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요약

Proton Transfer Reaction Time of Flight Mass Spectrometry allows high-sensitivity, rapid and non-invasive analysis of volatile organic compounds. To demonstrate its potential, we give three examples: lactic acid fermentation of yogurt (on-line bioprocess monitoring), different apple genotypes (large-scale screening), and retronasal space after drinking coffee (nosespace analysis).

초록

TOF (Time-Of-Flight) 질량 분석기 (MS)와 결합 된 양성자 이동 반응 (PTR)은 직접 주입 질량 분광 분석 (DIMS) 기술에 속하는 화학 이온화를 기반으로 한 분석 방법입니다. 이 기술은 휘발성 유기 화합물 (VOCs)의 신속한 측정을 가능하게하여 높은 감도와 정확성을 보장합니다. 일반적으로 PTR-MS는 시료 준비 및 시료 파괴를 필요로하지 않으므로 실시간 및 비 침습적 시료 분석이 가능합니다. PTR-MS는 환경 및 대기 화학에서 의학 및 생물 과학에 이르기까지 많은 분야에서 이용됩니다. 보다 최근에는 자동 샘플러 및 맞춤형 데이터 분석 도구를 사용하여 PTR-ToF-MS를 결합하여 자동화 수준을 높이고 결과적으로 기술의 잠재력을 향상시키는 방법론을 개발했습니다. 이 접근법은 바이오 프로세스 ( 예 : 효소 산화, 알콜 성 발효)를 모니터하고, 대형 샘플 세트를 스크리닝 할 수있게 해줍니다.VOC 함유량의 측면에서 여러 가지 실험 모드 ( 예 : 주어진 성분의 다른 농도, 특정 기술 매개 변수의 다른 강도)를 분석 할 수 있습니다 ( 예 : 다른 기원, 전체 germoplasms). 여기서는 요구르트의 젖산 발효 중에 방출되는 휘발성 유기 화합물 (온라인 바이오 프로세스 모니터링)의 검출, 상이한 사과 품종과 관련된 VOC (대규모 스크리닝) 모니터링, , 커피 마시 (코끝 분석) 중 retronasal VOC 방출 에 대한 생체 내 연구.

서문

Direct-Injection Mass Spectrometric (DIMS) 기술은 휘발성 유기 화합물 (VOCs)의 신속한 검출 및 정량화를 가능하게하는 고감도 및 견고성으로 상당한 질량 및 시간 분해능을 제공하는 일종의 분석 장비 접근 방식을 나타냅니다. 이러한 기 계적 접근에는 MS-e-noses, 대기압 화학 이온화 질량 분광법 (APCI-MS), 양성자 전달 반응 질량 분광법 (PTR-MS) 및 선택된 이온 흐름 튜브 질량 분광법 ( SIFT-MS) 1 . 각 접근법의 장단점은 시료 주입의 종류, 전구체 이온의 공급원 및 제어, 이온화 ​​공정의 제어 및 질량 분석기 1,2에 달려 있습니다.

