassettes of other suppliers are suitable
Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 µl	MMI (Molecular Machines and Industries)	50204
Xylol (Isomere) ROTIPURAN	VWR	4436.2	min. 99%, p.a., ACS, ISO SP
process embedding cassettes	Leica	14039440000	Leica Jet Cassette I without lid
Universal Oven	Memmert	UF55	other models and/or suppliers are suitable