종양 미세 환경에서 실시간 다세포 역학의 확장 시간 경과 생체 내에 영상

요약

이 프로토콜은 단일 셀 해상도 생체 내에서 실시간으로 상호 작용 다세포 장시간 경과 이미징을 수행하는 다 광자 현미경의 사용을 설명한다.

초록

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

서문

차 유방 종양에서 종양 세포의 보급은 대 식세포 및 혈관 내피 세포를 포함하는 기질 세포뿐만 아니라 종양 세포를 포함하지만, 호스팅하는 것으로 나타났다. 또한, 종양 혈관 투과성 증대 ¹ 이상이다. 따라서, 종양 세포, 대 식세포 및 내피 세포가 일차 종양 미세 혈관 투과성 및 종양 세포 intravasation을 중재 상호 작용하는 방법을 결정하는 단계 이해 전이에 중요하다. 혈관 투과성, 종양 세포 intravasation 종양 미세 환경에 다세포 상호 작용의 기본 신호 메커니즘의 동역학을 이해하는 항암 치료제의 개발 및 관리에 중요한 정보를 제공 할 수있다.

생체 내에서 종양 혈관 투과성 연구의 주요 수단은 에반스 블루 ^2, 고 분자량의 덱스 트란 (155 kDa의) 혈관 외 염료로 측정했다염료의 주입 후 일정한 시간 점 ^(3)과 형광 또는 (알부민을 포함) 추적자 공역 단백질 ^4. 현미경의 발전은, 동물 모델 및 형광 염료는 생체 내에 현미경 ^(5)를 통해 세포 과정과 살아있는 동물의 혈관 투과성의 시각화를 사용할 수있다.

여러 시점에 걸쳐 정적 인 이미지, 또는 짧은 시간 경과 시퀀스의 인수와 라이브 동물 이미징은 종양 미세 환경 ^6,7 동적 이벤트의 완전한 이해를 허용하지 않습니다. 실제로, 24 시간의 과정을 통해 정적 이미지 획득은 종양 혈관 그러나 혈관 투과성의 역학은 ⁶ 관찰되지 않았다 새는 것을 보여 주었다. 따라서 12 시간까지 연장 된 연속 시간 경과 영상은 종양 미세 환경에서 동적 이벤트의 반응 속도를 캡처합니다.

이 프로토콜은 확장 된 시간 경과 multiphot의 사용을 설명합니다생체 내에 현미경에 종양 미세 환경에서 동적 다세포 이벤트를 공부합니다. 종양 미세 환경의 여러 세포 유형은 주사 염료 또는 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 동물을 사용하여 표시되어 있습니다. 혈관 염료 또는 단백질 촬상 개시 후 주입 될 수있는 꼬리 정맥 카테터를 사용하여 종양 미세 환경에 다세포 이벤트 운동 데이터를 획득한다. 생균 이미징 유방 종양 피부 플랩 수술 준비를 통해 노출된다. 이미지는 다수의 광전자 증 배관 튜브 (PMT) 검출기 ^(8)를 구비 한 다 광자 현미경을 이용하여 12 시간 동안 획득된다. 적절한 필터를 사용하여 감산 알고리즘 종양 미세 ^구 동시에 5 형광 신호를 획득하도록 4 PMT 검출기를 가능하게한다. 고해상도의 광자 생체 내에 현미경 더 이어지는 종양 미세 환경에서 종양 - 기질 상호 작용의 단일 셀의 고해상도 영상을 캡처 U혈관 투과성 및 종양 세포 intravasation ^10-13 nderstanding. 특히 종양 세포, 대 식세포 및 내피 세포 간의 상호 작용 부위에서 선택적으로 발생하는 확장 된 생체 내에 촬상 밝혀 고도로 국부 일시적인 혈관 투과성 ^{이벤트가도 13의} (전이 TMEM ¹⁴ 종양 미세 환경으로 정의). 또한, 종양 세포는 intravasation TMEM 발생 공간적 및 시간적 혈관 투과성 ^(13)와 상관된다. 이러한 이벤트의 역학의 단일 셀 해상도는 종양 미세 환경에 형광 표지 된 세포의 확장 시간 경과 광자 현미경의 사용을 통해 가능하게되었다.