양성자 전달 반응 질량 분광계 (PTR-MS)는 실시간으로 모니터링하기 위해 20 년 전에 개발되었습니다.공기 중 대부분의 휘발성 유기 화합물 (VOCs)을 검출 할 수있는 낮은 검출 한계 (대개 수 ppbv, 10 억분의 1 ppb). PTR-MS의 현재 용도는 의학 응용에서부터 식품 관리, 환경 연구에 이르기까지 다양합니다. 이 기술의 주요 특징은 빠르고 연속적인 측정의 가능성, 전구체 이온의 강렬하고 순수한 소스 및 이온화 조건 (압력, 온도 및 드리프트 전압)을 제어 할 수있는 가능성입니다. 이러한 기능을 통해 다양한 용도로 높은 표준화 수준 1 , 4를 결합 할 수 있습니다. 사실,이 방법은 대부분의 휘발성 화합물 (특히 물보다 높은 양성자 친 화성을 특징으로하는 화합물)에서 비 해리 성 양성자 전달을 유도하는 하이드로 늄 이온 (H 3 O + )의 반응에 기반하며, 중성 화합물H 3O + + M → H 2 O + MH + 반응에 따라 (M) APCI-MS와 같은 다른 기술과는 달리, 전구체 이온 생성 및 샘플 이온화는 두 개의 다른 도구 격실로 나뉩니다 (PTR-MS 기기의 도식적 표현은 그림 1 에 나와 있습니다). 중공 음극 이온 소스 내의 수증기에 의한 방전은 하이드로 늄 이온 빔을 생성한다. 이 단계 후에, 이온은 VOC의 이온화가 일어나는 드리프트 튜브를 가로 지른다. 그런 다음 이온이 펄스 추출 섹션으로 들어가고 TOF 섹션으로 가속됩니다. 비행 시간을 통해 이온 8 의 질량 대 전하 비율을 결정할 수 있습니다. 각각의 추출 펄스는 선택된 m / z 범위의 완전한 질량 스펙트럼 8 을 유도합니다. 이온 스펙트럼은 빠른 데이터 수집 시스템 7 에 의해 기록됩니다. 전체 스펙트럼은 일반적으로신호 대 소음 수준에 따라 더 높은 시간 분해능을 얻을 수는 있지만 보정 없이도 VOC 헤드 스페이스 농도의 정량적 인 평가가 가능합니다.

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그림 1 : PTR-MS의 개략도 PTR-MS 기기의 도식적 표현. HC : 할로우 캐소드가있는 외부 이온 소스; SD : 소스 드리프트; VI, 벤 투리 (venturi) 형 입구; EM, 전자 배율기; FC1-2, 유량 컨트롤러. Boschetti et al.의 허락을 받아 증쇄 됨 . 7 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

일반적으로 PTR 기술은 빠른 분석 시간, 높은 검출 감도 및 비교적 조밀 한 장비 크기를 보장하며 시료 준비 및 시료 파괴가 필요 없으므로 실시간 조사가 가능합니다. PTR은 환경, 대기, 식품, 기술, 의학 및 생물학 분야에 상당한 관심을 가지고 있습니다 12 .

식품 매트릭스와 관련된 휘발성 유기 화합물 (VOCs)은 악취 및 향미 인식과 관련된 생물학적 현상의 분자 적 기초에서 중요한 역할을하기 때문에 식품 과학 및 기술 분야에서 탁월한 관심을 보이고 있습니다. 따라서 VOC의 실시간 및 비 침습 탐지에 대한 관심은 주로 음식의 감각적 인 특성을 다룹니다. 또한, 방출 된 휘발성 유기 화합물 ( VOCs ) 및 / 또는 휘발성 유기 화합물을 마커로 모니터링하기 위해 부패 및 병원성 미생물을 검출 할 가능성을 고려한다면( 예 : 열처리 중 Maillard 부산물) 14) , VOC 식별 및 정량화가 식품 품질 관리에서 관심 분야 인 방법이 분명해진다. 식품 매트릭스에서의 VOC의 신속한 모니터링과 정량화를위한 ​​PTR-MS 기술의 최근 사용은 이러한 분석 접근법의 광범위한 적용에 대해 증언합니다 ( 표 1 ).

