높은 처리량 시퀀싱을 활용하여 전체 - 단백질 포화 돌연변이 유발 도서관의 기능 평가를위한 프로토콜

요약

우리는 높은 처리량 시퀀싱을 이용하여 단백질의 종합적인 단일 사이트 포화 돌연변이 라이브러리의 기능 평가를위한 프로토콜을 제시한다. 중요한 것은,이 방법은 라이브러리 구축 및 시퀀싱을 다중화하는 직교 프라이머 쌍을 사용한다. 암피실린의 임상 적 투여 량에서 선택 TEM-1 β-lactamase를를 사용하는 대표적인 결과가 제공된다.

초록

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 β-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to β-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

서문

돌연변이 긴 생물학적 시스템과 진화의 성질을 연구하고, 향상되며 신규 한 기능 돌연변이 단백질 또는 생물체를 생성하기 위해 실험에 사용되었다. 초기 접근 방식은 생물의 무작위 돌연변이를 생산하는 방법에 의존하지만, 재조합 DNA 기술의 출현은 사이트 별 방식으로 DNA에 대한 선택의 변화, 즉., 부위 특이 적 변이 ^{1, 2를} 소개하고 연구 할 수 있었다. 현재의 기술은, 일반적으로 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 돌연변이 유발에 올리고 뉴클레오티드를 이용하여, 주어진 유전자 돌연변이 ^3,4- 적은 수 (예., 점 돌연변이)를 작성하고 평가하기가 비교적 용이 한 것이다. 이것은 훨씬 더 어렵고 그러나 때 목표 방법, 예를 들면, 제작 및 평가 모두 가능한 단일 사이트 (또는 고차) 돌연변이.

많은 반면 m 다수의 평가하려 초기 연구에서 알게 된유전자 utations는 사용 된 기술은 ^5-7 균주 독립적 넌센스 감지기를 사용하여 각 돌연변이의 평가를 필요로하는, 예를 들면, 종종 힘들고되었는지 또는 인해 생거 시퀀싱 ^(8)의 저 시퀀싱 깊이로 그 정량 능력을 제한 하였다. 이러한 연구에서 사용 된 기술은 주로 높은 처리량 시퀀싱 기술 ^9-12를 이용하는 방법에 의해 대체되어왔다. 라이브러리 전의 이러한 개념적으로 간단한 접근 기능을위한 화면이나 선택에 라이브러리를 실시 돌연변이의 다수를 포함하는 라이브러리를 생성 수반하기 다음 깊은 시퀀싱 (예.,> 10 ⁶ 서열의 순서 판독) 선택 후. 이러한 방식으로, 돌연변이 다수의 표현형 적합성 효과, 각 돌연변이의 인구 주파수의 변화로서 표현 동시에 더욱 정량적으로 평가할 수있다.

우리는 이전에 SIMP 소개(. 즉, 전체 단백질 포화 돌연변이 라이브러리) 단백질 모든 가능한 단일 아미노산 돌연변이 라이브러리를 평가하는 해당 긴 서열보다 길이 유전자를위한 제작 방법 길이 ^{11,13 읽기} : 첫째, 각 아미노산 위치는 랜덤 화 에 의해 돌연변이 PCR을 현장 지시했다. 이 과정에서 유전자 시퀀싱 플랫폼에 의해 수용 총 길이 인접한 위치로 이루어지는 그룹들로 분할된다. 각 그룹의 돌연변이 PCR 제품은 결합하고, 각 그룹이 독립적으로 선택 및 높은 처리량 시퀀싱을 실시한다. 시퀀스 및 시퀀싱 판독 길이 돌연변이의 위치와의 대응 관계를 유지함으로써, 이러한 접근 방식은 최대화 시퀀싱 깊이의 장점을 갖는다 :. 하나는 단순히 그룹 (예를 들어, 표준 산탄 의해으로 분할하지 않고 짧은 창에서 그러한 라이브러리 시퀀스 수 있지만 시퀀싱 방법)이 대부분의 야생형 따라서 m 것이다 수득 읽기낭비 시퀀싱 처리량 ajority (80 최소 % 100 아미노산 (300 BP) 창에서 서열 500 아미노산 단백질의 전체 단백질 포화 돌연변이 라이브러리의 예는 야생형 서열 것이다 판독).

여기에서, 프로토콜은 (도 1에 설명) 상기 방법을 이용하여, 전체 단백질 포화 돌연변이 라이브러리의 기능 평가를위한 높은 처리량 시퀀싱을 활용하는 제시된다. 중요한 것은 선별 또는 선택을 동시에 행하여들이 하나의 라이브러리로 다중화 될 수 있도록 각 시퀀스 그룹을 바코드하도록 라이브러리 클로닝 과정에 직교하는 프라이머의 사용을 소개하고 깊은 시퀀싱 디 멀티플렉싱. 시퀀스 그룹이 독립적으로 선택을 실시하지 않기 때문에,이 부하를 감소시키고, 각 돌연변이의 선택의 동일한 레벨을 경험할 것을 보장한다. TEM-1 β-lactamase에, 높은 수준의 내성을 부여하는 효소β - 락탐 항생제 (예., 암피실린) 박테리아는 ^14-16 모델 시스템으로 사용된다. 프로토콜은 E.에서 TEM-1의 전체 단백질 포화 돌연변이 라이브러리의 평가에 대해 설명한다 암피실린 임상 용량 (50 μg의 / ㎖) ^{(17, 18)에} 대한 대략의 혈청 수준에서 선택 하에서 대장균.

