접근 방법은 등쪽 뿌리 신경절 뉴런의 정렬 및 수초를 강화하는

요약

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

초록

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

서문

신경 손상에서, 근위 및 원위 신경 그루터기는 종종 인해 병변 사이트에 ^1-2로 신경 다발의 직접 재배치 방지 할 수있다. 일반적으로, 축삭 책자는 연결의 복잡한 네트워크를 형성 축삭의 높은 순서 정렬 번들로 구성된다. 그러나, 신경 재생이 제대로 구성 축삭 정렬 ^3-4으로 인해 혼란스러운 과정이다. 따라서, 병변 부위를 해소 축삭 재생의 충분한 수를 생성하는 것이 아니라 축삭 조직 배향을 유도 할 필요가있다. 또한, 탈수 초화는 부상 사이트에서 myelinating 세포의 죽음으로 인한 신경 손상을 수반. 탈수 초화가 강하게 축삭 생존의 도전 능력을 손상 때문에, 탈수 초화를 대상으로 또는 재유 수화를 촉진 치료는 신경 손상 ⁽⁵⁾ 후 기능 회복을 위해 중요하다. 따라서이 프로토콜의 목적은 두 가지 문제를 해결하는 설계 방법을 예시하는 것이다신경 재생의.

재료의 물리적, 기계적 성질, 상이한 축을 따라 측정 할 때의 차이로 정의되는 표면 이방성은 셀의 배향의 성장 및 이동 ^{6-7 영향을인가하고있다.} 지형뿐만 아니라, 이방성을 유도하는 다른 방법이있다. 이전에, 우리는 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 멤브레인의 기계적 정적 사전 스트레치에 의해 유도 된 표면 이방성을 조사 하였다. "큰 부과 작은 변형 SUPER"이론은 세포가 연신 방향 감지 유효 강성은 수직 방향과 다른 것을 예측하고 효과적인 강성 차이는 이방성 ^8면에 기인한다. 미리 연신 PDMS 막에서 배양 된 중간 엽 줄기 세포 (MSC들)을 적극적 표면 당겨 그 결과 이방성을 감지 전 연신 방향 ^(9)으로 정렬 할 수있다. 마찬가지로, 이방성 표면 AR기계 사전 뻗어면에서 유망한 것은 후근 신경절의 정렬뿐만 아니라 성장과 수초 (DRG) ¹⁰ 축삭에 영향을 미칩니다. 여기에서 우리는 축삭 재생 ^(10)을 향상시키기 위해 정적 사전 뻗어 PDMS 기판에 표면 이방성을 유도하기위한 프로토콜을 제공합니다.

축삭 정렬, 원하는 패턴 위상 기능을 유도하기 위해 정렬 섬유 및 채널 ^6,11-12를 통해 연락처 지침을 제공하는 것으로보고, 축삭 정렬 ^{11,13을 용이하게} 입증되었다. 그러나, 섬유, 채널 및 패턴 등의 위상 기능을 통해 축삭 정렬을 유도하는 기술을보고, 길게과 축삭의 두께를 증가 할 수 없습니다. 반면에, 기계는 점진적 스트레치 ^(14)의 크기를 증가 길고 두꺼운 축색과 스트레칭 방향으로 정렬 축삭 연신되었다. 그러나, 생체 내에서 모터 구동 장치를 포함하는 것은 아니다실행할 수 있는. 반대로, 정적 프리 연신 유도 이방성은 덜 복잡하고보다 용이하게 생체 내 응용 프로그램의 장래 지지체 디자인에 혼입 될 수있다.

이 프로토콜에서, 고정 전 신장 세포 배양 시스템은 위상 기능이없는 표면 이방성을 유도하기 위해 사용된다. 막 프레임 상에 고정되고 소정의 스트레칭 정도는 연신 단계에 적용 그러자 예비 연신 배양 시스템하는 PDMS 막, 신축성 프레임 및 연신 단계로 구성된다. 최대 21 일간 전 배양 연신 표면에 갓 절연 DRG 신경 세포 축삭 정렬 및 두께에 대해 모니터링된다. 그 후, 슈반 세포 (희주) 수초에 대한 모니터링 정렬 된 축삭와 공동 배양. 사전 스트레칭에 의한 표면 이방성을 통합함으로써 우리는 중간 엽 줄기 세포 및 DRG 뉴런 각각 ^{9 ~ 10의} 세포 정렬 분화 및 축삭 정렬 성장을 향상 할 수 있었다.

