원자 힘 현미경, 충격 들여 쓰기 및 유변학를 사용하여 뇌 조직의 멀티 스케일 기계 속성을 특성화

요약

We present a set of techniques to characterize the viscoelastic mechanical properties of brain at the micro-, meso-, and macro-scales.

초록

기계 모조품 또는 조직 재생 연구에 대한 여부, 뇌의 특성에 의해 영감 재료를 설계 및 엔지니어, 뇌 조직 자체는 물론 다양한 길이와 시간 규모에서 특징해야합니다. 많은 생물학적 조직과 마찬가지로 뇌 조직은 복잡한 계층 구조를 나타낸다. 그러나 대부분의 다른 조직과는 대조적으로, 뇌는 아빠의 100 단위 정도의 영의 탄성 계수를 E로, 매우 낮은 기계적 강성이다.이 낮은 강성 키 기계적 특성의 실험적 특성에 문제를 표시 할 수 있습니다. 여기, 우리는 서로 다른 길이 스케일과 로딩 속도에서 뇌 조직으로 수화, 준수 생물학적 재료의 탄성 및 점탄성 특성을 측정하도록되어 여러 가지 기계적 특성 분석 기법을 보여줍니다. 마이크로 스케일에서, 우리는 원자 힘 현미경을 사용 들여 쓰기를 사용하여 크리프 준수 및 강제 휴식 실험을 실시하고 있습니다. 메소에서케일, 우리는 진자 기반 계측 압자를 사용하여 충격 압입 실험을 수행합니다. 거시적, 우리는 주파수에 의존 전단 탄성 계수를 정량화하는 평행 판 레오 메타를 실시하고 있습니다. 우리는 또한 각 방법과 관련된 문제 및 제한 사항에 대해 설명합니다. 이 두 기술은 더 뇌의 구조를 이해하는 바이오 고무 물질을 설계하는 데 사용될 수 뇌 조직의 충분히 기계적 특성을 가능하게한다.

서문

생물학적 장기를 포함하는 대부분의 부드러운 조직 광물 뼈 재료 또는 설계에 비하여 기계적 및 구조적으로 복잡하고, 저 강성이고, 비선형 및 시간에 따른 변형을 나타낸다. 신체의 다른 조직에 비해 뇌 조직은 아빠 ^1의 100 단위 정도의 탄성 계수를 E로, 현저하게 준수합니다. 뇌 조직은 독특하고 깍지 회색과도 기능적으로 차이가 백질 영역과 구조적 이질성을 나타낸다. 이해 뇌 조직 역학 부상시 뇌의 반응을 모방하는 기계적 손상의 예측을 용이하게하고, 보호 전략 공학 있도록 재료 및 계산 모델의 설계에 도움이된다. 또한, 이러한 정보는 조직의 재생을위한 설계 목표를 고려​​하는 것이 사용될 수 있고, 더 다중 경화증 및 자폐증과 같은 질병과 관련된 뇌 조직의 구조적 변화를 이해. H의 전에, 우리는 설명하고 중간 -, 마이크로에서 뇌 조직을 포함하여 기계적으로 준수하는 조직의 점탄성 특성을 특성화 할 수있는 여러 가지 실험 방법을 설명하고, 매크로 규모.

마이크로 스케일에서, 우리는 크리프 컴플라이언스를 실시 및 원자 현미경 (AFM)을 이용하여 사용이 가능한 압입 완화 실험 강제. 일반적으로, AFM 기반 압입는 시료 ^2-4의 탄성률 (강성 또는 순시)를 추정하는데 사용된다. 그러나, 같은 기기는 또한 마이크로 점탄성 (또는 시간 - 속도 - 의존적) 특성 ^5-10를 측정하는데 사용될 수있다. 도 1에 도시 한 실험의 원리는 시간이 지남에 따라, 뇌 조직에 프로브 외팔보 AFM에 들여 힘 또는 압입 깊이의 특정 크기를 유지하고, 각각 압입 깊이와 힘의 대응 변화를 측정하는 것이다. 이러한 데이터를 사용하여, 우리는 크리프 샘플 콘텐츠를 계산할 수각각 liance J _C 및 휴식 계수 G _R,.

중규모, 우리는 진자 기반 인스트루먼트 나노 인 덴터를 이용하여 조직 구조 및 수분 레벨을 유지하는 유체 침지 조건에 영향을 들여 실험을 수행 하였다. 실험 장치는도 2에 도시되어있다. 진자가 조직과 접촉하여 요동으로 진동 진자 조직 내 쉴 때까지의 변위가 시간의 함수로서 기록된다 프로브. 프로브 얻어진 감쇠 고조파 진동 운동에서, 우리는 조직 ^{(11, 12)의} (에너지 손실의 속도에 관한)의 최대 침투 깊이 X _최대 에너지 소산 용량 K 및 소산 품질 인자 Q를 계산할 수있다.