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프로토콜

참고 : 프로토콜의 개요는 그림 1을 참조하십시오. 프로토콜의 여러 단계 및 시약 ( "주의"로 표시) 안전 조치가 필요합니다. 사용하기 전에 물질 안전 보건 자료를 참조하십시오. 다른 지시가없는 한 모든 프로토콜 단계는 실온에서 수행된다.

1. 문화 미디어와 플레이트를 준비

1. 준비하고 1 L 정제수 100 ㎖ 슈퍼 최적 국물 (SOB 표 1) 오토 클레이브에 의해 멸균 1 L 루리아 - 베르 타니 배지 (LB, 표 2) 및 1 L LB 한천 (표 3). 별도로 준비하고 세 배양 플라스크 각 포함 1 패 (LB)을 살균
   참고 : 프로토콜 "물"을 의미 전반에 걸쳐 오토 클레이브 멸균 정제수를; SOB, LB와 LB 한천은 오토 클레이브 멸균 솔루션을 참조하십시오.
2. 70 % 에탄올 10ml에 0.12 g의 테트라 사이클린 히드로 클로라이드에 용해시켜 테트의 12 ㎎ / ㎖ 스톡을 준비한다. 0.2 μm의 필터와 저장소를 사용하여 소독4 °에서 C는 빛으로부터 보호.
3. 다음 50 ° C 및 쿨 LB 한천은 구정 주식의 1 ㎖ (12 μg의 / ㎖ 구정의 최종 농도)를 추가합니다. 빛으로부터 보호 실온에서 배양 접시와 시원한에 따르십시오. 4 ° C에서 보관은 빛으로부터 보호.

삼라만상 유전자 포화 돌연변이 유발 도서관 2. 건설

참고 : 프라이머; 완성 된 PCR, 제한 소화 및 결찰; 정제 된 DNA 시료는 -20 ° C에서 저장 될 수있다.

