의 조기 기아 응답에 Coronin (A)의 기능 조사<em&gt; Dictyostelium의 discoideum</em&gt; 집계 분석 실험에 의해

요약

The social amoeba Dictyostelium discoideum undergoes a developmental transition into a multicellular organism when starved. The evolutionary conserved protein coronin A plays a crucial role in the initiation of development. Using aggregation assays as our main method, we aim to elucidate the role of coronin A in early development.

초록

Dictyostelium의 discoideum의 아메바는 박테리아에 먹이 토양에서 발견된다. 음식 공급원이 부족해질 때, 그들은 단일 세포 집계 센터 ^1-4 향해 chemotax 동안 다세포 개발 프로그램을 시작하는 인자를 분비. 이 과정은 사이 클릭 아데노신 모노 포스페이트 (cAMP) ^(5)의 분리에 의존한다. 캠프는 아데 닐 레이트 사이 클라 제와 포스 포의 공동 작업을 통해 파도에서 생산, 및 G 단백질 결합 된 cAMP 수용체 ^6,7 결합된다. 널리 사용되는 분석은 잠긴 상태에서 ^8,9 세포 응집의 관찰에 기초 하부의 진핵 Dictyostelium discoideum의 개발주기와 관련된 메커니즘을 분석한다. 이 프로토콜은 평형 염 용액 (BSS) ^(10)에 잠긴 조직 배양 플레이트에 기아로 발달주기 coronin A의 역할의 분석을 설명한다. Coronin A는 광범위하게 보존 된 PR의 구성원활동 ^{(11, 12)의} 다양한 연루되어 coronins의 otein 가족.를 coronin 부족한 Dictyostelium 세포는 다세포 응집체를 형성 할 수없는, 이러한 결함은 제안 된 cAMP의 펄스를 공급하여 구출 될 수의 상류 작용 coronin 캠프는 ^{10 계단식.} 이러한 연구에서 설명 된 기술은 캠프 캐스케이드의 상류 Dictyostelium discoideum의 개발주기의 초기 단계에서의 단백질의 기능을 조사하기 위하여 강력한 도구를 제공한다. 따라서이 집계 분석을 이용하여 함수를 coronin의 추가 연구를 허용하고 coronin 생물학에 대한 우리의 이해를 진행할 수있다.

서문

단백질의 coronin 제품군은 높은 진핵 생물에 걸쳐 보존됩니다. 이 단백질은 아미노 말단 트립토판 아스파 테이트 (WD) 반복 함유 카르복시 말단 꼬인 코일 도메인 ^{(13, 14)에} 접속 된 고유 영역 다음 영역 (도 1)의 존재를 특징으로한다. Coronins는 골격 조절 및 신호 전달 ^(12)을 포함한 세포 기능의 다양성에 연루되어왔다. 포유 동물에서, 최대 6 개의 짧은 coronin 분자 (coronin 1-6)뿐만 아니라 7 coronin는 '텐덤', ^{12,15 공동} 발현 될 수있다. Coronin 1은 가장 광범위하게 연구 가족 구성원이며, 병원균 파괴, T 세포 및 신경 세포의 생존 시그널링에 관여하는 것으로 나타났다. 어떻게, 정확히, coronin 1은 이러한 활동을 수행하는 것은 확실하지 않다. 1 coronin하는 ^칼슘 및 캠프 종속 신호뿐만 아니라 F - 굴지으로 세포 골격 변조 ^16-18, 잠재적 인 협력을 조절하는 것으로 나타났다 동안포유 동물에서 최대 7 가족의 -expression는 도전으로 인해 잠재적 중복에, 이러한 시스템에 coronins의 분자 기능을 공부했다. 포유 동물의 생물과는 달리, 낮은 진핵 생물의 Dictyostelium의 discoideum은 분명히 비 중복 기능 ^15,19,20 만이 coronin 가족 (coronin의 A, 포유 동물 coronin 1 coronin B의 ortholog, 포유 동물 coronin 7의 ortholog)을 표현한다. 이 사실은 Dictyostelium의 discoideum에게 coronins의 기능을 연구하는 강력한 모델을 만든다.