매크로 스케일에서, 우리는, 주파수 의존 전단 탄성률을 정량화하는 평행 판 레오 미터를 사용하여. 조직의 저장 탄성률 G '와 손실 탄성률 G "를 지칭 유변학이 유형에서는, 고조파 각 균주를 적용 (전단 변형을 대응하는) 공지의 진폭과 주파수 및 reactional 토크 측정 (및 전단 응력에 대응) 도 3에 도시 된 바와 같이. 상기 측정 된 토크의 결과 진폭 및 위상 지연과 시스템의 기하학적 변수부터는 관심 ^{13,14의인가} 주파수 'G'와 G를 계산할 수있다.

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프로토콜

윤리 정책 : 모든 실험 프로토콜 보스턴 아동 병원의 동물 연구위원회의 승인 및 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소에 부합했다.

1. 마우스 뇌 조직의 취득 절차 (AFM 사용 들여 쓰기 및 영향 들여 쓰기)

1. 쥐를 마취하는 케타민 / 자일 라진 혼합물을 준비합니다. 5 mL의 케타민 (500 ㎎ / ㎖), 1 mL의 자일 라진 (20 ㎎ / ㎖) 7 ml의 0.9 % 식염수 용액을 결합한다.
2. 마우스 (품종 :; SYN-Cre 호텔, TSC1을 PLP-eGFP는, 나이 : P21; 성별 : 남성 또는 여성) 주사 케타민 / 자일 라진 솔루션의 g의 체중 당 7 μL와 함께.
3. 마우스가 완전히 마취되면, 발가락과 꼬리 핀치에 응답의 부족에 의해 입증 된 바와 같이, 큰 해부 가위를 사용하여 잘린하여 마우스를 안락사.
4. 작은 해부 가위를 사용하여 중간을 절단하여 두개골을 제거합니다. 소뇌에서 시작, 렘곡선 집게를 사용하여 두개골의 비켜 가지. 두개골을 제거한 후, 소뇌에서 시작, 뇌를 들어 올려 평평한 주걱을 사용하여 뇌를 추출하고 배양 접시에 두뇌를 놓습니다. 면도날을 사용하여 뇌에서 소뇌를 제거합니다.
5. 얼음에 성인 신경 조직에 대한 CO ₂ -independent 영양 배지와 둥근 바닥 튜브에 신선한 조직, 전송 뇌에 미치는 영향 들여 쓰기 시험을위한 뇌 전체를 사용하여 섹션 4로 이동하십시오 그렇지 않으면 절차를 거친 공격 태도를 보여준 1.6 단계로 진행합니다.
6. 0.7 mm / 초, 70 Hz의 진동 주파수와 350 ㎛의 슬라이스 두께의 속도로 vibratome 설정을 조정한다. 얼음과 vibratome 접시를 둘러싸고 있습니다. vibratome 접시에 순간 접착제의 소량을 놓고 관상 조각은 절단 할 수 있도록 뇌가 먼저 지느러미 쪽을 잘라 중심으로, 뇌를 탑재합니다.
7. 그냥 뇌 잠수함하기에 충분한 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS)와 vibratome 접시를 입력합니다. 증가블레이드 단지 DPBS에 잠긴되도록 vibratome에 접시.
8. 를 눌러 350 μm의 두께 코로나 뇌 섹션 슬라이스 시작합니다 시작합니다.
9. , 조직의 손상을 방지 vibratome의 DPBS 화장실에서 얼음에 성인 신경 조직에 대한 CO ₂ -independent 영양 배지와 둥근 바닥 튜브에 뇌 조각을 전송하고 48 시간 내에 신선한 조직에 대한 측정을 수행하기 위해 붓을 사용하여. AFM 사용 압입 실험을 시작하려면 섹션 3으로 진행합니다.

2. 돼지 뇌 조직의 취득 절차 (유동성에 대한)

1. 지역 정육점에서 희생 ~ 1 시간 내에 sagittally 얇게 썬 돼지의 절반 뇌를 얻습니다. 성인 신경 조직에 대한 CO ₂ -independent 영양 배지에서 반 두뇌를 배치하고 얼음에 저장합니다.
2. 성인 신경 조직에 대한 CO ₂ -independent 영양 배지에서 ~ 5mm 두께의 관상 뇌 조각 및 저장을 위해 면도날이나 메스를 사용합니다. 있는지 확인 슬라이스 SURFAC전자는 가능한 한 평면이다. 절편 동안 면도기 / 메스주의 측면 움직임을 사용합니다.
3. 스토어 돼지 뇌 얼음에 성인 신경 조직에 대한 CO ₂ -independent 영양 배지에서 조직과 48 시간 내에 신선한 조직에 유변학 적 측정 (섹션 5)를 수행합니다.