1. 돌연변이 프라이머를 설계
   1. 모든 가능한 아미노산을 각 아미노산 위치 mutagenize 위해 상보 돌연변이 프라이머 쌍을 디자인 (센스 / 안티센스는 순방향 및 / 역방향) 다음 지침 각 아미노산의 총수 :
      1. 아미노산에 대응하는 코돈 (N은 네 개의 뉴클레오티드 염기의 혼합물이며, S는 시토신의 혼합물 (C)과 구아닌 (G)이다) 프림과 중심 NNS 의해 돌연변이 될 대체어, 각 측면에 약 15 뉴클레오티드에 의해 형벌.
      2. 5 '및 3'용융 온도 (T _분) C 또는 G와 것을 종료 종료 약 70 ° C ³ 있는지 확인하십시오. 이 가이드 라인에 따라 NNS 돌연변이 유발 프라이머를 설계하는 계산 스크립트 NNS_PrimerDesign.m을 (보충 코드 파일 참조)를 사용합니다.
   2. 상용 소스로부터 주문 프라이머. 사용의 용이성을 위해,이를 96- 웰 플레이트 형식으로 합성 한 센스 돌연변이 프라이머 및 다른 안티센스 프라이머를 포함하는 플레이트를 한 세트로 50 μM을 물에 미리는 희석.
   3. 물 피펫 분지를 입력하고 세 96 웰 플레이트에 걸쳐 263 웰에 95 μl를 전송하는 멀티 채널 피펫을 사용합니다. 물을 함유하는 플레이트의 동족 웰 센스 돌연변이 프라이머를 함유하는 96 웰 플레이트에서 5 μl를 전송하는 멀티 채널 피펫을 사용하여 프라이머 2.5 μM 내지 20 배 희석.
   4. 반복프로토콜 단계 2.1.3 안티센스 돌연변이 유발 프라이머 희석.
2. 두 단계 PCR의 부위 - 특이 적 돌연변이 유발에 의해 각각의 아미노산 위치의 NNS 서브 - 라이브러리의 합성
   1. 제 1 라운드 돌연변이의 PCR을 수행합니다. 각 돌연변이 프라이머, 주형 및 프라이머 AatII_F 또는 AvrII_R 같은 pBR322_AvrII 플라스미드를 사용하여 25 ㎕의 PCR 반응을 준비 (프라이머 AvrII_R 페어링 센스 돌연변이 프라이머 및 프라이머 AatII_F 페어링 안티센스 돌연변이 유발 프라이머; 526 PCR들의 총). AatII_F 및 AvrII_R 시퀀스 재료의 표를 참조하십시오.
      1. 15 ml의 원추형 튜브에 표 4의 시약을 첨가하여 PCR "마스터 믹스"를 준비한다. 피펫 유역에 전송합니다. 세 96 - 웰 PCR 플레이트를 통해 263 웰에 15 μl를 전송하는 멀티 채널 피펫을 사용합니다. 동족 웰에 희석 센스 돌연변이 프라이머를 함유하는 96 웰 플레이트에서 10 μl를 전송하는 멀티 채널 피펫을 사용하여 난n은 PCR 플레이트.
      2. 96 웰 플레이트 씰 각 PCR 플레이트를 커버. 2 분 동안 200 XG에 원심 분리기.
      3. 열 순환기에 PCR 플레이트를 전송하고 다음 프로그램 실행 : 30 초 동안 98 ° C를; 20주기 : 10 초 동안 98 ° C, 20 초 동안 55 ° C, 1 분 동안 72 ° C; 2 분 72 ° C; 4 ° C에서 개최합니다.
      4. 희석 안티센스 돌연변이 프라이머를 함유하는 96 웰 플레이트 2.2.1.3 - 반복 프로토콜 2.2.1.1 단계.
   2. 두 번째 라운드 돌연변이의 PCR을 수행합니다. 각 아미노산 위치를 들면, 25 ㎕의 PCR 반응에 사용하는 프라이머 AatII_F 및 AvrII_R 및 혼합을 준비하고 템플릿 (263 PCR들의 전체)로 1 라운드 돌연변이 PCR 제품을 희석.
      1. 물 피펫 분지를 입력하고 세 96 웰 플레이트에 걸쳐 263 우물에 198 μl를 전송하는 멀티 채널 피펫을 사용합니다.
      2. 합하여 묽은 멀티 채널 피펫을 사용하여 각각의 아미노산 위치에 대한 돌연변이 PCR 제품을 100 배제 1 이송 물을 함유하는 플레이트의 동족 웰 센스 돌연변이 프라이머로부터 얻어진 PCR 산물을 함유하는 96 웰 PCR 플레이트 1 μL. 이어서 안티센스 프라이머 돌연변이에 기인하는 PCR 제품의 전송을 반복한다.
      3. 15 ml의 원추형 튜브에 표 5의 시약을 첨가하여 PCR "마스터 믹스"를 준비한다. 피펫 유역에 전송합니다. 세 96 - 웰 PCR 플레이트를 통해 263 웰에 24 μl를 전송하는 멀티 채널 피펫을 사용합니다. 혼합을 포함하는 96 웰 플레이트에서 1 μL를 전송하는 멀티 채널 피펫을 사용하여 PCR 플레이트에 동족 웰에 1 라운드 PCR 돌연변이에게 제품을 희석시켰다.
