IL-1β의 발기인 기반을 DsRed 기자 마우스를 사용 호중구 초벌의 생체 내에 영상

요약

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

초록

호중구는 인간의 혈액 순환에서 가장 풍부한 백혈구하고 신속하게 염증 사이트에 채용된다. 초벌은 중성 백혈구의 식세포 기능을 향상시키는 중요한 이벤트입니다. 광범위한 연구는 감염과 부상 중에 존재와 호중구 프라이밍의 중요성을 발표했지만, 사용할 수 있었다 생체 내에서이 과정을 시각화의 의미합니다. 형광 접합 된 항 - 림프구 항원을 주입함으로써 달성 - 2) 생체 호중구 라벨링 프라이밍의 척도로 사용 - 1)을 DsRed 리포터 신호는 제공된 프로토콜은 세 가지 방법을 조합함으로써 살아있는 동물에서 프라이밍 호중구의 동적 프로세스의 모니터링을 가능하게 6G (Ly6G) 단일 클론 항체 (단클론 항체), 3) 생체 내에 공 촛점 이미징. 몇 가지 중요한 단계는이 프로토콜에 관련된 : 옥사 졸론 유발 마우스 귀 피부 염증, 동물의 적절한 진정 작용, 항 Ly6G 단클론 항체의 반복 주사 및 이전을촬영시 초점 드리프트의 ention. 몇 가지 제한이 그러한 한 마우스에서의 연속 촬영 시간 (~ 8 시간)의 한계 및 형광 염료 덱스 트란 염증 상태의 혈관에서의 누설로 관찰되었지만,이 프로토콜의 생체 내에 이미징을위한 기본 틀을 제공한다 쉽게 마우스 염증 모델에서 다른 면역 세포의 검토로 확장 될 수 프라임 호중구 동작 및 기능.

서문

호중구는 순환에서 가장 풍부하고 단명 한 백혈구 수 있습니다. 그들은 신속하게 그들이 항균 펩타이드 및 단백질 분해 효소 ^{1을 포함하는} 과립과 함께 활성 산소와 질소 중간체의 출시를 통해 같은 전문 식세포를 제공 감염이나 부상의 사이트에 채용된다. 그들의 채용 동안 호중구 염증 ^(2)의 위치에 도착하면 현저하게 향상 식세포 기능의 결과로, 미생물 제품, 화학 유인 물질 및 염증성 사이토킨을 포함하는 다양한 에이전트 "프라이밍"된다. 호중구 프라이밍 메커니즘은 광범위하게 연구 시험 관내 ^{3,4-되었다;} 그러나, 생체 내에서 처리를 동적으로 모니터링은 현재까지 불가능 하였다.

최근 생체 내에 영상은 시각화 및 생물에 생물학적 과정의 세포 역학을 정량화하기위한 중요한 기술이되고있다. Intravi탈 촬상는 종래의 광자 현미경 여기를 통해 (예를 들어, 공 초점)을 수행하거나 다 광자 현미경 ^(5)에 접근 할 수있다. 시간이 지남에 상당한 개선이 증가 영상 해상도 개선 촬상 깊이를 가능하게이 기술에서 달성되어, 광 손상 조직, 향상된 이미지 안정화 ^{-6,7- 감소.} 시간이 지남에 따라 세포 마이그레이션 및 상호 작용의 동적 시각화를 가능하게하는 독특한 능력을 감안할 때, 생체 내에 현미경 광범위 면역학 ⁸ 연구의 다양한 분야에 적용되고있다. 생체 내에 영상은 더 잘 이해하고 동물 모델 생활에서 모두 세포 및 분자 수준에서 면역 반응을 상황화하는 면역 학자 수 있습니다.