식품 매트릭스 신청 종류 간단한 설명 참고
버터 스크리닝 / 특성 분석 유럽 ​​버터의 지리적 기원 15 명
요거트 생물 공정 모니터링 유산균의 발달 과정멘토 16
시리얼 바 생체 내 측정 다양한 설탕 성분으로 시리얼 바를 소비하는 동안의 노즈 공간 17 세
액체 모델 시스템 모의 구강 조건 입안에서의 혀의 압력 및 구강 상태 평가 18
사과 생체 내 측정 소비 중 Nosespace 다른 유전, 조직 및 물리 화학적 매개 변수를 가진 사과 19
커피 스크리닝 / 특성 분석 전문 커피의 차별화 20
포도 필수 스크리닝 / 특성 분석 조리 과정의 효과 21
맛을 낸 사탕 생체 내 측정 다른 패널을 사용하는 패널리스트에 대한 결정직접 질량 분광법 22 개월
햄 스크리닝 / 특성 분석 양돈 시스템의 효과 23
빵 모의 구강 조건 저작 중의 빵 향기 시뮬레이션 24
우유 스크리닝 / 특성 분석 광산화에 의한 우유의 동적 변화 모니터링 25 세
커피 스크리닝 / 특성 분석 서로 다른 지리적 기원의 볶은 커피의 다양성 26 세
빵 생물 공정 모니터링 알콜 성 발효 중 다른 효모 스타터의 영향 27
커피 생체 내 측정 다른 볶은 커피 준비의 소비 중 Nosespace 28
토마토 스크리닝 / 특성 분석 생산 위치, 생산 시스템 및 다양성의 영향 29
빵 생물 공정 모니터링 알콜 발효 중 밀가루, 효모 및 이들의 상호 작용 30
버섯 스크리닝 / 특성 분석 말린 새우 버섯의 유통 기한 31
요거트 생물 공정 모니터링 젖산 발효 중 다른 스타터 배양의 효과 32
사과 스크리닝 / 특성 분석 사과 germplasm 컬렉션의 다양성 33
커피 스크리닝 / 특성 분석 커피 원산지 추적 34
커피 생체 내 측정 조합동적 인 감각 방법 및 커피 지각을 이해하는 생체 내 코끝 분석 35 세

표 1 : 식품 분야에서 PTR-ToF-MS를 사용한 과학적 연구 목록. 식품 관련 실험에서 VOC 함유량을 모니터링하기위한 PTR 기반 접근법을 사용한 과학 연구의 비 한정적인 목록.

최근의 연구에서 우리는 샘플링 자동화 및 신뢰성을 높이기 위해 자동화 된 샘플링 시스템 및 맞춤형 데이터 분석 도구와 결합 된 PTR-ToF-MS의 적용에 대해보고했으며 결과적으로이 기술의 잠재력을 향상 시켰습니다 7 , 10 , 13 . 이로써 우리는 VOC 함유량과 관련하여 VOC 방출에 대한 여러 실험 모드의 영향을 분석하기 위해 큰 샘플 세트 ( 예 : 많은 복제물, 전체 자성체가있는 다른 기원의 식품)를 화면에 표시 할 수있었습니다 ( 예 : 다양한 농도특정 기술 파라미터의 다양한 강도), 주어진 바이오 프로세스와 관련된 VOC ( 예 : 효소 산화, 알코올 발효)를 모니터링 할 수 있습니다. 여기서는 농업 식품 분야에서 PTR-ToF-MS의 잠재력을 예시하기 위해 다양한 미생물 스타터 배양에 의해 유도 된 요구르트의 젖산 발효 중에 방출되는 VOCs 검출 (온라인 바이오 프로세스 모니터링 ), 다양한 사과 재배 품종 (대형 스크리닝)과 관련된 VOC 모니터링 및 커피를 마시면서 역행렬 VOC 방출 에 대한 생체 내 연구 (코끝 분석).

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프로토콜

의정서는 인간 연구 윤리에 관한 우리 기관위원회의 지침을 따른다.