Dictyostelium의 discoideum에서 coronin A의 역할을 연구하기 위해, 우리는 ¹⁰ coronin 결여 야생형 세포 또는 세포를 사용하여 평형 염 용액 (BSS) 버퍼를 포함하는 조직 배양 플레이트에 기아로 발달주기를 유도. 우리는 coronin 부족한 세포가 기아에 따라 다세포 집계를 형성 할 수없는 것으로 나타났다. 이 본 표현형의 정확한 정량 평가이 프로토콜에 설명 된 자동화 라이브 세포 이미징은 중요한 도구입니다. 을 coronin 부족한 세포에서 초기 기아 응답의 시작에 결함이 캠프 폭포의 상류 행위를 coronin 것을 제안, 캠프의 펄스를 공급하여 구조 할 수 있습니다. 발전 개시를 시뮬레이트 된 cAMP 펄스 외인성 출원은 과거 ^8,9 여러 실험실에서 이용되고있다. 그러나,이 절차는 세포 밀도 및 타이밍에 크게 의존하는 것으로 알려져있다. 따라서, 여기에 설명 된 프로토콜 재현성의 높은 수준을 보장하기 위해 이러한 가변성을 감소시키는 것을 목적으로한다. 종합하면, 이들 연구에 이용 된 기술은 Dictyostelium의 discoideum의 개발주기의 초기 단계에서의 단백질의 기능을 조사하기 위하여 강력한 도구를 제공하고, 업 식별뿐만 아니라 기능 coronin 하류 이펙터 할 가능성이있다.

프로토콜

1. 시간 경과 현미경에 의해 Dictyostelium의 discoideum의 초기 기아 응답을 관찰한다.
   1. HPO ₄ 5 g의 proteose 펩톤 5 g thiotone의 E 펩톤 10 g 글루코스, 5 g의 효모 추출물, 0.35 _g이 나트륨 : 1 L에 대해 HL-5 매체 (함유의 Erlenmayer 플라스크 DH1.10 세포 또는 CORA 결핍 세포 성장 * 7H ₂ O, 0.35 g의 KH 160 rpm의 회전 진탕 배양기에서 22 ° C에서 ₂ PO _4, 0.05 g의 dihydrostreptomycin - 황산, 산도 6.6). 0.01 × ¹⁰⁶ 세포 / ㎖, 2 × ¹⁰⁶ 세포 / ml 사이의 밀도로 세포를 유지한다.
   2. 수확 로그 단계 성장 DH1.10 셀 ⁽²¹⁾ 또는 22 ° C에서 HL-5 매체와 문화를 흔들어 성장 코라 결핍 셀 DH1.10 배경에서 발생 ^(10)에 의해, 세포 응집을 검사합니다. 이를 위해 400 XG에서 3 분 동안 세포 (통상 10 내지 50 ㎖), 원심 분리기의 적당량을 취하고 BSS (10 mM의 염화나트륨, 10 mM의 KCl을 두 번 세포를 씻어2.5 mM의 _CaCl2를, pH가 6.5).
   3. 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. 계속해서, (5, 10, 20, 40)의 밀도로 접시의 세포를 24- 웰 플레이트에 ¹⁰⁴ 세포 / cm ^{× 2.} 그들이 BSS에서 22 ° C에서 1 시간 동안 부착 할 수 있습니다.
   4. 이미지마다 135 초를 복용, ¹⁰ 전에 설명 된 바와 같이 시간 경과 현미경에 의해 집계를 시각화합니다. 설정 5X 목적과 적절한 소프트웨어에 의해 자동으로 전자 승산 전하 결합 소자 카메라를 구비 한 생균 이미징을 사용하여 (재료 표 참조).
2. 기아 동안 Dictyostelium의 discoideum 세포의 캠프 펄스.
   1. 세포를 수확하여 DH1.10 셀 ²¹ DH1.10 CORA 결핍 셀 ^(10)의 개발에 대한 외부로부터인가 된 cAMP 펄스의 효과를 조사한다. 이렇게하려면 400 XG에 3 분 동안 적절한 세포의 양 (보통 10 ~ 50 ㎖), 원심 분리기를 가지고 BSS에 두 번 씻는다.
   2. COUBSS에서 1 × ¹⁰⁷ 세포 / ml의 농도로 세포를 혈구를 사용하여 재현 탁 NT 세포. 펄스를 적용하기 전에 2 시간 동안 22 ° C에서 배양 (160 rpm으로)를 흔들어. 타이머 제어 연동 펌프를 사용하여 캠프 펄스를 추가합니다. 5 시간에 걸쳐 5 초 펄스 50 nM의 캠프 (최종 농도) 15 μL 매 6.5 분을 제공하는 펌프를 프로그래밍.
   3. 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. 계속해서, (5, 10, 20, 40)의 밀도로 세포를 플레이트를 24- 웰 플레이트에 ¹⁰⁴ 세포 / cm ^{× 2.} BSS에서 1 시간 동안 부착 할 수 있습니다.
   4. 5 배 목표를 사용하여 밝은 필드 현미경으로 22 ° C에서 16 시간 후 집계를 시각화합니다.
3. 에어컨 매체에 노출을 통해 Dictyostelium discoideum 개발 유도.
   1. ⁽²²⁾ 한 바와 같이 신선한 컨디셔닝 매체를 준비합니다. 숭배를 흔들어에서 로그 상 DH1.10 세포 ²¹ DH1.10 코라 결핍 셀 ^(10)를 수집400 XG에서 3 분 동안 피펫, 원심 분리기를 이용하여 22 ° C에서 HL-5 매체와 URES 및 PBM에서 세포를 세 번 씻어 (0.02 M 인산 칼륨, 10 μM 염화칼슘 _2, 1 ㎜의 MgCl _2, pH를 6.1).
   2. 혈구를 사용하여 세포를 카운트 ml의 1 × 10 ⁷ 세포 /의 밀도로 PBM에서 다음을 재현 탁하고 110 회전 / 22 ° C에서 20 시간 동안 흔들어.
   3. 3 분 동안 400 × g에서 원심 분리 후 조정 배지를 수집하고 4 ℃에서 15 분 동안 8,000 × g에서 원심 분리하여 명확히.
   4. 0.45 μm의 필터를 통해 필터 에어컨 매체 (재료 표 참조) PBM에서 배를 희석.
   5. (5, 10, 20, 40)의 밀도 혈구 접시를 사용하여 세포를 카운트 24- 웰 플레이트에 ¹⁰⁴ 세포 / cm ^{× 2.} 그들이 22 ° C에서 1 시간 동안 부착 할 수 있습니다.
   6. 이전에 제조 된 배지로 교환 세포 상등액.
   7. 집계 a를 시각화5 배 목표를 사용하여 밝은 필드 현미경에 의한 따고 16 시간.