최근 유전자 변형의 발전뿐만 아니라 노크에서 기자 마우스 등 살아있는 동물에서 호중구의 동적 행동을 모니터링하기위한 유용한 도구를 제공하고 있습니다. 라이소자임 M 프로모터 기반의 강화 된 녹색 형광 단백질 노크에서생쥐는 크게 넘쳐, 세균 감염 및 염증 멸균 ^9-15 포함한 다양한 염증 과정 동안 호중구, 단핵구 및 대 식세포의 운동성을 특성화하는데 사용되어왔다. 또한, 세포질 형광 공명 에너지 전달, 바이오 센서를 발현하는 형질 전환 마우스는 염증 부위 내에 ¹⁶ 호중구 세포 미토 겐 - 조절 키나아제 및 단백질 키나아제 A의 활동을 연구에 사용되었다. 호중구의 형광 발현 특이성을 가진 쥐 모델 자체 림프구 항원 6G (Ly6G) ⁽¹⁷⁾ 식으로 결합되는 형광 단백질 tdTomato,뿐만 아니라 Cre 호텔 재조합 효소를 생산시 Catchup 녹아웃 마우스이다. 이 모델을 통해 Ly6G 결핍 호중구의 시각화는 이러한 세포에서 멸균 또는 감염성 생체 내 염증 다양한 상황에서 정상적인 기능을 발휘 있음을 보여 주었다. 을 DsRed 형광 페이지를 발현하는 형질 전환 마우스호중구 염증 단핵구 활성화 대 식세포를 포함 할 것으로 - - (IL-1β) 프로모터 (pIL1-을 DsRed)는 IL-1β 생산 세포의 운동성 동작을 시각화하는데 이용 된 interleuikin-1β 마우스의 제어하에 유전자 rotein 신흥 염증이 피부 ^십팔인치

생체 내에서 라벨은 염증 조직에서 호중구의 세포 및 분자 행동을 추적하는 또 다른 방법이 될 수 있습니다. 안티 GR-1 단일 클론 항체 (단클론 항체) 라벨 형광의 낮은 용량의 정맥 주사, GR-1 ⁺ 호중구의 모집 캐스케이드 후 황색 포도상 구균 ^(19)에 감염된 마우스의 피부 병변에 가시화되고있다. streptavidin-를 포함하는 복합체의 생체 내 투여 결합 705 nm의 양자점과 바이오틴 안티 Ly6G 단클론 항체는 특히 순환 호중구 ^{(20) 레이블을 붙입니다.} neutroph에 이러한 접합체 또한, 엔도 시토 시스IL 소체는 간질로 이주 호중구 고속 소낭 수송의 추적을 허용한다. 생체 P- 셀렉틴 대 형광 복합 항체 αM 인테그린 리간드 -1 (PSGL-1), L 셀렉틴 (CD62L)을 당 단백질로 표지 (는 CD11b를 TNFα에 의한 염증 모델)과 케모카인 (CXC 모티브) 수용체 2 (CXCR2)는 초기 염증 ^21시 놀이 규제 메커니즘을 해명했다. 편광 호중구는 CD11b를하고 CXCR2, 호중구의 이동을 유도하고 염증을 시작 수용체의 재분배 결과, 활성화 된 혈소판에서 CD62L 존재와 상호 작용하는 uropods을 PSGL-1이 풍부한 돌출.

IL-1β는 준비하는 호중구 ^(22)에 상승 서명 유전자 중 하나입니다. pIL1-을 DsRed 기자 마우스에서,을 DsRed 형광 신호 (예., IL-1β의 프로모터의 활성화) 긍정적으로 mRNA 발현과 IL-1β 단백질 생산 IL-1β와 상관 관계. ^{18 호중구 프라이밍의 프로세스를 모니터링하기 위해, 생체 내에 현미경 방법은 형광 접합 된 항 Ly6G 단클론 항체와 호중구의 생체 표지 다음 pIL1-을 DsRed 마우스 모델에서 옥사 졸론 (OX)와 피부 염증의 유도를 포함하는 개발되었다. 이 모델을 통해 다양한 질병과 질환의 동물 모델에서 호중구 뇌관의 동작 및 기능을 연구 할 수있다.}

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프로토콜

모든 동물 실험은 건강 지침의 국립 연구소에 따라 수행 톨레도 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인됩니다.

pIL1-을 DsRed 마우스 1. 표현형

참고 : 자손은 야생형 (WT) C57BL6 마우스를 이형 pIL1-을 DsRed 마우스 번식에 의해 생성됩니다. 세 주 네 오래된 새끼는 표현형에 대한 준비가 간주됩니다. 마우스의 턱밑 출혈은 약간의 수정 ⁽²³⁾ 설립 프로토콜을 따른다.

