골수 전구 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 T 세포 수용체 Retrogenic 마우스를 생성하는

요약

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

초록

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCRα and TCRβ chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

서문

인간 및 마우스의 T 세포 수용체 (TCR) 레파토리는 1 × ^108, 2 × ¹⁰⁶ 고유 TCR도 각각 ^1.2로 추정되었다. 이 넓은 다양성은 T 세포는자가 펩티드에서뿐만 아니라 항원 제시 세포 (APC를)의 주 조직 적합성 복합체 (MHC)에 의해 제공 병원체 유래의 항원 에피토프의 광대 한 배열을 인식 할 수있다. 독특한 펩타이드 MHC 단지와 TCR도의 상호 작용의 미묘한 차이는 T 세포가 사멸, 아네 르기, 활성화, 분화, 사이토 카인 생산 세포 독성을 받아야할지 여부를 지시. 그러나, 큰 TCR 레퍼토리 특정 TCR 특정 항원에 응답하는 방법의 분석은 하나의 TCR 시스템의 사용을 필요로한다.

다양한 TCR 유전자 변형 마우스를 생체 내 모델 ^3-9 단일 TCR의 기능을 연구하기 위해 생성되었다. 그러나, 포함하는 형질 전환 마우스를 TCR 할주의 사항이있다선정 된 하나의 트랜스 제닉 마우스 생식선 DNA ^(10)에 임의의 형질 전환 유전자 삽입 소위 창시자 효과를 생성하는 시간의 길이. 따라서, 비교적 적은 TCR 형질 전환 마우스는 임의의 주어진 항원에 대해 생성 된 동일한 에피토프에 대한 고 및 저 TCR 친화력의 기능적 의미는 거의 언급하지 않는다. 화면 빠른 접근을위한 필요성을 해결 개별적으로 또는 조합하여 복수의 TCR도 공부 (레트로 바이러스 '레트로'형질 전환에서 '제닉') retrogenic 마우스는 형질 전환 마우스 ^11-13 TCR의 대안으로 이용되어왔다.

여러 바이러스에서 발견 된 2A 펩타이드 합의 모티브 분열은 2A의 글리신과 2B의 프롤린 사이에 발생하는에서, 2A-ASP를-발 / 일드 - 공급 과잉-X-ASN-프로의 Gly-2B-프로 구성 시스 -acting 가수 분해 효소 활동에서 번역 ^10,14-16 동안 리보솜 건너 뛰기 결과. 은 C를 나타내는 상세한 다이어그램이러한 방식으로, 하나의 벡터 화학 양론 번역의 결과로 연결될 수 2 시스 트론 (TCR 알파와 TCR 베타) (12) -를 다양한 2A 펩티드 (F2A, E2A, T2A 및 P2A)의 leavage 참고 문헌 10를 참조하십시오. 이 방법을 활용하여, 우리는 표현하고 직접 생체 내에서 여러 항원 특정 TCR도 비교 할 수 있습니다.

프로토콜

윤리 정책 : 모든 노력이 조사와 꼬리 정맥 주사시 최소한으로 동물의 불편이나 스트레스를 유지한다. 마우스는 실험에서 세포의 공급원으로서 사용된다; 같은 어떠한 절차 나 조작은 안락사 따로 없습니다. 마우스는 죽음을 확인하기 위해 자궁 경부 전위 다음 CO ₂ 흡입에 의해 안락사됩니다. 이 절차는 미국 수의학 협회의 안락사에 대한 패널의 권고와 일치한다.