      4. 96 웰 플레이트 씰 각 PCR 플레이트를 커버. 원심 분리기에서 약 200 XG에 2 분. 전사 플레이트 열 순환기 및 프로토콜 단계 2.2.1.3과 같은 프로그램을 실행한다.
   3. 겔 전기 영동에 의해 제 2 라운드 돌연변이 PCR들의 결과를 분석 할 수 있습니다.모든 제품은 정확한 크기의 것을 확인하고 제품을 오염의 부재.
      1. 피펫 유역에 2 배 겔 로딩 염료 2 ㎖를 추가 한 다음 세 96 웰 플레이트에 걸쳐 263 우물에 6 μl를 전송하는 멀티 채널 피펫을 사용합니다. 염료를 함유하는 96- 웰 플레이트의 웰에 동족 2 라운드 PCR 돌연변이 제품을 함유하는 96 웰 PCR 플레이트에서 6 μL를 전송하는 멀티 채널 피펫을 사용한다.
      2. 0.2 μg의 / ml의 에티 디움 브로마이드 (주의)을 1.5 % 아가 로스 겔을 제조.
      3. 각 행의 첫 번째와 마지막 차선에로드 DNA 사다리. 그런 다음 프로토콜 단계 2.2.3.1에서 샘플의 10 μl를로드하는 멀티 채널 피펫을 사용합니다.
      4. 자외선 transilluminator가 40 분 및 이미지 100 V에서 젤을 실행합니다.
      5. 모든 샘플을 분석 할 때까지 2.2.3.4 - 반복 프로토콜은 2.2.3.2 단계를 반복합니다.
   4. 정확하게 dsDNA 정량 시약을 사용하여 각 NNS 서브 라이브러리 PCR 산물의 농도를 측정한다.
      1. 이전피펫 유역에 약 15 ml의 EB 버퍼입니다. 세 96 웰 블랙 벽, 분명 하단 분석 판을 통해 263 웰에 49 μl를 전송하는 멀티 채널 피펫을 사용합니다.
      2. 96- 웰 분석 플레이트의 웰에 동족 초당 단계 PCR 생성물 (프로토콜 단계 2.2.2) 1 μl를 전송하는 멀티 채널 피펫을 사용한다.
      3. 300 ㎕의 EB 버퍼에 2 NG / μL에 람다 파지의 DNA를 희석하여 DNA 농도 표준 곡선을 준비하고 (11 농도의 총) 1002년 배 희석합니다. 어떤 샘플을 포함하지 않는 이전 단계에서 96- 웰 분석 플레이트의 하나의 행의 첫번째 열과 열한 전사 50 μL; 열 두번째 열에 EB 버퍼의 50 μl를 (빈 시약)를 추가합니다.
      4. 시약의 75 μl를 추가하여 dsDNA 정량 시약을 준비 후 EB 버퍼 (15)를 가하여, 15 ML 원뿔 튜브 (재료의 표 참조). 튜브를 반전하여 혼합 한 후 피펫 유역에 전송할 수 있습니다. 빛으로부터 시약을 보호.
      5. 분석 플레이트의 각 웰에 제조 된 dsDNA 정량 시약 50 μl를 전송하는 멀티 채널 피펫을 사용한다. 상하 피펫 팅하여 섞는다. 빛으로부터 보호 5 분 동안 실온에서 번호판을 품어.
      6. 마이크로 플레이트 리더 표준 형광 파장 (0.1 초 여기 485 nm의 발광은 520nm)를 사용하여 각 샘플의 형광을 측정한다.
      7. 모든 샘플에서 시약 블랭크의 형광 값을 뺍니다. λ 파지 샘플의 형광 측정으로부터 표준 곡선을 생성한다. 각 형광 측정하여 표준 곡선을 사용하여 각 시료의 농도를 구한다.
3. 선택 NNS 벡터로 서브 - 라이브러리의 클로닝
   1. 다섯 NNS 서브 라이브러리 그룹으로 각각 NNS 서브 라이브러리 PCR 생성물 100 NG 섞는다. 제조업체의 지침에 따라하는 DNA 정제 키트를 사용하여 샘​​플을 정리 한 다음 DS를 사용하여 농도를 측정DNA 정량 시약.
      주 : 각 그룹 (NNS 서브 라이브러리 그룹 1 TEM-1 서열을 따라 이격 된 약 53 개의 연속 아미노산 위치들로 구성된다 - 78 79 - - (5)의 위치로 이루어진다 26 ​​132 133 - 183 184-236 및 237-290, 각각; 번호) 엠 블러 등 ^19에 따라..
   2. 각 NNS 서브 라이브러리 그룹의 벡터를 복제 만듭니다.