프로토콜

설명하는 모든 절차는 의학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 알버트 아인슈타인 대학의 사전 승인을 포함한 척추 동물의 사용에 대한 지침과 규정에 따라 수행해야합니다.

1. 생성 형광 표지 된 종양 및 종양 관련 대 식세포

1. 강화 된 녹색 형광 마우스 유방 종양 바이러스 긴 터미널 반복, 즉 형광 기자 [와 형질 전환 마우스와 폴리오 중간에 T 항원 (MMTV-PyMT)를 구동하는 자연, 토착, 유전자 조작 마우스 유방암 모델을 교차하여 형광 표지 된 종양 세포를 생성 단백질 (EGFP), 향상된 시안 형광성 단백질 (ECFP)로 이루어지는 군 또는 Dendra2] ^-8,9-.
2. PyMT 동물에서 형광 라벨 식세포와 형광 [즉, MacGr myeloid- 및 macrophage- 특정 형광 기자들과 유 전적으로 조작 된 마우스 모델을 교차하여 종양 세포를 표지EEN ¹⁵ MacBlue 마우스 Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP ^16].
3. 대안 적으로, 형광 형광 표지 PyMT 종양 세포 (동계) 인간 유방암 세포주 또는 일차 인간 환자 유래의 종양 (이종) ^{(11, 17)의} 동 소성 이식을 통해 종양 표지 생성한다.
   1. 임플란트 형광 형광 표지 된 종양 세포와 골수 세포를 ¹³ 동물을 생성하는 형광 단백질 표지 된 골수 세포 동계 마우스에 PyMT 종양 세포를 표지.
4. 시작 2 시간 전에 형광 라벨 식세포 인간 세포주 또는 환자 유래 차 종양의 이종 이식 종양 중증 합병 면역 결핍증 (SCID) 마우스에 10 mg을 정맥 주사 (IV) 꼬리 정맥에 의해 / kg 형광 70 kDa의 덱스 트란의 100 μl를 주입 생체 내에 이미징.

2. 현미경 설정 및 이미지 준비

참고 :이 절차는 셋업을 설명합니다광자 현미경 ⁸ 생체 내에 이미징.

1. 두 광자 레이저와 검출기를 포함한 모든 현미경과 레이저 구성 요소의 전원을 켭니다.
2. 무대를 미리 따뜻한 30 ° C로 가열 상자를 켭니다. 이 단계는 동물의 생리 학적 온도를 유지하는데 중요하다.
3. 거꾸로 현미경 장소 현미경 무대에서 주문 제작 단계 인서트에 사용. 사용자 지정 삽입 이미징을위한 중앙에 관통 구멍 직경 "무대 삽입 공간과 1 맞게 가공 두께의 알루미늄"1/8의 장이다.
   1. 70 % 에탄올과 공기 건조와 현미경 스테이지와 무대 삽입을 닦습니다.
   2. 커버 유리와 광학 접촉을 유지하기 위해 20 배, 1.05 NA 현미경의 목적에 물 큰 드롭 놓습니다.
   3. 현미경 스테이지 인서트 촬상 포트 위에 배치 용 커버 유리 (두께 1.5 #). 실험실 테이프와 장소에 고정합니다.
   4. 2cm X 2cm의 구멍을 펀치 구멍 펀치를 사용하여그리고 유연한 고무 패드에 사용자 지정 단계 인서트의 구멍과 정렬 패드의 구멍 현미경 무대에 고무 패드를 배치합니다.

