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요약

높은 처리량, 자동화, 담배 원형질체 생산 및 변환 방법이 설명되어 있습니다. 로봇 시스템이 아닌 모델 작물로 번역해야한다 모델 BY-2 시스템에 대규모 병렬 유전자 발현 및 검색 할 수 있습니다.

초록

지난 10 년간의 신호 전달 경로, 전사 조절 네트워크, 유전자 발현, 유전자 편집 및 유전자 침묵의 분석 종을 잘라내 모델 종에서부터 식물 원형질체의 사용 부활되고있다. 또한, 상당한 진전 식물 게놈 이러한 시스템의 사용에 더 많은 이익을 생성 한 원형질체로부터 식물의 재생에 만들어졌다. 이 작품에서, 프로토콜은 로봇 플랫폼을 사용하여 '밝은 노란색'2 (BY-2) 담배 현탁 배양에서 원형질체 분리 및 변환의 자동화를 위해 개발되었다. 변환 절차는 콜리 플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터 (35S)의 제어하에 오렌지색 형광 단백질 (OFP) 리포터 유전자 (pporRFP)을 사용하여 검증 하였다. 원형질체의 OFP 발현 표면 형광 현미경으로 확인 하였다. 분석은 propidiu을 사용하여 원형질체 생산 효율 방법을 포함m 요오드화. 마지막으로, 저가 식용 효소는 엄청난 비용 원형질체의 분리 및 분석을 자동화 높은 처리량에 실험실 등급 효소의 필요성을 우회 원형질체 분리 절차를 사용 하였다. 본 연구에서 개발 된 프로토콜에 기초하여, 변형에 원형질 분리의 전체 과정은 운영자의 입력없이, 4 시간 이내에 수행 될 수있다. 이 연구에서 개발 된 프로토콜은 BY-2 세포 배양과 검증 동안, 절차 및 방법은 작물의 게놈 연구의 가속을 활성화해야합니다 모든 식물 현탁 배양 / 원형질체 시스템에 번역해야합니다.

서문

최근, 초식 동물 6 방지 매스 수율 7 증가하고 세포벽 들음 감소 가뭄 3,4- 내염성 5 부여 제초제 저항성 2 부여 각종 질병 한 극복 유전자 변형 작물의 설계에 배치 상당한 자극이 있었다 8. 이러한 경향은 dsRNA를 10, 11의 miRNA와 siRNA를 12까지 침묵 CRISPR TALENs과 9를 사용하여 게놈 편집 및 유전자를 포함한 형질 전환 식물을 생성하는 새로운 분자 도구의 개발에 힘 입어되었다. 이들 기술은 형질 전환 체의 생성을 단순화되었지만, 또한 트랜스 제닉 식물의 투명 수 식물 재생에 의존하는 기존의 시스템을 이용하여 스크리닝 될 수 생성 병목을 만들었다. 상기의 많은 침묵과 게놈 구조 편집 빠르게 식물에 삽입 될 수 있지만, 이러한 병목 관련타겟 특성 식물을 온실에서 분석 할 때까지 종종 발견되지 않는 목적하는 효과를 생산하지 못한다. 본 논문에서는 특히 표적 유전자 사일런 편집 및 유전자의 다수의 초기 스크리닝에서의 전류 병목 현상을 해결하기 위해, 식물 원형질체의 신속한 자동화 고 처리량 스크리닝하기위한 방법을 개발 하였다.