3. 원자 힘 현미경 들여 쓰기 가능

1. 제조업체의 지침에 따라 홍합 유래 생체 접착와 60mm 직경 페트리 (P60) 요리를 준비합니다.
   1. 8.0의 최적 pH를 가진 멸균 0.1 M 중탄산 나트륨으로 이루어진 중간 완충액의 재고를 준비한다. 필터 소독 (0.2 미크론) 39 ° C에서 중탄산 나트륨 완충액 저장.
   2. 층류 후드에서, 중탄산 나트륨 완충액 6.25 % 홍합 유래 바이오 - 접착제 및 3.125 %의 NaOH 용액을 혼합한다.
   3. 졸을 확산 할 수있는 60mm 직경 페트리 (P60) 요리 및 사용 피펫 팁 상 3.1.2에서 바이오 접착제 솔루션의 피펫 100 ㎕3-5 센티미터 직경의 원형으로의 ution.
   4. 솔루션 건조 (~ 30 분) 층류 후드에서 발견 P60 요리를두고 보자. 세척 요리 PBS 및 멸균 물을 2 배와 1 배. 최대 1 개월 4 ° C에서 밀봉 된 비닐 봉지에 층류 후드와 상점에서 요리 건조 공기를 보자.
2. 원자 현미경의 AFM 및 설정 뇌 샘플을 보정합니다.
   참고 : 제조사에 따라 AFM 교정 지침을 따르십시오.
   1. 조심 0.03 N / m의 공칭 스프링 상수와 프로브 홀더에 20 ㎛의 직경의 붕규산 비드를 갖는 AFM 프로브로드.
   2. 열 조정 방법 ^{(15, 16)를} 사용하여 AFM 캔틸레버의 스프링 정수 및 역 레버 광 감도 (InvOLS)를 보정한다.
      주 : AFM 프로브에 대한 스프링 상수가 계산되면, 반복 사용으로 일정하게 유지한다. 그러나, 캔틸레버 InvOLS 레이저가 캔틸레버와 재정렬 될 때마다 다시 보정 할 필요가있다. 또한, 교정폴리스티렌과 같은 캔틸레버보다 엄격한 크기의 기판 몇 가지 순서에 대해 수행되어야한다.
   3. 37 ° C로 무대에 장착 된 히터와 설정 온도를 켭니다.
   4. 3.1에서 제조 된 P60 요리에 뇌 슬라이스를 마운트합니다.
      1. 조심스럽게 350 μm의 두께 뇌 슬라이스뿐만 아니라 홍합 유래 바이오 부착 도포 된 P60 접시에 둥근 바닥 플라스크에서 CO ₂ -independent 매체 붓는다.
      2. 부드럽게 P60 접시 틸팅함으로써 접시의 중앙 뇌 슬라이스 위치. 필요한 경우, 천천히 접시의 중앙에 그 자체 또는 그 이상의 위치에서 뇌 슬라이스 접혀있는 뇌 슬라이스 전개 수동 피펫으로부터 매체 피펫.
      3. 조심스럽게 P1000의 피펫을 (진공을 사용하지 않는)를 사용하여 초과 용지를 제거합니다.
      4. P60 접시에 커버를 놓고 뇌 조각이 20 분 동안 부착 할 수 있습니다.
   5. P60에 장착 된 뇌 조각의 AFM 헤드를 제거 배치원자 현미경의 무대에서 접시, 2 ~ 추가 ml의 CO ₂ -independent 매체를 미리 예열.
   6. 조심스럽게가 뇌 슬라이스 주변 매체로 하강 할 때 표면 장력에 의한 파괴로부터 보호하기 위해 AFM 프로브 매체에 한 방울을 추가한다.
   7. 스테이지로 AFM 헤드의 위치를​​ 변경하고,이 미디어에 빠져들 때까지 머리를 낮추는 시작합니다.
   8. 탑 뷰 CCD 카메라를 사용하여, 캔틸레버에 레이저의 위치를​​ 변경.
      주 : 캔틸레버에 레이저의 배향으로 인해 공기와 매체의 굴절률 차에 약간 변경 될 것이다.
   9. 캔틸레버 따뜻한 액체에 잠긴되기 조정을 위해 5 분을 기다린 후 0 V.의 무료 편향에 거울 정렬을 재설정
   10. 제조업체의 지침 ^(16)에 따라 AFM 탐침에 열 스펙트럼을 실행합니다. 미디어의 AFM 탐침의 InvOLS을 다시 계산하는 첫 번째 열 피크의 착용감을 사용합니다.
   11. 광학 현미경을 사용하여,시료 스테이지를 이동하도록 상기 AFM 프로브 아래 관심 뇌 영역.
       참고 :이 주변의 회색 물질보다 더 불투명으로하는 뇌량이 어두운 나타납니다. 피질은 뇌량 우수하다.
   12. 0 V.의 무료 편향에 거울 정렬을 재설정
   13. 원자 현미경 소프트웨어의 합과 처짐 미터에서 AFM 헤드를 참여 "참여"를 클릭합니다.
   14. 캔틸레버와 샘플 사이의 접촉이 이루어질 때까지 AFM 헤드 위치 다이얼을 이용하여 머리를 낮게.
3. 원하는 경우 이전 ^4,17,18 한 바와 같이 (선택 사항), 샘플의 탄성 계수를 측정한다.