1. 마우스 새끼 전혈에서 백혈구의 분리
   1. 각 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 헤파린의 20 μl를 추가합니다.
   2. 케이지에서 한 강아지를 획득. 강아지의 식별 태그를 기록합니다. 턱밑 정맥에서 채혈 전에 새끼를 마취 할 필요가 없습니다.
   3. 목의 목덜미에 의해 강아지를 잡고 일에 턱밑 정맥을 관통5 밀리미터 란셋을 사용하여 전자 뺨 파우치. 혈액 방울 침투의 관점에서 스며 있도록 작은 구멍을 만들 충분한 힘을 적용합니다. 각각의 강아지에 대한 새 바늘을 사용합니다.
   4. 헤파린 함유 microcentrifuge 관에서 강아지 당 혈액의 5 방울 - 3를 수집합니다. 펑크 사이트를 청소하고 지혈을 용이하게하기 위해 압력을 적용합니다.
   5. 새 케이지에서 강아지를 넣고 동물 시설에 케이지를 반환하기 전에 30 분 동안 관찰한다.
   6. 긍정적이고 부정적인 컨트롤로 알려진 표현형의 성인 쥐에서 혈액을 수집합니다.
   7. 각 튜브, 소용돌이 튜브에 붉은 혈액 세포 용균 버퍼의 500 μl를 추가, 5 부화 - 얼음에 10 분.
   8. 각 튜브에 세포 현탁액을 아래에 소 태아 혈청 (FBS) 500 μL - 천천히 400을 추가한다. 명확한 계면은 상층의 세포 현탁액 및 FBS의 하층 사이에서 관찰 될 수있다.
   9. 캡 튜브와 원심 분리기 샘플을 5 분 동안 1,500 × g에서.
   10. 모피에 1.1.9 - 반복 1.1.7 단계THER는 적혈구를 제거합니다. 용해 처음 충분한 경우 반복하지 않는다. 펠렛 원심 분리 후 식별하기 어려울 수 있습니다.
2. 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) 자극과 문화
   1. 전체 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 1640 배지 200 μl의의를 Resuspend 세포.
   2. 튜브 유세포에 세포 현탁액을 전송.
   3. 완전 RPMI 1640 배지 990 μL와 LPS 스톡 용액 10 μL (1 ㎎ / ㎖)을 혼합하여 용액을 작동 LPS를 만든다.
   4. 세포 현탁액 200 μL에 솔루션을 작업 10 μg의 / ml의 LPS의 20 μl를 추가합니다.
   5. 캡 튜브는 느슨하게 5 % CO _2와 37 ° C에서 4 시간 동안 샘플을 품어.
3. 유동 세포 계측법 분석
   1. 유동 세포 계측법에 대한 데이터 취득 프로그램을 연다. 인수를 샘플링하기 전에 인수 템플릿을 설정합니다.
   2. 도구 팔레트에서 도트 플롯 도구를 클릭합니다. FO 그리기사이드 분산 형 (SSC) 플롯 대 rward 산란 (FSC). 리니어 스케일에 FSC와 SSC 전압 매개 변수를 설정합니다.
   3. 세포 계수기에 의해 허용 FSC와 SSC의 가장 낮은 임계 값을 선택합니다. 각각, FSC와 SSC에 대한 임계 값 200과 50을 적용합니다.
   4. SSC 플롯을 대 FSC 내 파편 적혈구와 림프구, 단핵구, 과립구 및 수지상 세포를 포함하고, 배제 게이트 G1을 그린다.
   5. 도구 팔레트에서 히스토그램 도구를 클릭합니다. FL2 (적색 형광 채널) 히스토그램을 그립니다. 모든 양을 DsRed 이벤트를 포함하는 게이트를 그릴 FL2 신호의 기준과 양성 대조군 샘플을 설정하는 대조군 샘플을 사용한다.
   6. 사이토의 유체 제어 패널에서 유체 모드 "RUN"과 유량에 "HI"(약 60 μL / 분)을 설정합니다. 각 샘플 10,000 이벤트를 취득.
   7. G1은 게이트에서을 DsRed 양성 세포의 비율을 측정하여 강아지의 표현형을 결정합니다.