결과

초기 개발에 쇼에게 결함을 coronin 결핍 세포 (그림 2). 세포 coronin의 부재 Dictyostelium의 discoideum의 발달주기 동안의 초기 단계 다세포 응집체를 형성 할 수 없다. 따라서, coronin A는 초기 기아 응답 및 / 또는 캠프 신호 동안 역할을 나타납니다. 실제로 coronin A의 부재 하에서 다세포 골재 형성의 결여는 감소 캠프 ^{10 시그널링을} 수반한다. 그러나, 외?...

토론

coronin 단백질은 진핵 계통 군의 대부분 분류군에서 발견된다. Dictyostelium의 discoideum의 coronin A는 포유류 coronin (1)의 동체는 세포 초기 발달 동안 응집 중심을 형성 할 수없는 A-결핍을 coronin 때문에, 초기 기아 반응에 관여 사이클 ^10. 정량적으로 정확하게 균주 개발 사이의 지연을 평가할 수 있도록, 자동 스테이지 컨트롤러 현미경 생균 촬상 설정 필수적인 도구이다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
HL-5 media (for 1 L: 5 g proteose peptone, 5 g thiotone E peptone, 10 g glucose, 5 g yeast extract, 0.35 g Na2HPO4*2H2O, 0.35 g KH2PO4, 0.05 g dihydrostreptomycin-sulfate, pH 6.6)
Proteose peptone	BD Bioscience	211693
Thiotone E peptone	BD Bioscience	211684
Yeast extract	BD Bioscience	212750
Glucose	AppliChem	A3666
Na2HPO4*2H2O	Fluka	71643
KH2PO4	AppliChem	A1043
dihydrostreptomycin-sulfate	Sigma-Aldrich	D1954000
PBM (0.02 M potassium phosphate, 10 μM CaCl2, and l mM MgCl2, pH 6.1)			self made
BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, pH 6.5)			self made
0.45-μm Filtropure S filter	Sarstedt	83.1826
Falcon 24-well Tissue culture plate	Fisher Scientific	08-772-1H
Cellobserver microscope	Zeiss		custom built
AxioVision software	Zeiss
IPC Microprocessor–controlled dispensing pump	ISMATEC	ISM 931
Axiovert 135M microscope	Zeiss	491237-0001-000
Incubation Shaker	Inforst HT Minitron