4. 크리프 컴플라이언스 실험을 실시한다.
   1. 소프트웨어의 기능 편집기에 적용 힘 기능을 구축합니다. 힘 기능은 5 윈의 세트 포인트에 0.1 초 램프로 구성되어 있으며 0 윈의 가해진 힘에 램프 다운 1 초 뒤에 20 초 동안 유지.
      1. 들여 쓰기 마스터 P에ANEL는 들여 쓰기 방법에 따라, 압자 모드에 대해 "로드"를 선택; 단위 "N"; 압자 기능 및 "기능 편집기".
      2. 기능 편집기에서 세그먼트 PARMS 패널에 0.1 초의 시간, 0 윈 시작 5 윈에서 끝인가 된 힘 기능 세그먼트를 만들 수 있습니다. "-> 삽입"을 클릭합니다.
      3. 다음 세그먼트를 들어, 5 윈, 20 초 5 윈에 끝, 시간에 시작을 설정합니다. "-> 삽입 '을 클릭합니다.
      4. 마지막 세그먼트를 들어, 5 윈, 1 초에 0 윈에 끝, 시간에 시작을 설정합니다. 클릭 "그리기"및 기능 편집기 창을 닫습니다.
   2. 마스터 패널의 강제 탭에서 "트리거 후 압자 램프"를 확인하고 0.1 V.의 트리거 포인트에 도달 한 후 트리거 적용 힘 기능을 설정
   3. 크리프 준수에 대한 구성-적용 힘 기능을 트리거 마스터 패널의 강제 탭의 하단에 "단일 힘"을 클릭합니다.
   4. 후하나의 힘 들여 쓰기가 완료, 머리를-관여 다시 다시 제로 무료 편향을 다음 샘플과의 접촉에서이되도록 AFM 헤드를 올리고.
   5. 관심의 새로운 영역을 찾아 접촉을 만들기 위해 AFM 헤드를 낮추기 위해 샘플 단계를 조정하십시오. 주 : 시료 스테이지가 이동하면 AFM 헤드는 샘플 표면으로부터 후퇴한다. 그렇게하지 ​​않으면 섬세한 AFM 캔틸레버가 손상 될 수 있습니다.
   6. 단계를 반복 3.4.3-3.4.5 데이터의 원하는 양이 수집 될 때까지.
5. 힘 완화 실험을 실시한다.
   1. 소프트웨어의 기능 편집기에 적용 들여 쓰기 기능을 구축합니다. 들여 쓰기 기능은 3 ㎛의 세트 포인트에 0.1 초 램프로 구성되어 있으며 0 μm의의 압입 깊이에 램프 다운 1 초 뒤에 20 초 동안 유지.
      1. 들여 쓰기 마스터 패널에서 들여 쓰기 방법에 따라, 압자 모드에 대해 "들여 쓰기"를 선택; 단위 "m"; 와 "; 압자 기능에 대한 기능 편집기 ".
      2. 기능 편집기에서 세그먼트 PARMS 패널에 0.1 초의 시간, 0 μm의 시작 3 μm의에서 끝인가 된 힘 기능 세그먼트를 만들 수 있습니다. "-> 삽입"을 클릭합니다.
      3. 다음 세그먼트를 들어, 3 μm의 3 μm의, 마지막에 시작 세트, 20 초 시간. "-> 삽입 '을 클릭합니다.
      4. 마지막 세그먼트를 들어, 0 μm의 3 μm의, 마지막에 시작 설정하고 1 초 시간. 클릭 "그리기"및 기능 편집기 창을 닫습니다.
   2. 마스터 패널의 강제 탭에서 "트리거 후 압자 램프"를 확인하고 0.1 V.의 트리거 포인트에 도달 한 후 트리거 적용 힘 기능을 설정
   3. 힘 휴식을위한 구성-적용 들여 쓰기 기능을 트리거 마스터 패널의 강제 탭의 하단에 "단일 힘"을 클릭합니다.
   4. 단일 강제 압입이 완료된 후가되도록 상기 AFM 헤드 인상다음 샘플과의 접촉에서 머리와 다시 제로 편향을 다시 참여.
   5. 관심의 새로운 영역을 찾아 무대 위치를 조정 및 연락처를 만들기 위해 머리를 낮 춥니 다.
   6. 데이터의 원하는 양이 수집 될 때까지 반복 5.3-5.5 단계를 반복합니다.
6. 실험과 청소를 마친다.
   1. 실험을 체결 한 후, AFM 헤드를 높이고 샘플에서 제거합니다.
   2. 조심스럽게 캔틸레버를 건드리지 않고 초과 액체를 제거하기 위해 실험실 조직을 사용합니다.
   3. 조심스럽게 소량의 에탄올을 사용하여 AFM 캔틸레버 홀더를 청소. 에탄올에 캔틸레버 홀더에 민감한 전자 제품을 노출시키지 마십시오. 저장 용기의 AFM 캔틸레버과 장소를 제거합니다.
   4. 적절한 바이오 프로토콜에 따라 뇌 조직 샘플을 폐기.
7. 리와 Radok 1960에 의해 도출 된 용액에 따르면, MATLAB은, 크리프 준수를 계산하고 압자 형상을 사용하여 이완 계수를 강제로 사용 ^19.
   1. 힘 F와 압입 깊이를 계산 캔틸레버 위치 z에서 데이터, 편향 D 및 스프링 상수, k 개의 _C에서
      
      과 .
   2. 린 등. ^(20)에 설명 된 알고리즘을 사용하여 압입 곡선에 따라 접점을 찾아.
   3. 데이터 분석에 대한 관심의 창을 정의합니다. 관심의 창 또는 (강제 휴식을위한) 압입 깊이 (크리프 준수) 힘 중 하나는 셋 포인트 값으로 유지되는 영역 (즉, 그림 1C, D와 같이 지역 3).
   4. 크리프 컴플라이언스 실험을 위해, 스텝 부하에 대한 응답으로 실험 크리프 컴플라이언스 계수, J의 _C (t)를 계산n은 1 "SRC ="/ 파일 / ftp_upload / 54201 / 54201eq4.jpg "/>
      ,
      H (t)는 Heavyside 계단 함수이고, R은 구형 탐침의 반경이다.
   5. 힘 완화 실험을 위해, 단계 압입 깊이에 응답 실험 힘 완화 탄성률 G _R (t)를 계산 :
      .

4. 영향 들여 쓰기

1. 계측 된 나노 인 덴터 교정과 제조업체의 지침에 따라 수화 뇌 조직에 동적 충격 실험을 사용하도록 기본 설정을 조정합니다.
   1. 핀셋을 사용하여 진자에 밀어 구형 프로브를 탑재합니다.
   2. 병진에 나사 결합 된 샘플 포스트에 융합 된 석영 샘플을 접착제단계.
   3. 보정 메뉴로 이동하고 "액체 셀." 융합 석영 샘플과 접촉하기 위해 소프트웨어의 지침을 따르십시오.
   4. 압자 유형에 대해 "일반"을 선택하고 압자로드 0.05 백만의 기본값을 사용합니다. 일반 압자 구성에 대한 보정을 수행하기 위해 "계속"을 클릭합니다.
   5. 최소 5mm로 다시 샘플 스테이지를 이동합니다. 프로브 액체 셀에 하강 할 수 있도록 상기 레버 아암을 탑재하고, 압자 유형은 "액체 셀 '를 선택하여 새로운 구성의 액정 셀 보정을 반복한다. 액을 셀 보정 계수를 얻기 위해 "계속"을 클릭합니다.
   6. 실험 메뉴로 이동하고 선택하여 액체 셀 소프트웨어 옵션 활성화 "특수 옵션을." 최신 보정 값을 사용합니다.
   7. 이 HIG를 테스트 할 때 필요한 더 큰 최대 측정 깊이로 이어질 것 같은 커패시터 플레이트 간격을 증가hly 준수 재료.
      1. 시스템 메뉴에서 각각 0.5 MN / 초, 0.1 MN / 초, 3 V, 오프셋 진자 시험 하중 속도, 무부하 속도, 대기 램프를 변경하는 "비 보호 설정"및 "기계 매개 변수"를 선택합니다.
      2. 렌치, 작은 단위 커패시터 플레이트 간격을 시계 방향으로 제어하는​​ 세 개의 너트를 켭니다.
      3. 각각의 완전한 시계 방향으로 회전 한 후, 유지 관리 메뉴에서 "다리 박스 조정"을 선택하고 멀리 진자에서 카운터 밸런스 웨이트를 이동이 필요합니다 좋은 진자 테스트를 얻을 수 있습니다.
      4. 단계를 반복 4.1.7.2-4.1.7.3 대략적인 깊이 보정이 70,000 ㎚ / V 이상의 값을 읽을 때까지.
   8. 전원 공급 장치를 통해 켜거나 전환 할 수 있습니다 진자의 아래쪽에 새로운 제한 정지를 놓습니다. 진자 운동의 잠재적 인 장애물을 제거하기 위해 진자 뒤에 앉아 원래 제한 정지를 철회하고 더 높은 허용충격 속도뿐만 아니라 준수 샘플에 높은 침투 깊이.
   9. 캐비닛 열 평형에 도달 할 수 있도록 허용 (약 1 시간 소요).
   10. 캐비닛이 평형을하는 동안, 시스템 메뉴로 돌아가서 "비 보호 설정"을 선택 "기계 매개 변수를." 1 ㎛ / 초에 깊이 교정 (dcal) 연락처 속도를 설정, 3 μm의 / 초 기본 들여 쓰기 연락처 속도, 1 ㎛ / 초에 초 저 부하 연락처 속도.
   11. 교정 메뉴에서 새로운 구성의 표준 깊이 보정을 수행합니다.
   12. "임펄스 변위를 조정합니다."솔레노이드의 전원을 켜고 실험 메뉴 10 V. 이동으로 설정하고 "충격"을 선택하고 진자의 스윙 거리를 보정하기 위해 소프트웨어 명령 (자동 메시지)를 따릅니다.
2. 액체 셀에서 마우스 뇌 조직을 탑재합니다.
   1. 인트에서 전체 뇌를 수확 한 후P 1.5, CO 즉시 얼음에 성인 신경 조직 미디어 ₂ -independent 영양 배지를 저장합니다.
   2. 충격 들여 쓰기 설정이 완전히 완료되면, 조심스럽게 CO ₂ -independent 매체와 함께 페트리 접시에 두뇌를 전송합니다. 양쪽에 평면 6 mm 두께의 섹션으로 뇌를 슬라이스.
   3. 시아 노 아크릴 레이트 접착제의 얇은 층으로 알루미늄 샘플 포스트에 얇게 부착 조직.
   4. 샘플 포스트의 두 번째 O 링을 통해 액체 셀을 밀어 완전히 조직 몰입하는 CO ₂ -independent 매체의 5 ml의 액체 셀을 입력합니다. 이 샘플 게시물이 조심스럽게 계측 나노 인 덴터 내부의 번역 단계에 장착된다.
3. 뇌 조직의 충격 응답을 측정한다.
   1. 필요한 경우, 구면 프로브를 제거하고, 레버 아암을 제거하지 않고 관심 프로브로 대체.
   2. 시스템 메뉴에서 비는 보호 "를 선택설정 "및"기계 매개 변수는. "5 μm의 / 초에 주요 영향 연락처 속도를 변경합니다.
   3. 레버 팔에 팁이 제대로 욕조 위에 위치 할 때까지 멀리 진자 (+ X 방향)에서 샘플 낮은 조 (-z 방향)과 함께, -x 방향으로 이동합니다. 끝이 완전히 목욕 및 시료의 전면에 빠져들 때까지 + Z 방향으로 이동합니다.
   4. 샘플 스테이지 제어 창을 사용하여 조심스럽게 접촉 후 약 30 μm의하여 샘플 표면으로부터 떨어져 스테이지 백.
   5. 실험 메뉴에서 충격 실험을 설정하기 위해 "충격"을 클릭합니다. 스윙 거리 교정에 따라 그 결과 충돌 속도에 직접 관련하는 특정 충격 하중을 선택합니다. 예약 실험을 실행합니다.
   6. 진자 백 스윙과 시료 표면을 측정면으로 계속 이동하면, 하부 한계 정지 스위치를 끄고.
   7. 진자가 forw 스윙으로 관찰샘플에 영향을 미칠 수 ARD. 시간의 함수로 프로브의 변위는 소프트웨어에 의해 기록 될 것이다.
   8. XYZ 스테이지 창이 나타나면 다시 한도 스톱 스위치를 켭니다.
   9. 반복 필요한만큼 다른 부하와 위치를 테스트하기 위해 3.4-3.8 단계를 반복합니다.
4. 최대 침투 깊이 X _최대 에너지 소산 용량 K 및 소산 품질 인자 Q를 결정하기 위해 정의 MATLAB 스크립트를 사용 진자의 시간 응답 대 취득한 변위를 분석한다. ⁽¹¹⁾
   1. 분석 메뉴로 이동하여 텍스트 파일에 데이터를 내보낼 수 있습니다.
   2. 시간의 함수로서 속도를 획득하기 위해 상기 변위 프로파일의 시간 도함수를 취할. 접점의 X _O1 제로 변위를 설정합니다.
      참고 _:에 충격 속도 v는 연락 최대 속도 직전 인 X _최대의 변형에 해당하는 프로브에서.속도는 처음으로 제로로 감소한다. X _O2, 배의 _R에 해당하는이, 다음 사이클에서 변형 된 샘플과의 접촉을 재개하는 데 필요한 위치입니다. 리바운드 속도 v _밖으로 변위 (X)의 _R에서의 속도이다.
   3. 제 충격 사이클 동안 회수 소산 샘플 에너지의 합으로 정규화 샘플에서 소모되는 에너지로서 K (단위 없음)을 정의한다. 진자 ^(21)의 고유 특성에 따라 K를 계산 X _O1 (예 : 회전 강성과 감쇠 계수 등), _{절에서 최대,} 배의 _R을, X 및 V _OUT.
      참고 :. 자세한 내용은 하나 Kalcioglu 등 2011 년의 일을 협의 할 수있다.
   4. 변위 고조파 감쇠 진동 운동으로 설명 될 수 있으므로, 떨림의 최대 값을 지수 감쇠 함수 맞시간 곡선 대 배치.
   5. 즉 배 감소하는 진동의 진폭에 필요한주기의 수를 곱한 π로 Q (단위 없음)을 계산한다. 높은 Q 값이 낮은 에너지 소모 비율을 의미한다.

5. 유변학

1. - 설정 및 제조업체의 지침에 따라 레오 미터를 교정.
   1. 디바이스 / 조작부를 개방하여 유량계를 초기화한다. 제어판 탭에서 "초기화"를 클릭하십시오.
   2. 25 mm의 직경 측정 판 (PP25) 및 열 시스템을 마운트합니다.
   3. , 레오 미터 판과 조직 사이의 슬립을 줄이기 위해 (선택 사항) 상단 레오 미터 판의 모양에 맞게하고, 상단과 하단 판에 사포를 부착 접착제 사포 조각을 잘라.
   4. 제어판의 "제로 간격을 설정"을 클릭하여 상부와 하부 플레이트 사이의 접촉을합니다.
   5. CLI 의한 흡인력 변환기 제로"정상적인 힘을 다시 설정합니다."요리하는
   6. "측정 시스템"을 클릭, 제어판에서 서비스 탭을 열고 다음 "관성 테스트"를 클릭하여 관성 테스트를 실시한다. 이전 및 새 관성을 기록합니다. 제조업체에서 열거 된 관성, 프로브의 허용 한계 내에 있는지 확인합니다.
2. 레오 미터에로드 샘플.
   1. 조직을 수확하고 ~ 5mm의 두께로 돼지 뇌의 관상 세그먼트 슬라이스, CO ₂ -independent 매체에 얼음에 저장 한 후.
   2. 두 판 사이 뇌를 놓습니다. 미끄러짐을 방지하기 위해 샘플의 상부 및 하부 표면으로부터 큰 물방울을 제거 할 수 있지만 샘플을 건조하지 않는다.
   3. 상기 플레이트는 조직과 상기 측정 된 수직력의 상면 전체에 접촉 될 때까지 천천히 측정 플레이트를 낮추는 것은 5 ~ 10 분 휴식 시간 후 0.01 MN에 일치한다.
      1. 제어판에서 연속적으로 낮은 높이를 입력 내가n은 측정 위치 상자와 천천히 측정 판을 낮추기 위해 "측정 위치"를 클릭합니다.
      2. 플레이트가 완전히 조직의 표면과 접촉 할 때까지 조직과 접촉하는 mm에서 0.1 mm 단위로 측정 플레이트를 낮출 때. 측정 된 정상 힘이 5 ~ 10 분 휴식 기간 이후 0.01 미네소타 일관 있는지 확인합니다.
      3. 초기 측정 수직력을 기록한다. 반복 측정은 동일한 압축 응력 / 변형에주의해야한다.
   4. 샘플 플레이트의 직경을 초과하는 경우 플라스틱 블레이드 샘플 트림. 조직을 수화 샘플의 에지에서 미디어의 작은 부피 (~ 1-2 ㎖) 피펫.
   5. (선택 사항) 열 후드를 낮 춥니 다. 제어판에서 37 ° C까지 온도를 설정하고 "설정"을 클릭합니다.
3. 재료의 선형 점탄성 범위 (즉, 전단을 확립 진폭 스위프를 수행있는 G '및 G'는 관심 (예를 들면, 한 라드 / 초)의 주파수에서) 일정 '균주.
   1. 선택 "파일​​ / 새". 겔 탭에서 "진폭 스윕을 : LVE 범위"를 선택합니다. 창을 선택하고 "측정 1 :. 진폭 스윕을" 진동 상자를 더블 클릭합니다. 초기 및 최종 균주를 입력 (예를 들어, 105-0.01) 주파수 (예를 들면, 한 라드 / 초) 및 십 당 포인트의 수 (예를 들어 6 점 / DEC). "확인"을 선택하고 시작을 클릭합니다. "
   2. 선형 탄성 범위의 일관성을 보장하기 위해 반복 시험과 여러 조각에 대해이 절차를 반복합니다. 샘플의 축 방향 압축이 샘플 간의 일정하게 유지한다.
4. 조직 (예를 들면, 1 %의 변형률) ^(22)의 선형 ​​점탄성 범위에서 변형에서 조직의 주파수 스위프를 실시 관심 (예를 들면, 0.1 내지 라드 / 초)의 주파수 범위에서.
   1. 딸깍 하는 소리 "파일 / 새"와 겔 탭은 "주파수 스윕"를 선택합니다. 창 / 측정 1을 클릭 주파수 스윕을. 진동 상자를 더블 클릭합니다. 주파수 범위 (예를 들면 0.1-100 라드 / 초), 변형 (예를 들어, 1 %의 변형률) 및 십 당 포인트 수를 입력 (예를 들어 6 점 / DEC). "확인"을 선택하고 주파수 스위프를 시작하려면 "시작"을 클릭합니다.
5. 중복 또는 삼중의 반복 주파수 스위프 (단계 5.4).
6. G '주파수 (주파수 스위프)의 함수로하고 G "또는 전단 변형 (진폭 스위프) 참고 :. G'를 자동으로 계산하고, 레오 미터 내 보낸 데이터를 검토하고 G하는 샘플의 (최대 계산됩니다 '' ) reactional 토크 진폭 T _'0 및 회전 변위 각 (또는 편향 각) 및 위상 지연수학 식 1 "SRC ="/ 파일 / ftp_upload / 54201 / 54201eq9.jpg "/>,인가 된 진동 변형에 대한 샘플의 반응 (그림 3)
   
   
   R 및 H는 샘플의 반경과 높이 어디.

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결과

그림 4는 각각 가해진 힘 또는 압입 깊이 (그림 4A, D), 부여, 크리프 준수에 대한 시간 응답 (그림 4B, E) 대 대표 들여 쓰기와 힘을 보여줍니다 및 휴식 실험을 강제로. 이러한 데이터는 시스템의 구조를 사용하여 크리프 컴플라이언스 J의 _C (t)와 이완 계수 G _R (t)에 힘이 뇌 (도 4C, F)의 상이한 영?...

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토론

본 논문에서는 각 기술은 뇌 조직의 기계적 성질의 다른 측면을 측정합니다. 크리프 준수 및 응력 완화 계수는 시간에 따른 기계적 특성의 측정이다. 저장 및 손실 모듈러스는 속도 의존 기계적 특성을 나타낸다. 충격 압입은 속도 - 종속 기계적 특성을 측정하지만, 에너지 소비의 맥락이다. 조직의 기계적 특성을 특성화 할 때, 모두 AFM 사용 들여 쓰기 및 유변학은 일반적으로 방법을 사용한다. 전...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylazine	Lloyd Laboratoried		perscription drug
Ketamine	AnaSed Injections		perscription drug
Vibratome (Vibrating blade microtome)	Leica	VT1200
Hibernate-A Medium	Gibco	A1247501	CO2-independent neural medium for adult tissue
Atomic Force Microscope, MFP-3D-BIO	Asylum Research	-
Petri Dish Heater	Asylum Research	-
AFM Probe, 0.03 N/m, 10 µm radius borosilicate sphere	Novascan	PT.GS
Cell-Tak	Corning	354240	mussel-derived bioadhesive
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	alternate suppliers can be used
Sodium Hydroxide, 1 N	Sigma-Aldrich	59223C	alternate suppliers can be used
Instrumented Indenter, NanoTest Vantage	Micro Materials Ltd.	-	probe tip needs to be machined (steel flat punch, 1 mm diameter, 4-5 mm length)
NanoTest Liquid Cell	Micro Materials Ltd.	-
Parallel Plate Rheometer MCR501	Anton-Parr	-
PP25	Anton-Parr	-	25 mm diameter flat measurement plate
Adhesive Sandpaper	McMaster-Carr	4184A48	alternate suppliers can be used
Loctite 4013 Instant Adhesive	Henkel	20268	alternate suppliers can be used