2. pIL1-을 DsRed 마우스에서 피부 염증의 유도

1. 100 밀리그램 / kg 케타민, 10 밀리그램 / kg 자일 라진 및 1 ㎎ / ㎏ 아세 프로 마진을 포함하는 마취 칵테일을 복강 내 (IP) 주사하여 마우스를 마취. 적절하게 마취 마우스는 발가락 핀치에 뒷 발 철수를 표시하지 않습니다.
2. 마우스의 양쪽 귀에의 지느러미 표면에 헤어 제거 크림을 적용합니다. 1 분 30 초를 기다립니다. 물에 적신 솜으로 귀 표면을 닦고 자연 건조를 할 수 있습니다.
3. 마이크로 미터를 사용하여 귀 두께를 측정하고 별도의 새장에 마우스를 교체합니다. (- 30 분 ~ 15) 마취에서 회복 될 때까지 관찰한다. 제모 제품에 의한 피부 염증을 해결하기 위해 상기 실험을 수행하기 전에 마우스를 3 일 동안 휴식을 허용한다.
4. 1 ml의 아세톤에 OX 16.7 mg의 용해와 올리브 오일의 250 μL와 OX / 아세톤 용액 750 μl를 혼합하여 1.25 % (w / v)의 OX를 준비합니다. 250과 아세톤 750 μl를 혼합하여 차량의 솔루션을 준비합니다# 181; 올리브 오일의 리터.
5. 마취 칵테일 (2.1)의 IP 주사로 마우스를 다시하는 것은-마취. 이전과 귀 두께를 측정한다.
6. 오른쪽 귀 양쪽에 1.25 %의 OX의 12.5 μl를 적용합니다. 왼쪽 귀 양쪽에 아세톤 / 올리브 오일 차량 액의 12.5 μl를 적용합니다.
7. 완벽하게 한 다음, 다른 마우스에 의해 귀에 모욕을 방지 원래의 새장에 마우스를 교체하고 동물의 주거 시설로 돌아 회복 될 때까지 마우스 케이지 동료로부터 분리하십시오.
   참고 : 머리 제거 귀 두께의 변화에​​ 의해 다음과 같은 작은 피부 염증의 원인이 될 수 있습니다. 이 작은 염증 3 일 후 해결 정상적인 귀 두께에 의해 확인됩니다. 24 시간 동안 국소 도포 한 후, OX 처리 귀는 유의 한 (P <0.01)에 비해 차량의 솔루션을 단독으로 처리 귀 부종을 보여줍니다.

pIL1-을 DsRed 마우스에서 호중구의 3 라벨링

참고 : 저용량 F에 의한 호중구의 생체 표지에luorescence-결합 호중구 특정 단클론 항체는 최근에 개발 된 프로토콜 ^19을 따른다. 레트로 궤도 주사는 약간의 수정 ^(24)와 함께 설립 프로토콜에 따라 수행된다.