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프로토콜

세포의 분리에 관한 모든 절차는 미시간 주립 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

사전 뻗어 이방성 표면의 1. 준비

1. 베이스와 경화제의 1 용액과 조직 배양 접시 (12cm 직경)로 혼합물을 부어 : 10을 섞는다. 4,900 mg의베이스와 총 가교 혼합물에 대한 경화제 490 mg을 사용합니다.
2. 기포를 제거하기 위해 20 분 동안 진공 하에서 겔 혼합물을 유지한다.
3. 60 ° C에서 밤새 경화 오븐에서 혼합 겔을 놓습니다.
4. PDMS의 막을 경화 한 후, 165 mTorr의 3 분의 _2와 O 65 sccm의 흐름을위한 플라즈마 클리닝 / 에칭 시스템을 사용하여 산소 플라즈마로 표면을 처리한다.
5. 인식되는 것은 어느 쪽하는 산소 처리하는 동안, 접시에서 직사각형 막 (5 × 3.5 cm)의 조각을 잘라 확인 산소 처리 된면이 직면을하고 스트레칭 프레임에 고정합니다. A의 프레임을 배치 무대를 스트레칭과 균등하게 10 % 신장에 도달 할 때까지 무대에 노브를 돌려 스트레칭 (또는 다른 미리 정해진 스트레칭, 신장 직접 연신 단계에서 읽을 수 있습니다) 긴 축 ^9. 프레임의 나사를 조여 스트레칭을 수정합니다.
6. 무대에서 프레임을 제거합니다. 막 표면이 건조하고 먼지가 무료입니다 확인 후 막에 단단히 부착 챔버의 접착면을 허용하는 막에 실리콘 실을 배치합니다.
   주 : 실리콘 챔버는 PDMS 막에 셀 매체를 유지하기위한 우물을 제공한다. 장치 설계는도 1에 도시되어있다.
7. 10 분 동안 UV와 표면을 소독.
8. 추가 1 ml의 폴리 -L- 라이신 플라즈마 처리 6 시간 내에 상기 챔버 내부의 PDMS 표면 (PLL) (인산염 완충 염수 중 0.01 %), 37 ℃에서 2 시간 동안 부화 DRG 신경 세포를 파종 전에. 이 세포 부착을 향상시킵니다.

DRG의 제작 "> 2. 격리

1. DRG 뉴런 표준 성장 매체를 준비합니다.
2. 단리하기 전에, 분리 장치 및 필터 시약 압력솥. 6 잘 플레이트 잘 하나에 분리 버퍼의 5 ML을 추가하고, 얼음에 플레이트를 놓습니다. 9 ml의 0.05 %의 트립신 - EDTA (1 ㎎ / ㎖)에 콜라게나 A (500 U / ㎖) 1 ㎖를 추가하여 해리 배지 10 ㎖를 준비 얼음에 0.22 μm의 필터와 장소 솔루션을 필터링 할 수 있습니다.
3. 절연 7 일 '된 흰쥐 - 열 다섯 열둘을 사용합니다. 75 % 이소프로판올 새끼 스프레이 및 잘린 희생.
4. 뒤쪽에서 척수를 덮는 피부를 절개하고 척추 주위에 초과 조직을 제거합니다. 에 수술 스폿 조명 수술 돋보기에서 한 컷 가위로 양쪽에서 척추를 따라 다음 목에서 첫 번째 절개를합니다. 새끼의 몸에서 척추를 분리하고 과도한 근육을 제거합니다. 그런 다음, 경도 따라 절단 가위를 사용척추와 사용 핀셋의 g 축이 완전히 척추를 열고 멸균 15 ML 튜브로 절연 버퍼와 DRGs를 전송하는 큰 구멍을 만드십시오 피펫에서 척추 cord.Remove에게 팁을 추출합니다.
5. 핀셋의 벌금 쌍을 사용하여 뼈 주머니에서 신경절을 제거하고 약 10 수집 - 양쪽에서 16 DRG를. 신경 뿌리를 손질하고 얼음처럼 차가운 분리 버퍼에 신경을 전송합니다.
6. 멸균 15 ML 튜브로 절연 버퍼와 DRGs를 전송하는 큰 구멍을 만드십시오 피펫에서 팁을 제거합니다. 화학 분리 한 후, 원심 분리기 900 XG에 5 분 동안 4 ℃에서 신경절.
7. 조직이 튜브 바닥에 침전 부드럽게 상부에 분리 완충액을 제거하고 분리 관에 배지 10 ㎖를 추가하자.
8. 10 분 - 튜브 매 5 진탕하면서 1 시간 동안 37 ° C의 물을 용기에 해리 배지에서 해부 조직을 인큐베이션.
9. 후화학 물질 분해, 원심 분리기 900 XG에 신경 및 5 분 동안 4 ° C.
10. 상층 액을 제거하고 10 ml의 표준 성장 미디어와 소용돌이의 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
11. 다시 섹션 2.9에서 나타낸 바와 같이, 해리 된 세포를 원심 분리기.
12. , 상층 액을 제거 표준 성장 미디어와 소용돌이의 12 ml의의 펠렛을 다시 일시 중지합니다.