1. 시료 준비 및 자동 시료 주입기 조건

  1. 온라인 바이오 프로세스 모니터링 : 요구르트의 젖산 발효 과정에서 방출되는 휘발성 유기 화합물 (VOC) 검출
    참고 : 프로토콜의이 섹션은 Benozzi 등이 보고 한 절차의 일부를 나타냅니다 . 32
    1. 각 바이알에 저온 살균 우유 5 mL를 넣으십시오 (PTFE / 실리콘 셉타가 장착 된 20 mL 유리 바이알). 사용 된 우유의 유형을 기록하고 샘플을 45 ° C로 신속하게 가열하십시오. 온도 조절 트레이 (45 ° C)가 장착 된 다기능 GC 자동 시료 주입기로 이송하십시오.
    2. autosampler의 로봇 팔을 사용하여 바이알에 미생물 스타터 배양 물을 접종하십시오 (시동기 배양 물 제조업체의 사양에 따라). 원하는 요구르트의 유형 및 사양에 따라 부화 시간을 설정하십시오초보자 문화 제작자가보고했습니다. 요구르트를 준비하는 동안 젖산 발효의 온라인 VOC 모니터링을 얻고 다른 샘플을 편리하게 분석하도록 자동 샘플러를 설정하십시오.
  2. 대규모 스크리닝 : 다양한 사과 유전자형과 관련된 VOC 모니터링
    참고 : 프로토콜의이 섹션은 Farneti 등이 보고 한 절차의 일부를 나타냅니다 . 33 , 36
    1. 숙성 / 보전의 원하는 단계 ( 예 : 상업 수확 단계)의 샘플 사과. 각 클론에 대해 눈에 띄는 피해없이 적어도 5 개의 균질 과일을 선택하십시오. 실내 온도 (25 ° C) 또는 냉장 보관 (4 ° C)에서 원하는 기간 동안 사과를 보관하십시오.
    2. 살육 잎 샘플러로 각 사과에서 5 개의 원통형 디스크 (지름 1.7cm, 두께 1cm)를 수집합니다. 피질 조직의 일부를 포함하고 핵심 부분에 씨앗이 없도록하십시오.즉시 샘플을 균질화하고 액체 질소에서 동결시킵니다. 분석 할 때까지 -80 ° C에서 보관하십시오.
    3. 분석하기 전에 각 생물학적 복제품 2.5 g 사과 샘플 3 개를 바이알 (PTFE / 실리콘 셉터가 장착 된 20 mL 유리 바이알)에 넣으십시오. 2.5 mL의 탈 이온수, 1 g의 염화나트륨, 12.5 mg의 아스 코르 빈산, 12.5 mg의 구연산과 시료를 혼합하고 분석까지 시료를 4 ° C (최대 3 일간) 보관한다.
    4. 40 ° C에서 샘플을 배양 한 다음 자동 샘플러를 설정하여 VOC를 자동으로 분석합니다.
  3. Nosepace 분석 : 커피 마시 중 VOCs의 retronasal 방출 연구
    참고 : 프로토콜의이 섹션은 Romano 등이 보고 한 절차의 일부를 나타냅니다 . 28
    1. 커피를 빻은 커피에서 양조 한 커피를 준비하십시오.
      1. 커피 기계 사용 : 물 / 분말 비율, 사용 된 미네랄 워터 유형,커피 메이커의 유형 및 커피 음료를 얻기 위해 채택 된 절차 (수량은 커피 기계의 치수의 함수 임)에 따라 다르다.
      2. 이탈리아에서는 "moka"로 알려진 6 컵 스토브 커피 메이커를 사용하여 물 450 mL와 커피 가루 30 g을 사용합니다. 양조 커피를 용기에 넣고 온도 조절 수조 (60 ℃)에서 옮깁니다.
    2. 각 커피 브루를 위해 플라스틱 캡으로 폴리스티렌 컵 (40 mL)에 7.5 mL 분량을 옮긴다. 각 패널리스트는 다음과 같은 프로토콜에 따라 음료를 맛보아야합니다. i) 30 초의 자유 호흡, ii) 커피 한 잔, 빠른 삼키는 것, iii) 인체 공학적 유리 nosepiece 28 호흡 3 분.
    3. 커피 샘플과 패널리스트의 순서를 무작위로 추출하여 매일 3 일 동안 반복합니다.
    4. 패널 러의 코에 실리콘 고무로 된 일회용 인체 공학적 노즈 피스를 적용하여 샘플링을 수행하십시오. n을 연결하십시오.PEEK 튜브를 사용하여 패널리스 바디와 접촉 한 첫 번째 파트에서만 비가 열한 다음 PTR-MS와 샘플링 인터페이스를 연결하는 입구 호스에서 110 ° C로 가열합니다 악기.
      참고 : 표 2 에서 Benozzi et al. 이보고 한 것과 유사한 절차로 분석 된 제품 목록 . 32 , Farneti et al. 33 , 36 및 Romano et al. 28 이보고됩니다.
식품 매트릭스 견본의 수와 종류 참고
사과 저자는 190 종의 수확물로 구성된 수집 물을 선별했으며, 오래된 사과 품종과 새로운 사과 품종으로 구성되었다 33
요거트 4 개의 스타터는 요구르트의 유산 발효 중에 방출 된 VOC의 관점에서 분석되었다 (A, FD-DVS YF-L812 Yo-Flex, 한센, B, FD-DVS YC-380 Yo-Flex, 한센, C, FD -DVS YC-X11 Yo-Flex, 한센, D, YO-MIX 883, Danisco) 32
커피 단일 순수 Arabica 커피 블렌드에서 얻은 3 가지 다른 종류의 분쇄 커피가 사용되었습니다 : 중간 로스트, 짙은 로스트 및 카페인없는 중간 로스트 28

도표 2 : 분석되는 제품의 명부. Benozzi 등이 보고 한 것과 유사한 절차로 분석 된 제품 목록 . 32 , Farneti et al. 33 , 36 및 Romano et al. 28

2. 실험 설계 및 실용주의 사항

  1. 적어도 3 일간의 생물학적 복제본을 수행하십시오.각각의 실험 모드에 대해 세 개의 기술 복제본을 사용합니다.
  2. 샘플 인큐베이션 및 분석 전에, 각 바이알에 대해 청정 공기로 헤드 스페이스를 200 sccm에서 1 분 동안 세척하십시오.
  3. 모든 실험 모드에 대해 공란을 준비하고 표본과 동일한 조건에서 공시 품을 분석하고 분석하십시오.
  4. 분석을 위해 샘플 / 블랭크의 순서를 무작위로 지정하십시오.
  5. 휘발성 유기 화합물 (VOC)을 검출하는 데 사용되는 다른 방법과 마찬가지로, 장비를 사용하기 전에 향긋한 개인 위생 용품 및 껌과 담배 사용을 제한하십시오. 실험실의 모든 휘발성 화학 물질을 단단히 막고 테스트 중 가능한 한 공기 드래프트를 제어하십시오 37 .

3. PTR-MS 장비 최적화 및 분석

주 : 장치 조건은 참고 문헌에 기술되어있다 ( 예 : Makhoul 등 27 ).

  1. commerci로 샘플의 헤드 스페이스 측정 수행표준 구성 모드에서 PTR-ToF-MS 장치로 전송합니다.
  2. 별도의 조치없이 공기를 PTR-MS 드리프트 튜브 헤드 스페이스에 직접 주입하십시오. PTR-MS를 통해 샘플 공기가 지속적으로 흐르기 때문에 PTR-MS 흡입구의 끝을 샘플 헤드 스페이스에 간단히 삽입하여 주입 할 수 있습니다.
  3. 드리프트 튜브의 다음 이온화 조건을 설정하고 지속적으로 확인하십시오. 110 ° C 드리프트 튜브 온도, 2.30 mbar 드리프트 압력, 550 V 드리프트 전압. 이것은 약 140 Td (1 Td = 10 -17 cm 2 V - 1 s - 1 )의 E / N 비를 이끈다. 입구 라인은 110 ° C에서 가열 된 PEEK 모세관 (내경 0.04 인치)으로 구성됩니다. 기본적으로 입구 흐름을 40 sccm으로 설정하십시오.
  4. ToF 수집 채널 당 샘플링 시간을 0.1 ns로 설정합니다. m / z = 400까지의 질량 스펙트럼에 대해 350,000 채널에 해당합니다. 모든 단일 스펙트럼은 35,600 회의 연속 수집의 합계입니다1 μs의 시간 분해능을 갖습니다.
    참고 : 스펙트럼은 계속해서 저장됩니다. 분광 신호는 백그라운드 레벨에서 몇 초 만에 안정한 값으로 증가하고 (입구 라인의 가스를 교체하는 데 필요한 시간)이 과도 현상 이후에 획득 된 스펙트럼 만 추가 분석에서 고려됩니다.

4. 맞춤형 데이터 분석

참고 : 맞춤형 데이터 분석은 MATLAB의 절차를 사용하여 개발되었습니다.