1. 인산염 완충 식염수 (PBS)의 90 μl를 0.5 ㎎ / ㎖ 알렉사 플 루어 647 - 복합 안티 Ly6G 단클론 항체 (클론 1A8)의 10 μl를 희석 방지 Ly6G 단클론 항체 작업 솔루션을 준비합니다.
2. 28 게이지 바늘과 U-100 인슐린 주사기에 방지 Ly6G 단클론 항체 작업 솔루션 (50 μg의 / ㎖) 100 ㎕를 전송합니다.
3. 이전에 기술 된 마취 칵테일 (2.1)의 IP를 주입하여 성인 pIL1-을 DsRed 마우스를 마취. 깨끗한 작업 보드의 마취 마우스 복부를 내려 놓습니다.
4. 부분적으로 소켓에서 안구 돌출 한 마우스의 눈에 부드러운 아래 피부 지느러미에 압력과 복부를 적용합니다.
5. 조심스럽게 복고풍 궤도에 내측 눈구석에서 약 30 °의 각도로, 아래로 베벨, 바늘을 배치공동.
   참고 : 운영자가 동에 바늘을 삽입 한 번 압력, 침투 및 안심 저항을 느낄 수 있습니다.
6. 천천히 부드럽게 마우스로 용액 (5 μg의 단클론 항체 / 마우스 / 분사)를 작동 방지 Ly6G 단클론 항체의 100 μl를 주입. 빨리 바늘을 제거합니다. 출혈 소량 성공적인 주입 나왔다.
7. 바로 오른쪽 마우스 왼쪽 귀에 1.25 %의 OX 차량 솔루션을 적용 할 수 있습니다.
8. 8 시간 후, 동일한 마우스로 역 궤도 사출을 통해 새롭게 제조 방지 Ly6G 단클론 항체 작업 용액 (5 μg의 단클론 항체 / 마우스 / 분사) 100 μl를 관리 할 수​​ 있습니다.
9. 즉시 이미징 전에 혈관을 시각화 30 ㎎ / ㎖ 플​​루오 레세 인 이소 티오 시아 네이트 (FITC)의 100 μl를 관리하려면 복고풍 궤도 주입을 통해 덱스 트란 (150 kDa의)를 π 공역 계.

PIL-1을 DsRed 마우스에서 호중구 초벌 4. 생체 내에 영상

1. 마취 칵테일 (2.1)의 IP를 주입으로 마우스를 마취.0; 동안 이미징을위한 마취하에 건조를 방지하기 위해 마우스 눈 수의학 연고를 적용합니다.
   1. PBS 동량 원래 마취 칵테일 500 ㎕의 희석하여 1 ml의 절반 - 용량 마취 칵테일을 준비한다.
   2. 나비 27 게이지 바늘로 1 ML의 주사기에 절반 용량 마취 칵테일을 전송합니다.
   3. 복강 마우스 복부에 나비 바늘을 삽입하고 테이핑에 의해 복부에 나비 날개를 고정합니다.
2. 촬상 스테이지의 중심에 유리 커버 슬립을 놓는다. 제자리에 고정하는 커버 슬립의 가장자리를 테이프입니다.
3. 마우스 귀 복부 표면뿐만 아니라, 커버 슬립을 PBS 방울을 놓는다.
4. 위치는 커버 슬립을 통해 자사의 귀 마우스를 마취. 또한 테이프를 통해 장소에서 개최 된 커버 슬립과 유리 슬라이드 사이의 귀를 사이에 의해 아래로 귀 끝, 등쪽를 탑재합니다.
5. 멀티 레이저 형광 공 초점 현미경과 관련된 모든 전자 켭니다quipment. 주변 광에 노출을 최소화하기 위해 실내 조명을 끄십시오.
6. 이미지 수집 소프트웨어를 엽니 다. 염료 목록 메뉴에서 형광 염료의 검출을위한 레이저 채널을 선택합니다.
7. 접안 렌즈를 통해을 DsRed ⁺ 세포에서 혈관과 빨간 신호에서 녹색 신호를 관찰하여 염증이 귀 피부에 초점을 조정합니다.
8. 스캔 2 μS / 픽셀의 속도와 512 × 512 픽셀의 해상도와 빠른 검사를 수행합니다. 라이브 뷰 메뉴의 각 채널에 대한 사색을 선택합니다. 끝을 설정하고 검사의 위치를​​ 시작하는 데 초점 노브를 조정합니다.
9. 8 마이크로 초 / 픽셀 800 × 800 또는 1024 × 1024 픽셀의 해상도 - 스캔 (4)의 속도로 천천히 스캔을 수행합니다. 높은 전압 이득을 조정하고, 채도 (적색 화소)를 피하면서 신호의 세기를 최대화하기 위해 각 채널 오프셋. 각 채널에서 몇 빨간색 픽셀이 있어야합니다.
10. 제를 주사하여 입체 화상 세트를 만들전자 귀 피부, 635 μm의 × 635 μm의 × 30 μm의 (20X 목적), 또는 1270 μm의 ×를 각질층에서 표면적으로 시작하여 X, Y, 317 μm의 × 30 μm의 (40X 목표) × 317 μm의의 Z 볼륨으로 하향 진행 2 μm의 Z-단계에서 1270 μm의 × 50 μm의 (10X 목적).
    주 : 각질층은 표피의 최 외층이고 용이 강한 자기 형광 신호에 기초하여 국부적 수있다.
11. 저속 촬상 실험에서, 레코드 3 차원 영상까지 8 시간마다 2 ~ 4 분.
12. 나비 바늘을 통해 절반 용량 마취 칵테일의 10 μL - 마우스가 마취에서 회복하기 시작 일시적으로, 경련 수염의 관찰에 기초하여 기록, 5를 관리 할 수​​ 있습니다.
    참고 : 마취 량의주의하십시오 - 과다 복용 마우스 사망의 원인이 될 수 있습니다. 대안 적으로, 용기에 흡입 마취제 단기 마취 A의 마우스에도 적용 할 수있다노즈콘 장기 촬상에 사용될 수있다.
13. 이미징이 완료되면 무대에서 마취 마우스를 제거합니다. 테이프를 분리하고 마우스의 복부에서 나비 바늘을 제거합니다. 동물의 주거 시설에서 별도의 케이지에 마우스를 돌려줍니다.
    참고 : - 3 시간 단기 영상 (<1 시간)의 경우, 마우스는 완전히 1에 신속하게 마취에서 회복. 16 시간 - 장기 영상 (~ 8의 시간)의 경우, 마우스 (12)의 통상의 회복 기간을 서서히 회복. 따라서, 경구 투여 물은 심각한 탈수를 방지하기 위해 회복 기간 중 적어도 몇 회에서 추천된다.
14. 처리 영상 데이터 세트는 개별 셀을 추적 이동성 경로를 생성하고, 화상 해석 소프트웨어 ^(25)를 사용하여 세포 이동의 방향성 및 속도를 계산한다.

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결과

pIL1-을 DsRed 마우스의 선별은 유세포 분석기를 사용하여 말초 혈 백혈구에 의해 생산 된 표현형을 DsRed 형광 신호에 기초하여 수행된다. LPS 자극은 호중구, 단구, 수상 세포 및 ^26-28을 포함하여 골수 세포에서 IL-1β 생산을 유도하는 것으로 알려져있다. 따라서, 고립 된 백혈구 분석 유동 세포 계측법하기 전에 4 시간 동안 LPS와 함께 배양한다. 다음으로, 게이트는이 ?...

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토론

본 연구의 목적은 아직 현재의 기술에 의해 실현되지 않은 살아있는 동물의 호중구 프라이밍의 과정을 모니터링하는 기술을 개발하는 것이다. 이 목표를 달성하기 위해 세 가지 설정 방법이 수행됩니다 : 피부 염증의 1) 유도 IL-1β 프로모터 기반을 DsRed 기자 마우스에서 프라이밍의 측정, 형광 접합 된 항 Ly6G의 낮은 복용량으로 호중구의 2) 생체 표지로 단클론 항체, 3) 생체 내에 공 촛점 현?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin sodium	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-540-31
ACK lysing buffer	Lonza	10-548E
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F0926
Lipopolysaccharides	Sigma-Aldrich	L4391
Ketamine hydrochloride	Hospira	NDC 0409-2051-05
Xylazine	LLOYD Laboratory	NADA #139-236
Acepromazine	Boehringer Ingelheim	ANADA 200-361
Hair-removal cream	Church & Dwight
Acetone	Fisher Scientific	A16P4
Oxazolone	Sigma-Aldrich	E0753
Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody	BioLegend	127610
U-100 insulin syringe with 28 G needle	BD	329461
FITC-CM-Dextran, 150 kDa	Sigma-Aldrich	74817
Butterfly infusion set (27 G needle)	BD	387312
FACSCalibur cytometer	BD
CellQuest Pro software	BD
Confocal microscope	Olympus	FV1000
Metamorph Software	Universal Imaging