사전 뻗어 표면에 DRG 3. 문화

1. 세포를 시딩 챔버에서 PLL 용액을 제거하고 멸균 공기 건조하여 PDMS 표면을 린스하기 전에.
2. 2 분 파편이 튜브의 바닥에 정착 할 수 있도록 - 세포를 다시 일시 중단 후 1 서스펜션 설정을 할 수 있습니다. 각 스트레칭 챔버에 세포 현탁액의 1.5 ML을 추가하고 5 % CO _2에서 37 ° C에서 품어.
3. 10 μL (15 μL) 플루오로 -2- 데 옥시 우리 딘 및 우리 딘 (FDU-U) 주식의 soluti의 혼합물을 추가, 체외에서 일일 (DIV)에서, 아교 세포를 제거하려면(재료의 표 참조) 물론 각에. 7 시간 후, 신선한 표준 성장 매체와이 매체를 교체하고 5 % CO _2와 37 ° C 배양기에서 사전 뻗어 문화 장치를 배치합니다.
4. 세포 배양 기간 동안 (2 - 3 주), 신선한 배지로 절반을 보냈다 매체를 대체하여 매 2 일 매체를 변경합니다. 참고 : 2 주 동안 뻗어 미연 신 표면에 배양 한 후, 정제 SCS는 챔버에 추가되고 다른 주 (단계 4.7) 배양.

사전 뻗어 표면에 DRG 신경 세포와 슈반 세포 (희주)의 4. 공동 문화

1. 박사 캄파의 그룹 이전에 ^(15)에 의해 설명 된 바와 같이 희주를 분리합니다.
   1. 요약하면, 1 일 이전 강아지에서 희주을 격리 할 것. 수집하고 기계적으로 좌골 신경 화학적 (트립신 - EDTA와 콜라게나 A) 모두와 (18 게이지 바늘 / 10 ML의 주사기) ¹⁵ 해리.
   2. 폴리 D 라이신 (PDL) 공동으로 해리 세포를 시드5 % CO _2에서 37 ° C에서 ated T25 플라스크 문화. 5 일째에, 안티 네 1.1 항체 및 토끼 보체를 사용하여 항체의 선택을 통해 세포를 정제 및 통로 (2) 정제 된 세포를 계대 배양 - 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM), 10 % 소 태아 혈청을 함유 4. 배양 배지 (FBS) 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (펜 / 연쇄상 구균), 21 μg의 / ㎖ 소 뇌하수체는 (BPE)를 추출, 4 μM 포스 콜린.
2. SCS에에서 배지를 제거하고 플라스크에 5 ml의 0.05 % 트립신 - EDTA를 추가합니다. 3 분 - 2 5 % CO _2에서 37 ° C에서 세포를 품어.
3. 들이 플라스크에서 올려이라면 참조 배지 5 ㎖를 추가하고, 플라스크 내의 세포와 혼합하여 10 배 대물 렌즈를 사용하여 광학 현미경으로 세포를 확인한다.
4. 200 XG에 15 ML의 원심 분리기 튜브와 원심 분리기에 세포 현탁액을 추가하고 5 분 동안 20 ° C.
5. 상층 액을 제거하고 7 ㎖의 표준 DRG 성장 의대에 펠렛을 재현 탁아이오와.
6. , 0.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 세포 현탁액 10 μL을 트리 판 블루 10 μL와 혼합 한 다음, 10 배 대물 렌즈를 사용하여 광학 현미경 하에서 혈구를 이용하여 세포 수를 카운트. DRG 성장 배지를 첨가하여 5,000 ml의 세포의 세포 현탁액을 희석.
7. 연신 실에서 DRG 문화에서 매체의 0.5 ml의를 제거하고 DRG 문화에 SC 현탁액 0.5ml를 추가합니다.
8. 문화 37 ° C, 5 % CO _2. 변경에 일주에 대한 세포 미디어 DRG에 대한 새로운 표준 성장 매체와 반 동안 매체를 대체하여 이틀. 일주 공동 배양 한 후, 프로세스 면역 조직 화학 ^(10)에 의해 세포.