  1. Cappellin et al. 에 의해 기술 된 포아송 (Poisson) 통계에 기초한 방법론을 통해 이온 검출기 데드 타임으로 인한 카운트 손실을 보정하십시오 . 10 .
  2. Cappellin et al. 에 의해 기술 된 절차에 따라 내부 교정을 수행하십시오 . 38 를 사용하여 질량 정확도 (최대 0.001 Th)를 달성하십시오.
  3. 얻은 스펙트럼 데이터를 참조 표준의 조각화 데이터 및 데이터 r과 비교하는 복합 주석을 수행합니다.과학 문학에 열중하고있다.
  4. Cappellin et al. 에 따라 노이즈 감소,베이스 라인 제거 및 피크 강도 추출을 수행하십시오 . 39 , 봉우리에 맞게 수정 된 가우스를 사용합니다.
  5. Lindinger et al. 에 의해 기술 된 공식을 통해 ppbv 단위의 피크 강도를 계산하라 . 5 , 기초 화합물이 알려지지 않은 경우 반응 속도 계수 (k = 2.10 - 9 cm 3 s - 1 )에 대해 적절한 반응 속도 계수 또는 상수 값을 사용하십시오. 후자는 실제 계수가 알려지면 계산 될 수있는 최대 30 %의 체계적인 오차를 도입합니다 40 .
  6. Principal Component Analysis, 분산 분석, Tukey의 post-hoc 테스트 및 R을 사용하여 개발 된 기존 패키지를 적용하는 기타 통계 테스트 / 분석을 수행하여 데이터를 마이닝합니다 ( 예 : Cappellin et al. 10).

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결과

시료의 휘발성 프로파일로 인해 매초마다 원하는 질량 범위에 대한 완벽한 질량 스펙트럼이 생성되었습니다. 도 2 에서, 요구르트 온라인 바이오 프로세스 동안 획득 된 평균 스펙트럼의 예가 32 로 주어져있다. 모든 스펙트럼에서 최대 250Th 범위의 300 개 이상의 피크가 확인 될 수 있습니다 32 .

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토론

비행 시간 (ToF) 질량 분석기에 결합 된 양성자 전달 반응 - 질량 분석 (PTR-MS)은 휘발성 유기 화합물의 식별 및 정량화의 필요성과 신속한 분석 프로파일 링의 필요성 사이에서 유효한 절충안입니다. ToF 질량 분석기를 특징 짓는 높은 질량 분해능은 관련 정보 및 관련 민감도 및 질량 스펙트럼을 제공합니다. 또한 PTR-ToF-MS 응용 프로그램과 자동 샘플러 및 맞춤형 데이터 분석 도구를 결합하여 자동화...

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공개

The authors have nothing to disclose.

감사의 말

This work is supported by the European Commission's 7th Framework Programme under Grant Agreement Number 287382. SY is a beneficiary of a European Commission's 7th Framework Programme Grant Agreement Number 287382. IK is a beneficiary of a FIRST doctoral school grant from the Fondazione Edmund Mach. For his work at University of Foggia, VC is supported by the Apulian Region in the framework of 'Future In Research' program (practice code 9OJ4W81).

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
PTR-TOF 8000 High-Resolution PTR-TOF-MSIonicon Analytik Ges.m.b.H.PTR-TOF 8000An detector for volatile organic compounds (VOCs) that allows for continuous VOC quantification with a very high mass resolution
GERSTEL MPS 2XLGerstelA multifunctional autosampler 
Gas Calibration UnitIonicon Analytik Ges.m.b.H.GCU-s / GCU-aA dynamic gas dilution system that provides variable but known quantities of different standard compounds in a carrier gas stream
TofDaqTofwerk AGfree available at http://soft.tofwerk.com/   A data acquisition software (for spectra  acquisition)
MATLAB MathWorkshttp://it.mathworks.com/products/matlab/A technical computing language and interactive environment for algorithm development, data visualization, and data analysis
RThe R Foundationfree available at https://cran.r-project.org/mirrors.html  A language and environment for statistical computing and graphics

참고문헌

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