이미징 동안 주입 3. 꼬리 정맥 카테터의 준비 및 시약

1. 폴리에틸렌 (PE) 관의 30cm 길이를 잘라.
2. 이 플라스틱 피팅 떨어져 중단 될 때까지 집게를 사용하여 앞뒤로 31 G 바늘의 금속 바늘을 이동합니다.
3. 집게를 사용하여 PE 관으로 분리 된 바늘의 뭉툭한 끝을 삽입합니다.
4. 체육 튜브의 다른 쪽 끝으로 31 G 바늘을 삽입합니다.
5. 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)와 1 cc의 주사기를 입력하고 31 G 바늘에 삽입하고 PBS로 튜브와 바늘에서 모든 공기를 세척합니다. PBS 수화 혈액 ^{9,18 삼투압을} 유지하기 위해 사용되며, 그러나 식염수도 사용될 수있다.
6. 3 mg을 200 μL와 1 cc의 주사기를 채우기 / 155 kDa의 덱스 트란 - 테트라 메틸 (TMR을 kg을) 또는 혈관 표시를위한 양자 도트를 사용합니다.
7. 이러한 얼음 1 공통 주사기 대신 혈관 내피 성장 인자 A (VEGFA _165)의 165 아미노산 동종 같은 다른 주사 단백질을 준비한다. 0.05 ㎎ / ㎖의 농도로 0.2 ㎎ / ㎏ VEGFA ₁₆₅ ¹⁹ 주사.

내주 꼬리 정맥 카테터 4. 삽입

1. 캐리어 _{가스로서, O2와} 5 %의 이소 플루 란 유도 챔버를 사용하여 마취하에 동물을 놓는다.
2. 완전히 마취하고 발가락 핀치에 응답하지 않습니다 일단 수술 플랫폼에 마우스를 전송합니다.
3. 수술 플랫폼 오픈 이소 플루 란 마취 라인은 유도 챔버에 마취 라인을 닫고 동물의 주둥이를 통해 코 콘을 배치합니다. 2.5 %로 5 %에​​서 이소 플루 란을 줄일 수 있습니다.
4. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈 안과 연고를 적용합니다.
5. 가열 램프하에 동물 히트추가로 2 분에 꼬리 혈액 순환을 증가시키기 위해 순환 깊은 마취 둔화.
6. 70 % 에탄올로 마우스의 꼬리 정맥을 소독.
7. 동물의 측면 꼬리 정맥에 3 장으로 구성 카테터에서 31 G 바늘의 끝을 삽입하고 2-3mm의 바늘을 밀어 넣습니다.
8. 꼬리 정맥에 배치됩니다 카테터를 보장, 피를 볼 주사기에 다시 당깁니다.
9. 꼬리의 길이를 따라 정맥에 장소 병렬로 바늘을 잡고 바늘 위에 배치 실험실 테이프의 1cm 길이를 사용합니다.

5. 피부 플랩 수술은 유방 종양을 노출

1. 수술 플랫폼에서 동물 종양 및 70 % 에탄올로 복부 표면을 면봉. 참고 : 한 바와 같이,이 절차는 완전히 무균 수행되지 않습니다. 감염은 교란 요인이 될 수있는 긴 촬상 세션 들어, 적절한 무균 기술을 사용하도록 권장한다.
2. steri 사용멸균 가위는 복부 중간 선 길이 약 1cm 따라 피하 절개를 함께 제작 포셉은 복부 피부를 들어 올려. 절개 동안 복막을 천공하지 마십시오.
3. 부드럽게 유방 종양을 노출 멀리 복막에서 유선 종양을 부착 결합 조직을 잘라.
4. 조심스럽게 분리하고, 종양 혈관의 무결성을 유지하는 출혈을 최소화하면서 종양의 노출 된 표면에서의 밴드와 지방 절취 위 및 집게를 사용. 이 단계는 종양의 종양 맥관 구조와 공급을 유지하는데 중요하다.

현미경 6. 동물 준비

1. 이미징을위한 현미경 목표를 통해 무대 삽입에 커버 슬립에 배치 노출 된 종양으로 사전 예열 영상 무대에 동물을 전송합니다. 니들을 제거하지 않도록 동물 부드럽게 꼬리 정맥 카테터를 전송하기 위해주의한다.
2. 장소 일동물의 주둥이를 통해 전자 마취 코 콘은 3 % 이소 플루 란으로 마취 세트를 유지합니다.
3. 종양이 고무 패드의 구멍에 달려 유​​리 커버 슬립으로 접촉되도록 배치 동물.
4. 조심스럽게 제자리에 종양을 잡고 이미지 수집하는 동안 움직임을 줄이기 위해 실험실 테이프로 현미경 무대를 해결하기 위해 두 개의 고무 패드를 사용합니다.
5. 수화 조직을 유지하고 coverslip에 광학 접촉을 유지하기 위해 PBS와 고무 패드의 챔버를 입력합니다.
6. 펄스 산소 농도계 프로브와 동물의 생체 신호 모니터링을 시작합니다. 동물의 허벅지에 클립 센서를 부착합니다. 대안 목 맞게 구성되는 칼라를 사용할 수있다.
7. 30 ° C ^(20)을 유지하기 위해 동물을 통해 가열 상자를 놓습니다.
8. 천천히 마취를 유지하고 혈류를 유지하기 위해 0.5 %의 이소 플루 란의 수준을 감소시킨다.