1. 레트로 바이러스가 구축 준비

1. 서브 클론 T 세포 수용체 (TCR) 알파 및 베타 사슬하는 MSCV 계 ¹¹ 레트로 바이러스 벡터 (예 pMIAII 또는 pMIGII) ^{(11)로하는} 2A 링커에 의해 분리된다.
   참고 : 2A 링커는 단일 오픈 리딩 프레임의 알파와 베타 TCR 체인의 화학 양론과 조화 된 표현이 가능합니다. 벡터는 사용하는 IRES 형광 단백질 카세트 (ametrine 또는 GFP)을 포함형질 도입 된 세포 및 형질 도입 효율을 추적. 자세한 프로토콜에 대한 홀스트 등을 참조하시기 바랍니다. ⁽¹¹⁾
2. 상업적으로 얻은 플라즈마 준비 키트 또는 유사한 제품을 사용하여 플라스미드 DNA를 분리합니다. 하나의 작업 농도 사용 - 2 μg의 μl를 ^-1.

레트로 바이러스 생산자 세포주의 2 세대

1. 레트로 바이러스 생산 세포주를 생성하기 위하여 두 단계의 과정을 이용한다.
   참고 :. 자세한 프로토콜은, 홀스트 등 ^(11)을 참조하시기 바랍니다.
   1. 세 플라스미드 (pVSVG, PEQ-Pam3 (-E) 및이자 ^(11)의 벡터) 293T 세포의 과도 형질 전환에 의해 레트로 바이러스를 생성하고, GP + E86 ecotropic 레트로 바이러스 생산 세포주를 형질 도입 할 293T 세포에서 레트로 바이러스 상등액을.
   2. FACS에 의해 형광 발현 GP + E86 프로듀서 세포의 상위 40 %를 분리하고 바이러스의 소스로 transdcuced-GP + E86 생산 세포를 전파.
      참고 : 생성고역가의 생산자들은 골수 세포의 효율적인 형질 도입 중요하다. 완전한 프로토콜 홀스트 등을 참조하시기 바랍니다. ⁽¹¹⁾

3. 레트로 바이러스 매개 줄기 세포 유전자 전송 (일 -5)

1. 10 % (부피 / 권) FBS이 프로토콜의 일 0으로이 합류 150 mm 플레이트 충분한 성장을 할 수 있도록 밖으로 해동하고 완전한 DMEM의 각 GP + E86 생산 세포주의 배양 0.5 -1.0 × 10 ^(6).
   참고 : 해동 0.5 - 또한 GP + E86를 확장하기 위해 문화의 오일을 허용이 날 5에서 50 % 컨 플루 - 10cm의 플레이트의 각 GP + E86 생산 세포주의 1.0 × 10 ⁶ 30 수 일 0으로이 합류 150 mm 플레이트에 생산​​ 세포주.
   1. 5 % 태아 송아지 혈청 및 마이코 플라스마 오염을 방지 할 시프로플록사신 (10 μg의 / ㎖)을 포함하는 전체 조직 배양 배지에서 배양 레트로 바이러스 생산 세포주.
      참고 : generatin 때 시프로플록사신의 사용을 중지g 골수 전달의 바이러스 상층 액. 이 부정적인 골수 전달 효율에 영향 바와 같이, 생산자 세포주의 과다 성장을 피한다.

5- 플루오로 우라실 (5-FU) (주 -3) 4.를 주입 기증자 마우스

1. 요구되는 5-FU의 양을 결정하기 위해 - (12 주 이전 5) 도너 마우스 무게. 낮은 골수 수율 나이 결과 오주 미만의 마우스를 사용. 단일 TCR의 발현을 보장하기 위해, 같은 SCID, RAG 또는 TCR 알파 골수 기증자로 결핍 마우스로 T 세포 결핍 마우스의 피로를 사용합니다.
2. 조직 배양 후드에서 작동하는 10 밀리그램 ml의 충분한 양 ^-1 체중 g 당 0.15 mg의 5-FU를 전달하는 5-FU의 작업 용액을 만들기 위해 멸균 PBS로 5-FU 스톡을 희석.
3. 37 G 바늘 1 mL를 주사기를 사용하여, 복강 공여자 마우스 당 체중 g 당 0.15 mg의 5-FU를 주입.
   참고 :받는 사람 당 사용 1 기증자 마우스 시작하고 조정셀 수율에 따라 기증자 마우스의 수. 골수 전구 세포의 농축 및 분리에 대한 5-FU 처리하는 다른 방법은 Viret 등의 알에 기재된 리니지 양성 세포의 네거티브 선택이다.