      1. 템플릿 (pBR322_OP1와 결합 AatII_OP1_R 등) AatII_OP5_R 및 플라스미드 pBR322_OP1-5 - 프라이머 AvrII_F 및 AatII_OP1_R를 사용하여, 표 6에 따라 다섯 100 μl의 PCR들을 준비합니다.
      2. 열 순환기 및 다음 프로그램 실행 이동 : 30 초 동안 98 ° C를; 25주기 : 10 초 동안 98 ° C, 20 초 동안 55 ° C, 15 분 동안 72 ° C; 2 분 72 ° C; 4 ° C에서 개최합니다. AatII_R 및 AvrII_F의 시퀀스 재료의 T는 수를 참조하십시오.
      3. 0.2 μg의 / ml의 에티 디움 브로마이드 (주의)을 1 % 아가 로스 겔을 제조.
      4. 각 PCR 샘플에 6 배 겔 로딩 염료의 20 μl를 추가합니다. DNA 사다리와 젤의 첫 번째 차선을로드; 샘플 사이 잘 적어도 하나를 건너 뛰는, 각 샘플의 전체 볼륨을로드합니다.
      5. 50 분 동안 100 V에서 젤을 실행합니다.
      6. 장파장 UV 조명 (주)를 이용하여 겔을 시각화. ~ 3500 염기쌍의 PCR 생성물을 함유 소비세 슬라이스; 의 microfuge 튜브를 분리 전송합니다. 젤 슬라이스를 -20 ℃에서 저장 될 수있다.
      7. 제조업체의 지시에 따라, 겔 추출 키트와 dsDNA 정량 시약을 사용하여 측정 농도를 이용하여 시료를 정제.
   3. 제한을 설정 모두 NNS 서브 라이브러리 그룹 (프로토콜 단계 2.3.1) 및 클로닝 벡터 (프로토콜 단계 2.3.2), 7 수 T에 따라 AatII과 AvrII 효소로 소화. 1 시간 동안 37 ° C에서 품어. 제조업체의 지침에 따라하는 DNA 정제 키트를 사용하여 샘​​플을 정리하고 다음 dsDNA의 quantita를 사용하여 농도를 측정기 시약.
   4. 결찰 반응은 동족 제한 소화 클로닝 벡터 (pBR322_OP1와 NNS 서브 라이브러리 그룹 1 등) 각각의 제한 소화 NNS 서브 라이브러리 그룹에 대한 표 8 다음 설정합니다. 1 시간 동안 실온에서 품어. 제조자의 지시에 따라 DNA 정제 키트를 사용하여 반응을 정리; 물 20 μL로 DNA를 용출.
   5. 라이브러리 효율 E.로 정제 결찰 반응의 전체를 변형 전기에 의해 대장균 세포.
      1. 해동 electrocompetent E. 대장균 세포 다음 장소 세포와 얼음에 정제 된 결찰 반응.
      2. 이전 10 μl를 각 정제 연결 반응에 세포를 해동 한 다음 전기 큐벳에 전송할 수 있습니다. 1.8 kV의에 Electroporate.
      3. 1 ml의 SOB에 재현 탁하여 세포를 복구 할 수 있습니다. 37 ° C에서 1 시간 동안 품어.
      4. 990 μl의 LB의 각 복구 문화의 10 μl를 재현 탁; LB 한천 플레이트 C에 100 μl를 확산ontaining 12 μg의 / ㎖ 구정. 번호판을 품어 O / 37 ° C에서 N (~ 16 시간).
      5. 각 복구 문화를 들면, 50 ml의 LB 50 μl를 구정의 재고와 250 ml의 문화 플라스크를 준비합니다. 복구 문화의 나머지 ~ 1 ml의 플라스크에 전송합니다. 격렬한 진동 (~ 200 RPM)와 37 ° C에서 O / N (~ 16 시간)을 품어.
   6. 각각의 접시에 콜로니의 수를 계산합니다. 성공적인 형질 전환 체의 수를 계산 여기서 콜로니의 수는, 인 복구 배양 부피 (1000 μL) 및 복구 문화의 볼륨 (1 μl를) 도금입니다.
      참고 : 성공적인 형질 전환 체의 수는해야한다 엄지 손가락의 규칙으로, 모든 돌연변이의 전체 범위를 보장하기 위해 ≥1예상되는 돌연변이의 수를 통해 00 배. NNS 각 서브 라이브러리는 ~ 53 위치를 가지므로 돌연변이의 예상 수는 32 × 53 위치 코돈 / 위치 ≈ 1.7 × 10 ^3이고; 라이브러리의 크기를 ≥100 배 (≥1.7 × ^105)를 제공하기 위해 각 접시에 ≥170 식민지가 있어야합니다.
   7. 제조업체의 지시에 따라, 플라스미드 정제 키트를 사용하여 배양 물로부터 플라스미드 DNA를 분리 한 후 dsDNA 정량 시약을 이용하여 농도를 측정한다. 함께 각 플라스미드 100 NG를 섞는다. 이것은 최종 전체 단백질 포화 돌연변이 라이브러리를 작성합니다.