7. 이미지 인식 및 Fluoresc 사출엔트 염료 및 주사 단백질

1. 종양의 표면에 형광 종양 세포의 현미경 접안 렌즈 초점 사용.
2. 혈관을 흐르는 영역을 찾아 관심의 영역을 선택합니다. 흐르는 혈관와 관심 영역의 선택은 종양 혈관을 평가하는데 중요하다.
3. 관심 영역이 선택되면 광자 촬상 모드로 전환 현미경.
4. A부터 Z 시리즈의 상한값과 하한값을 설정한다. 원하는 시작 위치로 이동 목표 포커스 조절 장치를 사용하고, Z 위치 "최고"버튼을 클릭하여 Z 시리즈의 상한을 설정한다. 제 2 고조파 발생 (SHG) 채널에서의 종양의 표면의 콜라겐 섬유 네트워크 시각화 어떠한 세포 만 콜라겐 섬유를 볼 수 없을 때 관찰하여 Z 시리즈의 상한을 결정한다.
   1. (typica 원하는 촬상 깊이 대물 이동하여 Z 시리즈의 하한을 설정에서야 베드로 50-150 μm의)와 Z 위치를 클릭 "바닥"버튼을 누릅니다.
   2. 스텝 사이즈 필드에 원하는 값을 입력하여 스텝 사이즈를 설정한다. 해상도 획득 시간에 대한 고려에 기초하여 스텝 크기를 결정하는 (전형적으로 2 ㎛의은 고해상도 3D 재구성에 사용이 5㎛ 달리한다).
5. 시간 경과 필드에 원하는 경과 시간을 타임 랩스 패널로 전환하고 입력하여 시간 경과 간격을 설정합니다. 최적의 시간 해상도 연속 촬상 0 초까지의 시간 간격을 설정한다. 참고 : 장시간 경과 이미징하는 대물 침지 액체를 보충하기 위해 인수 사이에 10 초까지의 시간 간격을 설정할 것을 추천한다.
6. 영상에 대한 매개 변수가 결정되고 나면, 천천히 155 kDa의 덱스 트란 - TMR을 주입.
   1. 꼬리 정맥 카테터에 PBS와 주사기를 제거하고 리에 모든 거품을 소개하지 않는 155 kDa의 덱스 트란 - TMR 돌보는이 들어있는 주사기로 교체네브라스카.
   2. 천천히 200 μL의 최대 볼륨, 마우스에 155 kDa의 덱스 트란 - TMR을 주입, 주사기는 PBS를 포함하여 주사기를 교체합니다. 중요한 단계 : 천천히 주입을 수행하고 정맥의 외부 솔루션을 입지 않도록 예방 조치를 취해야.
7. 레코드 버튼을 클릭 한 다음 그들을 우울하게하는 Z-스택 및 시간 경과 버튼을 클릭하여 Z-스택 시간 경과 이미징의 인수를 시작합니다.
8. 다른 형광 덱스 트란, 즉, 10 kDa의 덱스 트란 - 플루오 레세 인 이소 티오 시아 네이트 (FITC), 또는 단백질, 즉, VEGFA _(165)는, 미리 준비되어있는 경우, 0 =에서 분 시작을위한 이미지 수집의 시작 후에 주입.
   1. 꼬리 정맥 카테터에 PBS와 주사기를 제거하고 라인에 모든 거품을 소개하지 않는 10 kDa의 덱스 트란-FITC 또는 VEGFA ₁₆₅ 돌보는이 들어있는 주사기로 교체합니다.
   2. 천천히 꼬리 정맥 카테터를 통해 마우스에 주사제를 주입와 PBS가 포함 된 주사기와 주사기를 교체합니다.
9. 매 30-45 분 천천히 동물의 수화를 유지하기 위해 PBS 또는 식염수 50 ㎕를 주입.