5. 골수 추출 절차 (일 0)

1. 뼈 격리를 위해 해부 가위와 집게를 가져옵니다. 50 ML 원뿔 튜브에 뼈를 수집 미디어 (HBSS 5 % FCS (부피 /의 부피와 보충)) 준비합니다. 얼음에 미디어를 포함하는 50 ML 원뿔을 유지합니다. CO에 의해 죽음을 확인하기 위해 자궁 경부 전위 다음 ₂ 흡입 쥐를 안락사. 더 반사가 감지되지 보장하기 위해 발을 꼬집어.
2. 수술 부위와 에탄올 또는 메탄올과 수술 도구를 소독. 먼저 절단 및 골반 거들에 따라 신중하게 대퇴골, 경골, 상완골, 골반 거들을 제거합니다. 다시 아래 경골의 대퇴골을 따라 잘라. 깨끗한 뼈를 얻기 위해 가위와 집게를 사용하여 모든 주변 조직을 제거합니다. 유지HBSS + 5 % (부피 / 부피의) FBS 수화 뼈.
3. 모두 각각의 뼈를 종료 잘라 확인하고, 관절에서 절단하여 뼈를 분리합니다. HBSS + 5 % (부피 / 부피)를 포함하는 10 ML의 주사기 FBS에 부착 된 25 게이지 바늘을 삽입합니다. 압력을 적용하고 50 ML 원뿔에서 70 μm의 여과기 휴식을 통해 모든 골수를 세척합니다.
4. 주기적으로, 1 mL의 3 mL의 주사기의 플런저를 사용하여 70 ㎛의 필터를 통해 골수를 누른다. HBSS + 5 % (부피 / 권) FBS와 스트레이너를 씻어. 이것은 뼈 조각 및 조직이 없도록 단일 세포 현탁액을 보장한다. 멸균 후드의 절차를 수행하여 무균 세포를 유지합니다.
5. 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기 골수 세포.

6. 골수 문화 (0 일)

1. 캔트 또는 흡인 미디어 50 ML 원뿔 튜브 당 1 ml의 염화 암모늄을 기반으로 적혈구 용해 버퍼 (또는 RBC 용해 버퍼 상당)에 재현 탁 세포 펠렛. 룸에서 1 분 배양 후온도는 완전 DMEM 20 % (부피 / 부피) 10 ml의 FBS를 첨가하여 적혈구 용해 완충액을 해소.
2. 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기 세포.
3. 가만히 따르다 5 ml의 완전한 DMEM 20 % (부피 / 부피) FBS의 대기음 뜨는 및 재현 탁 골수. 노이 바 우어 계산 챔버와 세포를 계산합니다.
   참고 : 일반 수율이 있어야합니다 약 5 - 마우스 당 × 10 ⁶ 셀 (10); 그러나, 수율은 쥐의 다른 변종에 따라 다를 수 있습니다.
4. IL-3이 보충 된 완전 DMEM 20 % (부피 / 부피) FBS 30 mL를 150-mm 플레이트 당 4 × ¹⁰⁷ 세포의 밀도로 접시의 골수 세포 (20g 용액 ^1), IL-6 (50 g ml의 ¹⁾ 및 SCF (50g ml의 ^1).
   참고 : 갓 해동-분주 사이토 카인을 사용합니다. 2 주 이상 4 ° C에서 냉동 번 이상 해동 또는 보관 된 사이토 카인을 사용하지 마십시오.
5. 5 % CO _2, 37 ℃에서 밤새 골수 (약 24 시간)을 인큐베이션.

7. 레트로 바이러스 생산자 세포 배양 (0 일)

1. 플레이트 18 ml의 완전한 DMEM 20 % (부피 / 권) FBS에서 150 mm 플레이트 당 3 × 10 ⁶ 레트로 바이러스 생산 세포.
2. 하룻밤 37 ° C에서 레트로 바이러스 생산 세포를 품어. (- 3 기증자 마우스 약 2) 15000000 골수 세포에 대해 하나의 150-mm 판을 기대하고 있습니다.