항생제 내성에 대한 TEM-1 전체 단백질 포화 돌연변이 유발 도서관 3. 선택

1. 사전 선택 문화의 준비.
   1. 물에 0.5 NG / μL에 프로토콜 단계 2.3.7에서 플라스미드를 희석하고 microcentrifuge 관에 20 μl를 전송합니다. 다시, 변환을 수행covery, 도금 및 이전에 999 μL (LB)에 전송을 제외하고, 프로토콜 단계 2.3.5에서 SOB 복구 문화의 1 μl를 설명한 바와 같이 O는 / N 성장
   2. 콜로니의 수를 계산합니다. 모든 돌연변이의 전체 범위를 보장하기 위해 ≥10 ⁶ 성공적으로 형질 전환 ⁽¹⁰⁶ ≈ 32 코돈 / 위치 × 100 × 263 위치)를 나타내는 ≥100 식민지가 있어야합니다.
   3. 50 ML의 O / N 문화의 농도를 측정한다.
      1. 분광 광도계 큐벳에 1 ml의 LB를 추가하여 LB의 빈을 준비합니다. 분광 광도계에 OD600을 측정합니다.
      2. 900 μL (LB) 100 μl를 재현 탁하여 O / N 문화 10 배 희석 OD600을 측정합니다. 빈의 OD600 독서를 빼기와 O / N 문화의 OD600를 제공하기 위해 10 곱합니다.
   4. 37 ° C에서 ~ 30 분 동안 프로토콜 단계 1.1에서 세 개의 배양 플라스크를 미리 따뜻하게. OD600 = 0.1에 O / N 문화를 희석 한 플라스크 (최종 OD600 = 0.001)에 1 ml에 추가 할 수 있습니다. 티그의는 "사전 선택 문화"입니다.
   5. 격렬한 흔들림 (200 RPM)와 37 ° C에서 "사전 선택 문화"를 품어. 주기적으로 OD600 = 0.1 (~ 2.5 시간)까지 (문화 10 배 희석 할 필요가 없습니다) 프로토콜 단계 3.1.3에서와 같이 OD600를 측정하여 성장을 모니터링 할 수 있습니다.
   6. 두 50 ML 원뿔 튜브로 사전 선택 문화의 100 ㎖를 전송합니다. 4 ℃에서 6 분 동안 4,000 XG에 원심 분리기. 상층 액의 대부분을 제거하고 하나의 15 원뿔 튜브에 결합한다. 원심 분리를 반복하고 모든 상층 액을 제거합니다. -20 ° C에서 보관하십시오.
2. 암피실린 내성을위한 선택.
   1. 사전 선택 문화가 배양되는 동안, 10 ml의 물에 0.5 g 나트륨 암피실린을 용해하여 물에 앰프의 50 ㎎ / ㎖의 주식을 준비합니다. 4 ° C에서 0.2 μm의 필터와 저장소를 사용하여 소독.
   2. 다른 두 플라스크에, 12 mL의 μg의 / 최종 농도 및 예비 선택 배양 등 그쪽의 부피로 추가 테트 최종 OD600 = 0.001에서 t. 한 플라스크에 50 μg / ML의 최종 농도를 들어, 1 ml의 앰프를 추가 - 이는 "선택 배양"이다.
   3. 격렬한 흔들림 (200 RPM)와 37 ° C에서 문화를 품어. OD600 = 0.1 (~ 2.5 시간)까지 더 암피실린가 이전 단계에서 첨가하지 않은 문화의 성장을 모니터링합니다. 이 때, 또한 선택 문화의 OD600를 측정한다.
   4. 0.1로 선택 문화의 OD600를 나누고 100 ml로 곱합니다. 4 ℃에서 6 분 동안 4,000 XG에 50 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에이 볼륨 (~ 400 ml)에 전송합니다. 상층 액의 대부분을 제거하고 하나의 15 원뿔 튜브에 결합한다. 원심 분리를 반복하고 모든 상층 액을 제거합니다.
   5. 제조업체의 지시에 따라, 사전 - 선택 (단계 3.1.6 프로토콜) 및 선택 (프로토콜 단계 3.2.4) 배양 세포 펠렛으로부터 플라스미드 DNA를 분리 한 후 dsDNA 정량 시약을 이용하여 농도를 측정한다.

> 4 TLE. "고 처리량 시퀀싱은 돌연변이의 운동 효과를 확인하는 방법

1. 높은 처리량 시퀀싱을위한 시료의 준비
   1. 직교 프라이머와 NNS 서브 라이브러리 그룹을 해제 다중화하는 25 μl의 PCR들을 준비
      1. 표 9에 따른 PCR 마스터 믹스를 준비; 열 PCR 튜브에 23 μl를 전송합니다.
      2. 10-6을 튜브 (5)와 선택 문화에서 - 1 튜브를 PCR을 위해 사전 선택 문화에서 0.5 NG / μL 정제 된 플라스미드 DNA 1 μl를 추가합니다.
      3. 각 역 직교 프라이머 OP1_R와 OP5_F - - 함께 50 50 μM 앞으로 직교 프라이머 OP1_F의 μl를 혼합 OP5_R합니다. 같은 순서로, PCR 튜브로 전송 1 μL 1 - 5 6 - OP5_F 및 OP1_R - - OP5_R OP1_F의 시퀀스 재료의 10 페이지의 표.
      4. 열 순환기에 PCR 튜브를 전송합니다. 다음 프로그램 실행 : 30 초 동안 98 ° C를; 20주기 : 10 초, 55 ° 98 ° C20 초 동안 C, 15 분 동안 72 ° C; 2 분 72 ° C; 4 ° C에서 개최합니다.
   2. NNS 서브 라이브러리 그룹들 각각을 분리하는 25 ㎕의 PCR들을 준비
      1. -100 배 희석 PCR 튜브를 분리하는 각 1 μL를 전송 및 물 99 μl를 첨가하여 프로토콜 단계 4.1.1.4에서 열 PCR들을. 혼합 후 99 μL를 피펫 버린다.
      2. 각각의 역방향 프라이머 Group1_R와 Group5_F - - 함께 50 μM 앞으로 프라이머 Group1_F의 50 μl를 혼합 Group5_R합니다. 같은 순서로, 이전 1 μL 튜브를 PCR하는 1 - 5 6 - Group5_F 및 Group1_R - - Group5_R Group1_F의 시퀀스 재료의 10 페이지의 표.
      3. 표 9에 따른 PCR 마스터 믹스를 준비 각 PCR 튜브에 23 μl를 옮긴다. 열 순환기에 PCR 튜브를 전송; 프로토콜 단계 2.2.1.3과 동일 프로그램을 실행.
   3. 인덱싱 시퀀스를 추가 할 최종 25 ㎕의 PCR들을 수행
      1. 디류트 PCR 튜브를 분리하는 각 1 μL를 전송 및 물 99 μl를 첨가하여 프로토콜 단계 4.1.2.3에서 열 PCR들을 100 배. 혼합 후 99 μL를 피펫 버린다.
      2. 표 9에 따른 PCR 마스터 믹스를 준비 각 PCR 튜브에 23 μl를 옮긴다.
      3. 505_F 각각 - NNS 서브 라이브러리 그룹 1-5에서 발생하는 템플릿 튜브를 들어 501_F 튜브 앞으로 프라이머 0.5 μl를 전송합니다. 사전 선택 및 선택 배양 인한 템플릿 튜브, 튜브 당 0.5 ㎕를 각각의 프라이머와 701_R 702_R 역방향 전송. 501_F의 시퀀스 재료의 표를 참조하십시오 - 505_F 및 701_R 및 702_R합니다.
      4. 열 순환기에 PCR 튜브를 전송하고 단계 2.2.1.3에서 프로그램을 실행합니다.
   4. 혼합 및 샘플을 정화
      1. 측정 농도는 제조자의 지시에 따라 dsDNA 정량 시약을 사용. 각 PCR 제품 INT의 100 ng의 혼합OA 하나의 microcentrifuge 관.
      2. 0.2 μg의 / ml의 에티 디움 브로마이드 (주의)을 2 % 아가 로스 겔을 제조.
      3. 혼합 PCR 제품 샘플에 6 배 겔 로딩 염료를 추가합니다. DNA 사다리와 젤의 첫 번째 차선을로드; 샘플의 전체 볼륨을로드합니다.
      4. 50 분 동안 100 V에서 젤을 실행합니다. 장파장 UV 조명 (주)를 이용하여 겔을 시각화. ~ 360 염기쌍의 PCR 생성물을 함유 소비세 슬라이스; 튜브의 microfuge에 전송합니다. 젤 슬라이스는 -20 ° C에서 저장 될 수있다.
      5. 제조업체의 지시에 따라, 겔 추출 키트를 사용하여 시료를 정제하고 dsDNA 정량 시약을 이용하여 농도를 측정한다. 이 높은 처리량 시퀀싱에 대한 최종 샘플입니다.
   5. 높은 처리량 시퀀싱 플랫폼의 순서 (이 프로토콜에서 사용되는 플랫폼에 대한 재료의 표 참조).
      1. 뉴 멕시코로 시료 농도를 계산 여기서 NG 인 / μL의 샘플의 농도 및 시료 DNA (~ 360 염기쌍)의 시퀀스 길이이다. EB 버퍼 4 nm의 샘플을 희석.
      2. 샘플을 변성과 하이브리드 화 버퍼 9 시까 희석 제조업체의 지침을 따르십시오.
      3. 로드 시약 카트리지 내로 샘플을 600 μL. 제조업체의 지침 및 화면의 지시에 다음과 같은 순서.
2. 서열 데이터 분석
   1. 플래시 (Short의 빠른 길이 조정 읽고) ^{(20) 다운로드} 순서에서 얻은 fastq.gz 파일과 함께 폴더에 넣습니다.
   2. 사용 플래시는 한 쌍의 엔드에 해당하는 fastq.gz 파일 인덱스의 각 쌍에 대해 읽기 (순방향 및 역방향 사전 선택 및 선택 문화에 대한 각 NNS 서브 라이브러리 그룹에 대한 읽기) 가입.
      1. 명령 프롬프트를 엽니 및 변경 디렉토리 프로토콜 단계 4.2.1 폴더로 이동합니다. 명령을 사용하여 읽기의 각 쌍에 가입 : 플래시 , mates1.fastq.gz 및 mates2.fastq.gz는 앞으로이 포함 된 파일입니다 각각 읽어 역 위치.
   3. 읽기의 각 쌍에 가입 한 후, 사전 선택 또는 선택 문화의 결과를 별도의 폴더에 out.extendedFrags.fastq 출력 파일을 배치합니다. 에가 대응하는 (즉., 1.fastq, 2.fastq 등) NNS 서브 라이브러리 그룹에 따라 out.extendedFrags.fastq 출력 파일의 이름을 바꿉니다.
   4. 계산 스크립트 NNS_DataAnalyzer.m을 실행할 때마다 NNS 서브 라이브러리 그룹, 야생형 각 단일 아미노산 돌연변이에 대한 카운트와 카운트를 계산하기 위해 각각의 폴더 (보조 코드 파일을 참조).
   5. 피트니스 효과를 계산 각각의 돌연변이 각각의 위치에서 / 선택에서 얻어진 계수의 비의 기준 열 대수 (AS ) 예비 선택 대 ( 야생형에 비해) 조건 :
      .

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결과

직교 프라이밍 사이트를 포함하는 다섯 가지 변형 인 pBR322 플라스미드의 플라스미드지도 (pBR322_OP1 - pBR322_OP5)는도 2a에 도시된다. 직교 프라이머의 PCR은 다섯 pBR322_OP1-5 플라스미드와 함께, 각각의 직교의 프라이머 각 쌍을 사용하여 수행하거나, 모든 플라스미드를 뺀 직교 프라이머 쌍을 일치 플라스미드하고, 특정 여부를 테스트한다. 일치하는 플라스미드가 ...

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토론

여기 프로토콜은 높은 처리량 시퀀싱 기술을 사용하여, 전체 단백질 포화 돌연변이 라이브러리의 관능 평가를 수행하기 위해 설명된다. 상기 방법의 중요한 특징은 클로닝 과정에서 직교하는 프라이머의 사용이다. 간단히, 각각의 아미노산 위치는 무작위 돌연변이 유발 PCR로되고, 시퀀스 길이 결합 높은 처리량 시퀀싱에 의해 수용되는 위치의 그룹으로 함께 혼합 하였다. 이러한 그룹은 직교 프?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Typtone	Research Products Intl. Corp.	T60060-1000.0
Yeast extract	Research Products Intl. Corp.	Y20020-500.0
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-212
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333-500G
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506-500G
Agar	Fisher Scientific	BP1423-500
Tetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	T7660-5G
Petri plates	Corning	351029
MATLAB	Mathworks	http://www.mathworks.com/products/matlab/
Oligonucleotide primers	Integrated DNA Technologies	https://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos	25 nmol scale, standard desalting
pBR322_AvrII	available upon request		pBR322 plasmid modified to contain AvrII restriction site downstream of the TEM-1 gene
pBR322_OP1 – pBR322_OP5	available upon request		five modified pBR322 plasmids each containing a pair of orthogonal priming sites
Q5 high-fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0491L	includes 5x PCR buffer and PCR additive (GC enhancer)
15 ml conical tube	Corning	430025
Multichannel pipettes (Eppendorf ResearchPlus)	Eppendorf
PCR plate, 96 well	Fisher Scientific	14230232
96 well plate seal	Excel Scientific	F-96-100
Veriti 96-well thermal cycler	Applied Biosystems	4375786
6x gel loading dye	New England Biolabs	B7024S
Agarose	Research Products Intl. Corp.	20090-500.0
Ethidium bromide	Bio-Rad	161-0433
UV transilluminator (FOTO/Analyst ImageTech)	Fotodyne Inc.	http://www.fotodyne.com/content/ImageTech_gel_documentation
EB buffer	Qiagen	19086
96-well black-walled, clear bottom assay plates	Corning	3651
Lambda phage DNA	New England Biolabs	N3011S
PicoGreen dsDNA reagent	Invitrogen	P7581	dsDNA quantitation reagent, used in protocol step 2.2.4
Victor 3 V microplate reader	PerkinElmer
DNA purification kit	Zymo Research	D4003
Microcentrifuge tubes	Corning	3621
Long-wavelength UV illuminator	Fisher Scientific	FBUVLS-80
Agarose gel DNA extraction buffer	Zymo Research	D4001-1-100
AatII	New England Biolabs	R0117S
AvrII	New England Biolabs	R0174L
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202S
EVB100 electrocompetent E. coli	Avidity	EVB100
Electroporator (E. coli Pulser)	Bio-Rad	1652102
Electroporation cuvettes	Bio-Rad	165-2089
Spectrophotometer (Ultrospec 3100 pro)	Amersham Biosciences	80211237
50 ml conical tubes	Corning	430828
Plasmid purification kit	Macherey-Nagel	740588.25
8 well PCR strip tubes	Axygen	321-10-551
Qubit dsDNA HS assay kit	Invitrogen	Q32854	dsDNA quantitation reagent
Qubit assay tubes	Invitrogen	Q32856
Qubit fluorometer	Invitrogen	Q32866
Ampicillin sodium salt	Akron Biotechnology	50824296
MiSeq reagent kit v2 (500 cycles)	Illumina	MS-102-2003
MiSeq desktop sequencer	Illumina	http://www.illumina.com/systems/miseq.html	alternatively, one could sequence on Illumina HiSeq platform
FLASh software	John Hopkins University - open source	http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/	software to merge paired-end reads from next-generation sequencing data
AatII_F			GATAATAATGGTTTCTTAGACG TCAGGTGGC
AvrII_R			CTTCACCTAGGTCCTTTTAAAT TAAAAATGAAG
AvrII_F			CTTCATTTTTAATTTAAAAGGA CCTAGGTGAAG
AatII_OP1_R			ACCTGACGTCCGTATTTCAAC TGTCCGGTCTAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP2_R			ACCTGACGTCCGCTCACGGA GTGTACTAATTAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP3_R			ACCTGACGTCGTACGTCTGA ACTTGGGACTTAAGAAACCA TTATTATCATGACATTAAC
AatII_OP4_R			ACCTGACGTCCCGTTCTCGAT ACCAAGTGATAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP5_R			ACCTGACGTCGTCCGTCGGA GTAACAATCTTAAGAAACCAT TATTATCATGACATTAAC
OP1_F			GACCGGACAGTTGAAATACG
OP1_R			CGACGTACAGGACAATTTCC
OP2_F			ATTAGTACACTCCGTGAGCG
OP2_R			AGTATTAGGCGTCAAGGTCC
OP3_F			AGTCCCAAGTTCAGACGTAC
OP3_R			GAAAAGTCCCAATGAGTGCC
OP4_F			TCACTTGGTATCGAGAACGG
OP4_R			TATCACGGAAGGACTCAACG
OP5_F			AGATTGTTACTCCGACGGAC
OP5_R			TATAACAGGCTGCTGAGACC
Group1_F			ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNGC ATTTTGCCTACCGGTTTTTGC
Group1_R			GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC TTGCCCGGCGTCAAC
Group2_F			ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNGA ACGTTTTCCAATGATGAGCAC
Group2_R			GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNGT CCTCCGATCGTTGTCAGAAG
Group3_F			ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNAG TAAGAGAATTATGCAGTGCTGCC
Group3_R			GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC GCCAGTTAATAGTTTGCGC
Group4_F			ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNCC AAACGACGAGCGTGACAC
Group4_R			GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNGC AATGATACCGCGAGACCC
Group5_F			ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNCG GCTGGCTGGTTTATTGC
Group5_R			GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTAT ATGAGTAAACTTGGTCTGACAG
501_F			AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACTATAGCCTACAC TCTTTCCCTACACGAC
502_F			AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACATAGAGGCACA CTCTTTCCCTACACGAC
503_F			AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACCCTATCCTACAC TCTTTCCCTACACGAC
504_F			AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACGGCTCTGAACA CTCTTTCCCTACACGAC
505_F			AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACAGGCGAAGACA CTCTTTCCCTACACGAC
701_R			CAAGCAGAAGACGGCATAC GAGATCGAGTAATGTGACTG GAGTTCAGACGTG
702_R			CAAGCAGAAGACGGCATAC GAGATTCTCCGGAGTGACTG GAGTTCAGACGTG