8. 안락사

1. 이미지 수집의 종료에, 동물을 안락사.
   1. 5 %로 이소 플루 란을 늘립니다.
   2. 그것은 호흡과 무대에서 동물을 제거하기 위해 중단 후 30 초까지 5 % 이소 플루 란에서 동물을 유지합니다.
   3. 완전한 안락사을 보장하기 위해 자궁 경부 전위를 수행합니다.

9. 이미지 처리

1. 각 시점에서 각 채널에 대한 16 비트 TIFF 파일로 이미지를 획득하고 순차적으로 저장한다.
2. 스펙트럼 중첩 (즉, GFP 및 CFP), XY 드리프트의 제거 및 ImageJ에 ⁹ 년에 설립 된 방법을 사용하여 시간 경과 시퀀스에서 영화의 세대 분리를 수행합니다. 고해상도 이미지 ^(13)의 3 차원 표면의 재구성을 수행.

결과

연장 시간 경과 생체 내에 현미경 종양 미세 환경에서 다세포 프로세스의 단일 셀 해상도 이미징 할 수 있습니다. 형광 표지 된 종양 세포, 대 식세포, 혈관 공간, 제 2 고조파 발생 신호를 이용하여 콜라겐 섬유 네트워크를 시각화함으로써 종양 미세 환경에서 다수의 구획을 동시에 촬상 동안 추적. Dendra2 (도 1a)로 표지 유방 종양 세포, MMTV-PyMT-Dendra2 쥐에서 수?...

토론

종양 미세 환경에서 자연적으로 발생하는 세포 상호 작용은 종양 세포 운동성 및 intravasation 변화로 이어질 수있다. 살아있는 종양 조직의 고해상도 생체 내에 촬상 매우 과도 ^10,13,24 될 수 다세포 역학의 시각화를 허용한다. 종양 미세 환경에서 프로세스의 분자 메커니즘에 필수적인 정보를 제공 할 수 있습니다 이산 시점으로 얻은 생체 내 분석 또는 시간 경과 이미지의 최?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
155 kDa dextran-tetramethylrhodamine isothiocyanate	Sigma Aldrich	T1287	reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS
70 kDa dextran-Texas Red	Life Technologies	D-1830	reconstitute at 10 mg/ml in 1x PBS
10 kDa dextran-fluorescein isothyocyanate	Sigma Aldrich	FD10S	reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS
Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots	Life Technologies	Q21561MP	Dilute 25 μl in 175 μl of 1x PBS for injection
MMTV-PyMT mice	Jackson Laboratory	2374
Csf1r-ECFP mice (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP)	Jackson Laboratory	26051
Csf1r-EGFP mice	Jackson Laboratory	18549
1x PBS	Life Technologies
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	250 ml
Oxygen	AirTech
1 ml syringe, tuberculin slip tip	BD	309659
30 G x 1 (0.3 mm x 25 mm) needle	BD	305128
Polyethylene micro medical tubing	Scientific Commodities Inc	BB31695-PE/1	0.28 mm I.D. x 0.64 mm O.D.
Microscope coverglass	Corning	2980-225	thickness 1.5, 22 x 50 mm
PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter, software and sensors	Kent Scientific
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R
soft rubber pad	McMaster-Carr	8514K62	Ultra-Soft Polyurethane Film, 3/16” Thick, 12" x 12", 40 Oo Durometer, Plain Back
hard rubber pad	McMaster-Carr	8568K615	High-Strength Neoprene Rubber Sheet 1/4" Thick, 12" x 12", 50 A Durometer
Microscope	Olympus		The microscope is a custom built two laser multiphoton microscope based on an Olympus IX-71 stand utilizing a 20X 1.05NA objective lens.
7-Punch set	McMaster-Carr	3429A12	1/4" to 1" Hole Diameter, for Hammer-Driven Hole Punch