그대로 식물 세포 반대로 원형질체의 사용은 자동화 된 플랫폼의 개발을위한 여러 가지 장점을 갖는다. 먼저, 원형질체는 식물 세포벽의 분해 후에 격리되고, 더 이상 존재하지 않는 장벽이, 변환 효율은 13 커진다. 그대로 식물 세포 (14) 및 아그로 박테 리움 - 매개 형질 전환 15 바이오리 스틱스 (biolistics) 변환을위한 두 개의 잘 확립 된 방법이있다. 바이오리 스틱스 (biolistics)는 변압기의 용 전문 장비를 필요로 이러한 방법 중 어느 것도 쉽게, 액체 처리 플랫폼으로 변환 할 수 있습니다rmation, 아그로 박테 리움 반면 - 매개 변환은 공동의 문화와 박테리아의 연속적인 제거가 필요합니다. 둘 다 높은 처리량 방법에 대한 의무가 없습니다. 원형질체의 경우, 변환은 통상적으로 단지 몇 액 교환이 필요하며, 이상적으로는 액체 처리 플랫폼에 적합 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) - 매개 형질 감염 (16)를 사용하여 수행된다. 둘째, 원형질체는 정의에 의해 단일 세포 배양, 따라서 식물 세포 배양에서 응집 및 체인의 형성과 관련된 문제들, 원형질체에서 관찰되지 않는다. 접시 기반 분광 광도계, 세포의 응집을 사용하여 빠른 심사의 관점에서, 또는 여러면에서 세포는 일관된 측정을 획득 어려움으로 이어질 것입니다. 원형질체가 배지보다 또한 치밀하기 때문에, 이들은 플레이트 기반 측정법위한 도움이되는 단일 층을 형성하고, 웰의 바닥에 침전. 마지막으로, 식물 세포의 현탁 배양은 PRIMAR 반면ILY 캘러스 (17)로부터 유래 된 원형질체는 조직 - 특이 적 발현을 확인 할 수있는 능력에 이르는, 식물 조직의 개수에서 수확 될 수있다. 예를 들어, 기능 표현형 예측에 매우 중요 할 수 루트 레벨 또는 유전자의 잎 특이 적 발현을 분석한다. 이러한 이유로,이 연구에서 개발 된 프로토콜은 널리 사용되는 담배 (담배 속 tabacum L.) '밝은 노란색'2 (BY-2) 현탁 배양에서 분리 된 원형질체를 사용하여 검증 하였다.

에 의해-2 현탁 배양은 식물 세포 (18)의 분자 분석에서의 유비쿼터스 사용하기 때문에, 고등 식물의 "헬라"셀로 설명되었다. 최근 BY-2 세포는 식물의 효과를 연구하는 데 사용 된 세포 내 단백질 지역화 23, 24, 및 식물 생물학에서 이러한 문화의 다양한 유틸리티를 보여주는 기본적인 세포 생물학 25-27, 19-22을 스트레스. BY-2 문화의 또 다른 장점입니다유전자 발현에 대한 향상된 재현성을 초래할 수있는 aphidicolin와 문화를 동기화 할 수있는 능력은 28 연구. 또한, 방법은 전통적 원형질체를 생성하는데 사용 효소 선정 높은 스루풋 시스템 금지이기 때문에, 저비용 29,30 효소를 사용하여 -2- 원형질체의 추출을 위해 개발되었다. 이와 같이, 후술하는 프로토콜 BY-2 현탁 배양을 이용하여 검증되었지만, 어떤 식물 세포의 현탁 배양으로 수정할 수있는 있어야한다. 개념 증명 실험은 하드 산호 Porites에서 오렌지 형광 단백질 (OFP) 리포터 유전자 (pporRFP)는는 CaMV 35S 프로모터의 제어하에 31 porites 사용하여 수행됩니다.

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프로토콜

서스펜션 세포 배양 1. 구축

  1. BY-2 미디어 PO 4 4.43 g Linsmaier & 스쿡 기저 배지, 수크로오스 30 g, 200 mg의 KH 2를 첨가하여 액을 제조하고, 증류하여 200 내지 900 μg의 2,4- 디클로로 페녹시 아세트산 (2,4-D)의 용액 물과 0.1 M KOH와 5.8의 pH. pH를 조정 한 후, 증류수 및 오토 클레이브 1,000 ml의에 최종 볼륨을 조정합니다. 미디어는 4 ° C에서 2 주까지 저장할 수 있습니다.
  2. 1 %의 추가 BY-2 미디어 250 ㎖의 삼각 고체 BY-2 미디어에 성장 100 BY-2 미디어 액체 ml의 BY-2 캘러스의 한 조각 (> 직경 1cm)와 플라스크 (액체 접종 한천) 및 알루미늄 호일로 밀봉. 5 일간 진탕 28-30 ° C에서 문화를 품어.
    참고 : 액체 문화가 빠르게 자라다 바와 같이 BY-2 캘러스는 장기 저장을위한 고체 배지에 유지된다. 배양 부피는 통상적으로 100 ml의 배양은 세 서른 6 w 로딩 가능한 것, 필요에 따라 조정할 수있다엘 플레이트.
  3. 전송이 BY-2 배양 신선한 BY-2 미디어의 98 ml의에 로그 상 ㎖의 진탕 28 ~ 30 ℃에서 5~7일 동안 품어.
    참고 캘러스 100 5-7일 오래 배양 희석보다는 접종 : 확립 된 액체 배양 물의 계대 정기적 하나를 사용하여 수행 될 수있다.
  4. 세포가 빠르게 정착하는 바와 같이, 철저하게 문화를 믹스 및 전송 세포 배양의 6 ml의 15 ML 원뿔 바닥 원심 분리기 튜브와 세포가 적어도 10 분 동안 정착하자. 상등액을 제거하여 총 부피의 50 %까지 충전 셀 볼륨을 조정한다.
  5. 소화를위한 6 웰 플레이트의 각 웰에 500 μl를 반전하고 피펫으로 튜브를 흔들어. 그들은 조밀 한,이 단계에서 세포를 전송 넓은 구멍 피펫을 사용하여 표준 피펫 팁을 방해 할 것입니다.

2. 원형질체 분리

  1. 로봇 시스템 (그림 1A)의 모든 구성 요소의 전원을 켜고 소프트 예약 판 이동기 작업을 엽니 다제품. 작업 스케줄링 프로그램은 장비의 각 부분 사이의 판의 전송을 가능하게하는 다른 장비와 마이크로 이동기를 통합합니다.
  2. 다음과 같이 이전에 실험에, 플레이트 이동기 소프트웨어 실험 실용의 각 부분에 대한 기술적 프로토콜에 사용되는 실험 실용 사양 (예를 들면, 접시, 뚜껑)뿐만 아니라, 시작 및 종료 위치를 정의합니다 :
    1. 판 이동기 소프트웨어의 기본 도구 모음에서 설치 프로그램을 클릭하고 관리 컨테이너 형식의 명령을 선택합니다.
    2. 컨테이너 유형이 기존의 컨테이너 형식 라이브러리에 나와있는 경우, 해당 컨테이너를 선택합니다.
    3. 컨테이너 유형이 기존의 컨테이너 형식 라이브러리에없는 경우 새 컨테이너 유형을 지정하기 위해 추가를 클릭합니다.
    4. 새 컨테이너 유형을 추가 한 후, 해당 탭에 (오프셋 높이, 폭, 스택 크기 및 그리퍼) 새로운 컨테이너의 크기를 삽입하고 저장을 클릭합니다.
      1. 정확한 치수는 제조 업체에서 사용할 수없는 경우, 정확하게 캘리퍼스를 사용하여 가장 가까운 밀리미터에 모든 차원을 결정합니다. 컨테이너의 크기를 측정하는 오류는 판 이동기의 고장의 원인이됩니다.
    5. 반복 판 이동기가 발생하는 모든 컨테이너 유형에 대한 2.2.4.1 통해 2.2.2 단계를 반복합니다. 모든 실험 실용이 단계의 종료 후, 각 용기 (단계 2.2.6)의 시작 및 종료 위치를 정의 할 필요가있다.
      참고 :이 프로토콜에 대한 실험 실용은 6 웰 플레이트, 깊은 웰 플레이트, 그리고 96 웰 형광 검사 플레이트를 포함한다.
    6. 각 컨테이너의 시작과 끝 위치를 정의하려면, 특정 프로토콜에 시작 / 종료 탭을 클릭합니다. 우선, 각 콘테이너의 개시 위치를 선택한다. 다음으로, 시작과 끝 위치에서 모두 뚜껑 / Unlidded에 대한 확인란을 선택합니다. 모든 컨테이너에 대해 반복합니다.
      참고 : 용기는 EQU의 또 다른 조각에 남아있을 경우ipment은 (대신 판 이동기의) 최종 위치는 비워 둘 수 있습니다.
  3. 이 단계에서 수동으로 전체 워크 플로우의 시작 위치로 모든 판을로드합니다. 호텔 (3)에 BY-2 세포 호텔에 플레이트 히터 / 냉각 둥지 (2) 상 변환에 사용되는 96 깊은 웰 플레이트, 및 50 ml의 원뿔 2, 6 웰 플레이트를 96 웰 형광 검사 판을로드 다중 모드 분배기 상에 효소 용액 (보조 파일 1.2.2 절 참조)를 포함하는 튜브.
    1. 변환이 프로토콜하에 수행 될 경우, 웰 당 플라스미드 DNA 10 μL에 96 딥 웰 플레이트를 미리로드 (1 μg의 / μL하는 260/280> 1.8)을 OFP 리포터 작 제물을 함유하는 플레이트에 부화 4 ℃에서 가열 / 냉각. 각 웰은, 하나의 변환을위한 실험 장치에 따라 달라집니다 가득 우물 따라서 번호를 사용합니다.
  4. 하려면 자동 모든 용품 및 플레이트로드지정된 위치에서 D 액 처리 플랫폼은 자동화 제어 소프트웨어 (도 1b)의 각 항목의 위치를 정의한다.
    1. 1 열의 MMG에 40 % PEG 200 μL (0.4 M 만니톨, 100 밀리미터의 MgCl 2, 4 밀리미터 MES, pH를 5.7), 프로피 듐 요오다 이드 200 μL 미리로드 96 웰 플레이트 하중 (PI, 1 μg의 / ㎖) 2 열 및 3 열 (둥지 2) 에탄올 200 μL, 그리고 둥지 8 피펫 팁 상자에 입력하십시오.
    2. 메뉴에서 자동 액체 처리 플랫폼의 소프트웨어의 실험 실용의 위치를 선택 도구를 정의하고 연구소 용 편집기를 클릭합니다.
    3. 풀다운 메뉴에서 실험 실용의 유형을 선택하거나 새 연구소 용 버튼을 사용하여 새 실험 실용 유형을 정의합니다.
    4. 기본 프로토콜 탭을 선택하고 구성 연구소 용을 클릭하여 선택 실험 실용의 각 부분의 위치를 정의합니다. 자동화 된 액체 처리 플랫폼에 배치 실험 실용의 각 부분이 있는지 확인프로토콜을 실행하기 전에 정의.
    5. 자동화 된 프로토콜을 트리거하려면 프로필 탐색기 창을 클릭하고 실행하는 프로토콜 (원형질체 분리, 세포 수, 및 PEG-매개 변환)의 이름을 선택합니다.
    6. 프로토콜에서 사용되는 모든 장치를 초기화 실행을 클릭합니다.
    7. 마지막으로, 작업 탐색기 창에서 시스템에있는 모든 용기 / 실험 실용을 확인하고 자동화 된 프로토콜을 시작하기 위해 작업 단위 추가를 클릭합니다.
      참고 : 자동화 된 프로토콜의 전체 설명은 보조 파일에 포함되어 있습니다.

3. 세포 수에 대한 표준 곡선을 설정

  1. 수동 1 ㎖를 1 × 106 원형질체 / ml의 농도로 원형질체를 농축시킨다. 원심 분리기는 10 분 동안 1,000 XG에서 원형질체 및 상층 액을 제거합니다.
  2. 수동으로 원형질체 펠릿에 (4 ° C로 유지) 70 % 에탄올 900 μl를 추가와 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 세포를 해결하기 위해 얼음에 10 분 동안 품어.
  3. 핵 라벨 및 플레이트 리더 검출을 허용하도록 원형질체에 PI 100 ㎕ (1 μg의 / ㎖)를 추가합니다.
  4. 로드 2 열에서 시작하여 96 웰 형광 검사 판의 각각의 열과 행에 BY-2 미디어 액의 80 μL.
  5. 96 웰 형광 검사 판의 1 열에서 열에서 각 웰에 BY-2 미디어 원형질체의 70 μl를 50 μl를 추가합니다.
  6. 자동화 된 액체 처리 플랫폼의 둥지 6 접시를 놓고 2 배 연속 희석을 실행합니다.
    1. 자동화 된 액체 처리 플랫폼에 일련의 희석을 수행하려면 직렬 희석 마법사를 실행 클릭하고 전송 볼륨 (60 μL), 믹스 및 볼륨 (2, 70 μL), 초기 우물의 수 (열 1, 행 AF), 희석을 조절 우물 (열 2-11, 행 AF) 및 흡인 및 분배 특성 (물론 바닥에서 0.5 mm).
    2. 매개 변수를 설정 후, 저장프로토콜을 실행하는 거라고.
      주 : 모든 원형질체는 (인해 세포의 고정에) PI으로 표시되기 때문에, 형광은 원형질 농도에 비례한다.
    3. 시리얼 희석이 완료되면 둥지 (9)으로부터 상기 플레이트를 제거하고, 플레이트 리더에 삽입하고 플레이트 판독기 소프트웨어의 표준 곡선 프로토콜을 실행.
      주 : 표준 곡선은 다음 공지 원형질 농도로 각 웰에 PI에서 (여기 536 ㎚ / 620 nm의 발광)을 형광을 비교하여 생성된다.
  7. 플레이트 리더 프로토콜의 종료 후 플레이트를 제거한 오토 클레이브 또는 '바이오 프로토콜에 정의 된 다른 드 및 활성화 절차에 대한 형질 전환 세포를 수집한다.

변환 4. 현미경 분석

  1. 형질 전환 된 원형질체 로봇 시스템의 호텔 (1)에서 (자동 프로토콜 3, 보충 파일의 제품)와 플레이트를 제거합니다.
  2. 회전거꾸로 현미경, 카메라, 형광 램프.
  3. , 원형질체에 초점을 맞춘 초기의 10 배 목표를 선택 할로겐 램프를 켠 형광 램프 셔터를 닫습니다.
  4. 브라이트를 사용하여 원형질체에 현미경 시스템과 초점 상에로드 플레이트.
  5. 원형질체에 초점을 맞춘 후, 할로겐 전구를 끄고 형광 램프 셔터를 엽니 다.
  6. 형질 전환 원형질체로 표시되는 pporRFP 단백질의 시각화를위한 설정 CY3 / TRITC 필터를 선택합니다.
  7. pporRFP 형광 마커를 표현 원형질체의 수를 결정하기 위해 각 웰을 스캔합니다.
  8. 형광 마커를 원형질체의 총 수를 표현 원형질체의 총 개수 등의 변환 효율을 계산한다.
  9. 고압 증기 멸균 또는 '바이오 안전성 프로토콜에 정의 된 다른 탈 활성화에 절차에 대한 승인 바이오 안전성 가방에 형질 전환 세포를 포함하는 접시를 수집합니다.

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결과

현재 연구에서, BY-2 배 속도는 15 hr의 평균 세포주기 길이 이전보고와 일치 배양은 배양되는 온도에 따라 14 ~ 18 시간에서 변화. 이 두배 속도로, 1 : 100부터 접종 5-7 일 동안 50 %의 적혈구 용적 (PCV)를 배양 선도 배양을 개시 하였다. 배양 매체 200㎖에 성장 된 상기 현재 프로토콜에서, 100 ㎖의 PCV 33 6- 웰 플레이트를 채우기에 충분한 세포를 제공 칠일, 생성 하였다. 원형질체 ?...

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토론

위에서 설명한 프로토콜은 성공적으로 원형질체 분리, 열거, 및 변환에 의해-2 담배 현탁 세포 배양을 사용하기위한 검증되었습니다; 그러나, 프로토콜은 쉽게 식물 현탁 배양으로 확장 될 수있다. 현재, 원형질체 분리 및 변형 옥수수 (ZEA 메이스) (10), 당근 (Daucus의 carota) (32), 포플러 (사시 나무속 euphratica) (33), 포도 (유럽 종 포도) (34), 기...

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공개

저자는 더 경쟁 재정적 관심이 없음을 선언합니다.

감사의 말

This research was supported by Advanced Research Projects Agency - Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Orbitor RS Microplate moverThermo Scientific
Bravo Liquid HandlerAgilent
Synergy H1 Multi-mode ReaderBioTek
MultiFlo FX Multi-mode DispenserBioTek
TeleshakeInheco3800048
CPAC Ultraflat Heater/coolerInheco7000190
Vworks Automation SoftwareAgilentSoftware used to control and write protocols for Agilent Bravo
Momentum SoftwareThermo ScientificTask scheduling software for controlling Orbiter RS
Liquid Handling Control 2.17 SoftwareBiotekSoftware used to control and write protocols for MultiFlo FX
IX81 Inverted MicroscopeOlympus
Zyla 3-Tap microscope cameraAndor
ET-CY3/TRITC Filter SetChroma Technology Corp49004
Rohament CLAB Enzymessample bottlelow-cost cellulase
Rohapect UFAB Enzymessample bottlelow-cost pectinase
Rohapect 10LAB Enzymessample bottlelow-cost pectinase/arabinase
Linsmaier & Skoog Basal MediumPhytotechnology LaboratoriesL689
2,4-dichlorophenoxyacetic acidPhytotechnology LaboratoriesD295
propidium iodideSigma AldrichP4170
Poly(ethylene glycol) 4000Sigma Aldrich95904-250G-FFormerly Fluka PEG
Propidium IodideFisher Scientific25535-16-4Acros Organics
CaCl2Sigma AldrichC7902-1KG
Sodium AcetateFisher ScientificBP333-500
MannitolSigma AldrichM1902-1KG
SucroseFisher ScientificS5-3
KH2PO4Fisher ScientificAC424205000
KOHSigma AldrichP1767
Gelzan CMSigma AldrichG1910-250G
6-well plateThermo Scientific103184
96-well 1.2 ml deep well plateThermo ScientificAB-0564
96 well optical bottom plateThermo Scientific165305
Finntip 1000 Wide bore Pipet tipsThermo Scientific9405 163
NaClFisher ScientificBP358-10
KClSigma AldrichP4504-1KG
MESFisher ScientificAC17259-5000
MgCl2Fisher ScientificM33-500

참고문헌

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