8. 레트로 바이러스 상층 액 (1 일)

1. 다음날 (약 24 시간 이상), 10 ml의 주사기와 필터는 0.45를 이용하여 150 mm 플레이트에서 직접 레트로 바이러스 상등액을 그림으로써 (7 단계에서 설정) 생산자 판에서 레트로 바이러스 뜨는을 수확 -μm 주사기 필터.
2. 조심스럽게 신선한 완전한 DMEM 20 % (부피 / 부피) FBS 18 ㎖로 제거 된 레트로 바이러스 뜨는을 교체합니다.
3. (g ml의 ^-1 20) IL-6 (50g ml의 ^1), MSCF (50g ml의 ¹⁾ 및 Hexadimethrine 브로마이드 (폴리 브렌) (6을 IL-3 필터링 된 레트로 바이러스 상층 액을 보충# 956; g ml의 ^1).
   주 : Hexadimethrine 브로마이드 레트로 바이러스 형질 도입의 효율의 저하를 방지하기 위해 2 개월마다 신선한하여야한다.

9. 골수 수확 (1 일)

1. 단계 8.3를 완료 한 후, 단계 6.4로부터의 골수 세포를 수확하고 멸균 된 50 ㎖의 튜브에 비 부착 세포를 포함하는 미디어 전송.
2. 10 ml의 PBS에 적극적으로 접시를 씻으 단계 9.1에서 50 ML 원뿔에서 수집합니다. 필요한 경우, 세척 공정을 반복한다.
3. 원심 분리기는 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 세포가 뜨는을 가만히 따르다, 작은 볼륨에 resuspend 세포 (1-3 ml)을 완료 DMEM 20 % (부피 / 부피) FBS, 그리고 계산합니다. 사이토 카인 및 Hexadimethrine 브로마이드를 함유하는 레트로 바이러스 상층 액 1 ㎖ 당 1 × ¹⁰⁶ 세포로 재현 탁 0 일 골수 75 % 복구 - 50 예상된다.

10. 골수 형질 도입 (1 일)

1. 레트로 바이러스 상등액 / 뼈 엄마 플레이트여섯 웰 조직 배양 플레이트에 웰 당 3 ㎖의 부피에서 rrow 혼합물. 단계 10.2에서 원심 분리 동안 가스 교환을 최소화하기 위해 플라스틱 포장의 판을 바꿈.
2. 60 분 37 ° C 1,000 XG에서 랩 여섯 웰 플레이트 스핀.
3. 스핀가 완료되면 플라스틱 포장을 제거하고 24 시간 동안 37 ° C CO _{2 배양기에서} 접시를 놓습니다.

(11) 레트로 바이러스 뜨는 및 형질 도입 (2 일)

1. 24 시간 후, 바이러스 생산 세포주에서 신선한 바이러스 상층 액을 수집합니다. 10 mL의 주사기와 0.45 μm의 주사기 필터를 사용하여 레트로 바이러스 상등액을 필터. IL-3 필터링 된 레트로 바이러스 상층 액 (용액 ^20g-1), IL-6 (50g 용액 ^-1) 및 SCF 보충 (50g 용액 ^-1) 및 Hexadimethrine 브로마이드 (6g 용액 ^1).
2. 다음, 조심스럽게 피펫으로 제거하거나 골수 세포를 포함하는 6 웰 플레이트의 각 웰로부터 매체의 상단이 용액을 흡인.
   주 : 작업은 신중 보통 웰의 중앙에 집중되어 골수를 대기음 없다. 이와 달리, 제거 된 상등액을 어떤 손실 골수 세포를 회수하기 위해 스핀 다운된다.
3. 잘 골수 6 웰 플레이트의 각에 신선한 바이러스 상층 액을 포함하는 사이토 카인 및 Hexadimethrine 브로마이드 3 ㎖를 추가합니다. 플라스틱 접시를 감싸, 60 분, 37 ° C를 1,000 XG에서 스핀 전달을 반복합니다. 접시를 풀다, 37 ° C, 5 % CO ₂ 밤새 (약 24 시간)에서 세포를 배양한다.

신선한 보충 DMEM의 12 추가 (3 일)

1. 24 시간 후, 단계 11.2에서와 골수 세포를 포함하는 6 웰 플레이트의 각 웰로부터 매체의 상단이 용액을 제거한다. (g ml의 ^-1 50) IL-3의 최종 농도로 보충 신선한 DMEM 20 % (부피 / 부피) FBS와 (20g ml의 ^-1) 제거 된 미디어를 교체, IL-6 (50 g ml의 ¹⁾ 및 SCF .
2. 골수를 품어또 다른 24 시간 동안 37 ° C CO _{2 배양기에서} 접시.

13. 수확 형질 골수 (4 일)

1. 24 시간 후에, 6- 웰 플레이트에서 골수 세포를 수집한다. 모든 비 부착 세포를 제거하기 위해 PBS에 격렬 판을 씻는다.
   1. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 세포를 원심 분리기와 뜨는을 가만히 따르다.
   2. PBS + 0.5 % (부피 / 부피)의 소량 (1 mL) 중 골수 열 - 불 활성화 FBS를 재현 탁. 얼음에 세포를 유지합니다.
2. 각 골수 조건의 10 μL 샘플을 채취하고 노이 바 우어 계산 챔버를 사용하여 세포를 계산합니다. 1 가정 -받는 사람 당 2 기증자, 수율은받는 사람 마우스 당 최소 4 × 10 ⁶ 세포를 전송하기에 충분합니다. 마우스 당 300 μL - 200에 주입하는 PBS + 0.5 % (vol / vol) 열 활성화 된 FBS 충분한 양의 골수 재현 탁.
   1. 전달 효율을 갖는 적어도 2 × ¹⁰⁶ 세포를 주입25 %의 정맥 마우스 당 (8 X10 ⁶ 셀을 삽입 할 수 있습니다).
      참고 : 우리는 일상적으로 골수 세포의 두 6 웰 플레이트에 5받는 사람 쥐를 주입. 수율이 실질적으로 낮은 경우 충분한 골수 수가 얻어 질 때까지 더 공여 마우스는 사용되어야한다. 최적의 재구성을 달성하기 위해, 적어도 5 × ^5는 형질 도입 (양의 형광체)를 각 수신자에 주입한다.
3. 마이크로 피펫으로, 각각의 골수 조건의 10 μl의 샘플을 채취하여 형광 마커 (그림 1A) ^(11)의 발현에 따라 유동 세포 계측법에 의해 전달 효율을 분석 할 수 있습니다.
   주 : 일반적으로, 형광 양성 세포의 비율은 구조 및 레트로 바이러스 역가에 따라 25 %에서 70 % 사이이다. 필요한 형질 도입 골수 세포의 수는 서브 - 치명적 조사하는 마우스 전달 효율에 따라 달라질 수 재구성. 트란 낮은sduction 효율이보다 골수 세포를 요구하고, 반대로 골수 전달 효율이 높아 세포의 낮은 숫자는 재구성에 필요한. 25 % 아래의 전달 효율이 최적이며, 부족 재구성과 생존의 원인이 될 수 있습니다. 최적 골수 회복 전달 효율을 확보하기 위해, 새로 제조 된 조직 배양 배지 및 사이토 카인을 사용한다. retrogenic 체계를 이용하여 새로운 TCR을 발현 할 때, 생체 내에서 그 TCR의 선택은 알려져 있지 않다. 개별 TCR의 친화도에 따라 흉선 및 말초 T 세포 발현 TCR 선택 ¹⁷ 달라진다.

14. 마우스 조사, 골수 주입 및 관리

1. 쥐에게 골수 주입 전날 (13 단계로 당일)을 조사. 다음 용량 사용 C57BL / 6 마우스 (및 기타 야생형 균주), 900 래드, Rag1을 ^{- / -} 마우스, 500 래드; SCID 마우스, 300 래드).
   1. 아목시실린에 배치받는 사람 마우스 (50 ㎎ / ㎏ / 일) 또는 조사 전에 다른 항생제 물 처리, 골수 주입 후 첫 2 주 동안 항생제를 계속.
      주 : 최적의 조사량은 경험적으로 결정될 수있다.
2. 주사를 들어, 바로 주입하기 전에, 다음, 주사 27 게이지에 바늘을 변경 공기 색전증을 방지하기 위해 모든 공기를 추방 무딘 바늘을 사용하여 1 ML의 주사기에 단계 13.1에서 세포를로드합니다. 가열 램프 아래에서 열 및 마우스 당 정맥 마우스 골수 0.2 ml를 주입.
   참고 : 세포가 시간의 길이 또는 정착 할 셀의 주사기에 앉아 않도록하십시오.
3. 그들이 건강을 유지하도록 주간 생쥐를 모니터링합니다.
4. 오 후 - 육주, GFP + / ametrine + 및 TCR 공동 식 (그림 1B) ^(11)에 기초하여 재구성을 확인하기 위해 쥐를 피.

결과

골수 대표 골수 전달도 (도 1a)에있어서 꼬리 정맥에서 정맥 내로 주입되기 전에 골수 전달 효율은 수확 된 골수의 약 10 μL 중 100 ㎕를 첨가하고, 프로토콜의 단계 133에서 판정한다 PBS 및 ametrine 발현을 분석 하였다. 일반적으로 형광 양성 세포의 비율은 구조 및 레트로 바이러스 역가에 따라 25 %에서 70 % 사이이다. 6주 골수 주사 후, 마우스 골수 재구성 (?...

토론

프로토콜에서, 최적의 골수 건강, 전달 효율 및 재구성을 보장하기 위해 여러 세부 중요한 단계를 우리. 첫 번째 중요한 단계는 생성 및 GP + E86 바이러스 생산자 세포의 적절한 유지된다. 초기 통로 생산 세포주를 사용하여 80 % 컨 플루 이하 사용하기 전에에서 유지한다. 48 시간 - 신선한 GP + E86 바이러스 생산 세포를 만드는 경우, 293T 세포가 초기 통로 (24)에 대한 문화에서 성장되어 있는지 확인합?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM, high glucose + glutamine	Corning Cellgro	10-013-CV	Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate
FBS	Atlanta Biological	S11550
Trypsin-Versene	Lonza	17-161F
0.45 µm syringe filter	Thermo Scientific	194-2545
polybrene	Sigma	H9268-10G	Sterile Filtered in dH2O
Ciprofloxacin	VWR	AAJ61970-06
5-fluorouracil (5-FU)	VWR	AAA13456-06
Sodium Pyruvate	Corning Cellgro	25-000-CI
MEM nonessential Amino Acids	Corning Cellgro	25-025-CI
HEPES 1 M solution	Corning Cellgro	25-060-CI
2-Mercaptoethanol	Gibco by Life Technologies	21985-023
Pen/Strept	Corning Cellgro	30-002-CI
L-glutamine	Corning Cellgro	25-005-CI
150 mm tissue culture dishes	Greiner Bio-one	639160
Tisue culture-treated 6-well flat plate	Greiner Bio-one	657160
70 µm nylon cell strainers	Falcon	352350
Mouse IL-3	Invitrogen	PMC0033
Human IL-6	Invitrogen	PHC0063
Mouse Stem Cell Factor	Invitrogen	PMC2113L
10x PBS	Corning Cellgro	46-D13-CM
HANKS Buffer	Corning Cellgro	21020147
BD 10 ml Syringe	BD	300912
BD 1 ml Syringe	BD	309659
27 G x 1/2 BD Precision Glide Needle	BD	305109
30 G x 1/2 BD Precision Glide Needle	BD	305106