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결과

사전 신장 세포 배양 시스템 DRG 축삭 배향 ^(10)을 추진. DRG 뉴런 12 일 동안 사전 뻗어 미연 신 표면에 배양 하였다. 축삭은 정렬을 입증하는 β-III-tubulin에 대한 염색 하였다. (2) 문화의 12 일 후 사전 뻗어 미연 신 PDMS 기판에 축삭 방향을 비교 한 그림. 그들은 임의의 배향을 보여 미연 신 PDMS 기판상의 상호 연결된 네트워크를 형성하는 반면, ...

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토론

사전 뻗어 표면에 축삭 배향을 유도하기 위해 두 가지 중요한 단계가 있습니다 : 1) PDMS 막을와 균일 한 두께의 평면이어야합니다 2) 신경 교세포가 DRG로부터 제거되어야한다. PDMS의 가교제와 혼합하고 오븐에서 경화 후, PDMS 가교 겔 평평한 작업대 위에 보관 및 틸팅을 피하기 위해주의 깊게 취급되어야한다. 플라즈마 처리 후 (세포 부착을 위해 요구되는) 표면의 친수성이 시간에 감쇠 이후 PDMS 막?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal Medium 1x	GibcoBRL	21103-049
B27 Supplement 50x	GibcoBRL	17504-044
Glutamax-I 100x	GibcoBRL	35050-061
Albumax-I	GibcoBRL	11020-021
Nerve Growth Factor-7S	Invitrogen	13290-010
Penicillin-streptomycin	GibcoBRL	15140-122
0.05% Trypsin-EDTA/1 mM EDTA	GibcoBRL	25300-054
Poly-L-Lysine	Trevigen	3438-100-01
Poly-D-Lysine	Sigma	p-6407
Fluoro-2 deoxy-uridine	Sigma	F0503
Uridine	Sigma	U3003
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen	14170-112	Isolation Buffer
Type I Collagenase	Worthington	LS004196
DMEM	Gibco	11885
Heat inactivated Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30080.03
BPE	Clonetics	CC-4009
Forskolin	Calbiochem	344270
Silicone chamber	Greiner bio-one	FlexiPERM ConA
Plasma cleaning/etching system	March Instruments	PX-250
Anti-Thy 1.1 antibody	Sigma- Aldrich	M7898
Rabbit Complement	Sigma- Aldrich	S-7764
Standard growth medium			For 500 ml Neurobasal Medium 1x, add 10 ml of B-27 50x, 5 ml of Glutamax-I 100x, 2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF-- 7S (50 μg/ml).
FDU Uridine stock solution			FDU 100 mg in 10 ml of ddH2O (10 mg/ml), filter in the hood and divided in 500 μl aliquots and store at -20 ºC. Uridine 5 g in 166.7 ml of ddH2O (33 mg/ml), filter in hood, divide in 200 μl aliquots and store at -20 ºC. Take 61.5 μl of FDU (10 mg/ml) and 20.5 μl of Uridine(33 mg/ml), and add 4,918 μl of ddH2O to a final stock concentration, then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC.