청각 HEI-OC1 세포를 사용한 작업

요약

House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) is one of the few mouse auditory cell lines currently available for research purposes. This protocol describes how to work with HEI-OC1 cells to investigate the cytotoxic effects of pharmacological drugs as well as functional properties of inner ear proteins.

초록

HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic drugs, these cells have been used to investigate drug-activated apoptotic pathways, autophagy, senescence, mechanism of cell protection, inflammatory responses, cell differentiation, genetic and epigenetic effects of pharmacological drugs, effects of hypoxia, oxidative and endoplasmic reticulum stress, and expression of molecular channels and receptors. Among other several important markers of cochlear hair cells, HEI-OC1 cells endogenously express prestin, the paradigmatic motor protein of outer hair cells. Thus, they can be very useful to elucidate novel functional aspects of this important auditory protein. HEI-OC1 cells are very robust, and their culture usually does not present big complications. However, they require some special conditions such as avoiding the use of common anti-bacterial cocktails containing streptomycin or other antibiotics as well as incubation at 33 °C to stimulate cell proliferation and incubation at 39 °C to trigger cell differentiation. Here, we describe how to culture HEI-OC1 cells and how to use them in some typical assays, such as cell proliferation, viability, death, autophagy and senescence, as well as how to perform patch-clamp and non-linear capacitance measurements.

서문

코르티 1의 하우스 귀 연구소 - 오르간은 (HEI-OC1) 세포를 형질 전환 마우스 ^{1, 2의} 청각 기관에서 파생됩니다. 33 ° C / 10 % CO ₂ (허용 조건)에서이 형질 전환 마우스에서 어떤 세포의 배양은 역 분화 가속 확산을 트리거하는 불멸화 유전자의 발현을 유도; 39 ° C / 5 % CO ₂ 이상의 HEI-OC1, 세포사 ^2,3의 경우에, 증식, 분화를 감소하고 (비 허가 조건) 리드 세포 이동.

HEI-OC1 세포를 복제하고, 10 년 전을 통해 우리의 실험실에있어서, 초기 연구는 특정 같은 prestin, 마이 오신 7A, Atoh1, BDNF, calbindin 및 칼 모듈 린 등의 인공 와우 유모 세포의 마커뿐만 아니라, 지원의 마커를 표현하는 지적했다 넥신 (26) 및 섬유 모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R) ^등이 세포. 따라서, 평 OC1이 commo을 나타낼 수 있음을 시사되었다코르티 ^2의 기관의 감각과지지 세포 n 개의 전구. 페니실린과 같은 비 ototoxic 간주 약물, ^2,3하지 않았다 동안 병렬 연구는 이러한 세포에서 카스파 제 -3 활성화 유도 시스플라틴 (cisplatin), 겐타 마이신과 스트렙토 마이신과 같은 ototoxic 약물을 원형 강력한 증거를 제공했다. 따라서,이 세포주는이 독성과 가능성이 독성하거나 새로운 pharmacological 약물 otoprotective 특성 선별 과정에도 세포 및 분자 메커니즘을 조사하기 시험 관내 시스템이 제안되었다. HEI-OC1 세포는 지난 10 년에 출판 이상의 백오십 연구에 사용 된 것으로 추정된다.

다른 약물의 잠재적 프로 - 세포 사멸 효과를보고하는 것은,이 세포주를 포함하는 대부분의 연구의 중요한 목표 이었지만, 자식 작용 및 노화와 같은 다른 중요한 세포 공정은 단지 HEI-OC1 세포 ^4-7 조사하기 시작했다. 나는NA는 우리의 실험실 ^(8)의 최근 연구는, 우리는 자주 병원에서 사용되는 다른 약물 약물에 의해 유도 된 세포 죽음, 생존, 증식, 노화와 자식 작용에 대한 데이터의 포괄적 인 세트를 수집하는 HEI-OC1 세포를 사용했다. 또한 동일한 처리를 수신하는 HEK-293 (인간 배아 신장 세포)와 헬라에서 해당 (인간 상피 세포)와 HEI-OC1 세포의 응답의 일부를 비교 하​​였다. 우리의 결과는 HEI-OC1 세포 연구중인 메커니즘 중 적어도 하나에 특유의 투여 량 및 시간 의존적 감도 특징적인 방식으로 각각의 약물에 반응 것으로 나타났다. 또한 실험 결과의 정확한 해석은 하나 이상의 기술 ^8과 평행 연구를 수행 할 필요하다고 그 연구에서 강조 하였다.

다른 연구에서는 prestin의 기능적 응답하여, 인공 모발 외부 셀 모터 단백질 (OHCs) ^9를 평가 HEI-OC1 세포의 사용을 검토 입니다. 우리는 허용 (P-HEI-OC1) 및 비 - 배양 HEI-OC1 셀 내의 prestin 발현 패턴뿐만 아니라 비선형 커패시턴스 (NLC) 및 전체 셀 패치 클램프 실험을 유동 세포 계측법 및 공 초점 레이저 주사 현미경 연구보고 허용 (NP-HEI-OC1) 조건. 우리의 결과는 표기된 NP-HEI-OC1 세포에서 시간 의존적으로 총 prestin 발현 세포막 파악 증가 모두. 흥미롭게도 또한 발견 총 세포 발현에 상당한 변화없이 세포질로 세포막에서 전좌 나 ⁺ K ⁺ ATPase의 감소와 상관 관계가 NP-HEI-OC1 세포의 세포막에 prestin 지역화 증가. 또, P-HEI-OC1 세포는 강력한 NLC는 세포막에 존재 prestin 분자의 밀도가 증가 할 때 감소 된 운동 기능을 prestin하는 관련 있다고 설명했다. 요컨대, 이러​​한 결과는 강하게 HEI-OC의 유용성을 지원1 세포는 청각 단백질을 조사합니다.

이 비디오 기사에서 우리는 어떻게 약물 유발 세포 독성 및 방법의 메커니즘 / S를 평가하는 방법은 세포 독성 연구에 대한 (P-HEI-OC1) 허용 조건에서 성장 세포를 사용하는 것이 편리하다 왜 문화 HEI-OC1 세포에 설명 전기 생리 연구를 수행하기 위해 (예를 들어, 패치 클램프, 비선형 커패시턴스 (NLC))는 prestin, 인공 OHCs의 분자 모터의 기능적 특성을 조사한다.

프로토콜

1. 세포 배양

주 : 모든 세포 배양 프로토콜 적절한 세포 배양 기술을 이용하여 수행되어야한다 (: 실험실 편람, 볼륨 I ¹⁰ 참조 용으로 세포 생물학의 제 3 장을 참조). HEI-OC1 세포는 적절한 부착 및 성장에 대한 세포 배양 접시의 추가 코팅 또는 치료를 필요로하지 않는다. 아주 중요한 : 세포 배양을 위해 유리 접시를 사용하지 않는; 표현형 및 약리학 적 약물로 세포의 생물학적 반응은 (게시되지 않은 G Kalinec & F Kalinec)을 변경한다; 기존의 플라스틱 세포 배양 요리 (재료 / 장비의 표 참조)을 권장합니다. 오염을 방지하기 위해 무균 기술에 특별한주의를 지불하지만, HEI-OC1 세포와 항생제 (예를 들어, 암피실린 또는 스트렙토 마이신)를 사용하지 않습니다. 필요한 경우 인 HeLa 및 HEK-293 세포 HEI ^OC1-8, 다른 세포주 수와 이전 시험에서 대조군으로 사용되었지만, 암포 테리 신 B를 사용이 목적을 위해 허용합니다.

1. 냉동 HEI-OC1 세포의 소생
   참고 맥리는 ^13,14 vascularis에서이 프로토콜은, 동일한 유전자 도입 ^11,12 코르티 기관에서의 이러한 OC-K3, 우리 실험실에서 개발 된 마우스 및 SV-K1에서 다른 세포주와 함께 사용될 수있다.
   1. 액체 N _2에서 냉동 보관 HEI-OC1 세포의 병을 제거하고 37 ℃의 물을 욕조에 넣습니다. 바이알의 하반부 잠수함과 얼음의 소량 만이 병에 남아 때까지 해동 할 수있다. 70 % 알코올로 유리 병의 외부를 닦습니다.
   2. (둘 베코 변형 이글 배지와 같은 예열 성장 배지 10 ㎖를 함유하는 15 ml의 원추형 튜브에 천천히 전체 부피 (~ 1.5 × ¹⁰⁵ 세포 / ㎖)을 적가 방식으로, 바이알로부터 세포를 피펫 및 배달 DMEM), 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충.
   3. t를 버리고, 5 분간 300-500 XG에서 튜브를 원심 분리하여 DMSO를 제거그 상층 액을 다시 현탁 신선한 성장 배지 (DMEM + 10 % FBS)의 9 ml의 세포. 매질과 반대로, 튜브의 바닥을 터치 피펫의 팁 서너 번 피펫에서 부유 세포의 광속 환류 덩어리 또는 세포를 해리하는 시트.
   4. 100mm 직경의 비 처리 플라스틱 세포 배양 접시에서 배양 배지에 현탁하고 세포의 총 부피를 놓는다.
   5. 10 % CO ₂ (허용 조건)와 33 ° C에서 세포를 품어.
2. HEI-OC1 세포의 계대
   주 : 합류하기 전 (~ 80 %) 세포가 죽어 배양을 방지하기 위해 정지하고 계대 배양하게한다. 이 프로토콜은 또한 맥리에서 ^{13, 14을} vascularis, 코르티 ^{11, 12,} 및 SV-K1의 기관에서 이러한 OC-K3와 같은 형질 전환 마우스에서 우리 실험실에서 개발 된 다른 세포주, 사용할 수 있습니다.
   1. PBS 2 ㎖로 세포를 오래된 매체를 제거하고 씻는다.
   2. ^표면적이 25cm 당 1 mL로하여, 0.25 % 트립신 용액으로 세포 단층을 커버. 세포의 40 % 이상이 분리되어야 다음 단계로 이동한다. 필요한 경우, 거꾸로 현미경을 사용하여 세포를 검사하고, "때리고 또는 탭"나머지 부착 세포를 분리 부드럽게 문화 요리를.
      참고 : 세포 사망에이를 수 있습니다 오랜 기간 동안 트립신으로주의; 충분한 및 전송 된 셀 것 계획된 연구 부족.하지
   3. 1.1.3에 설명 된 절차에 따라, 세포를 재현 탁하고, 15 ml의 원추형 튜브에 옮긴다.
   4. 300-500 XG에서 5 분 동안 원심 분리, 배지를 버리고 새로운 성장 배지로 세포를 수집하고, 적어도 네 개의 100mm 직경의 세포 배양 접시 그들을 시드. 접시 당 셀의 수는 회수 된 세포의 양에 의존 할 것이다. 10 % CO ₂ (P-HEI-OC1)와 33 ° C에서 세포를 품어을 위해 필요한 다시 여러 번 분할계획된 실험이나 새로운 주식을 생성.
   5. 재고 준비를 들어, 250-550 ml의 세포 배양 플라스크으로 100mm 직경의 요리를 교체; 실험을 위해, 작은 접시 또는 멀티 웰 플레이트보다 적합 할 수있다.
   6. 그들이 도달 할 때까지 차별화를 들어, ~ 허용 조건에서 80 %의 합류를 HEI-OC1 세포를 배양; 다음 2 ~ 3 주 동안 5 % CO ₂ (NP-HEI-OC1)를 39 ° C로 요리를 이동합니다.
      참고 : 세포가 점진적으로 확산 죽어 중지됩니다. 죽은 세포를 제거하기 위해 매일 매체를 변경합니다. 더 이상 세포가 실험에 사용할 수 없습니다 일반적으로 4 ~ 주 후, 세포의 원래의 수에 따라. 세포가 NP 조건에서 배치로 분화 빨리 시작되지만 모든 셀은 동일한 속도로 분화. 중요한 것은 정성을 제공, (그림 4를 대표 결과를 참조) 분화 과정에서 발현 및 막 지역화 증가 prestin분화의 정도를 정량적으로 표시.

2. 약물 세포 독성 연구

참고 : 허용 조건 (P-HEI-OC1)에서 성장 HEI-OC1 세포는 이러한 연구 (그림 1을 대표 결과를 참조)을 권장합니다.

1. 세포 생존율 (MTT 분석)
   1. 1.2에 기술 된 절차에 따라 P-HEI-OC1 세포를 수집하고 자동 세포 계수기 또는 혈구 하나로 계산. 2.0 × ¹⁰⁵ 세포 / ml로 농도를 조정한다.
   2. 96 웰 분명 평평한 바닥 플레이트 (물론 당 100 μL)에 세포를 시드 기판에 부착 밤새 배양 한 후 관심있는 약물로 치료. 공백 및 비 처리 된 세포 (대조군)을 포함하는 것을 잊지 마세요!
   3. 약물 치료 후 (보통 24 또는 48 시간 33 ° C에서), 제조 업체의 프로토콜 다음 MTT 분석을 수행합니다. 대개이 분석을위한 프로토콜은 다음과 같은 단계를 가지고 :
      1. 각 웰에 MTT 시약의 10 μl를 추가합니다.
      2. 보라색 ​​염료가 보일 때까지 2 ~ 4 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어 다음 각 웰에 MTT 세제 시약 100 μl를 추가합니다. 판을 흔들지 마십시오.
      3. 접시를 덮고 37 ℃에서 2 시간 4의 어둠 속에서 그것을 둡니다.
      4. 블랭크 (단독 성장 배지)을 포함하여, 각 웰에 570 nm에서 흡광도를 측정하기위한 마이크로 플레이트 리더를 사용. 생존율 100 %의 대조군 세포의 평균 OD를 사용하여 데이터를 정규화한다.
2. 카스파 3/7 활성화 분석
   참고 : 허용 조건 (P-HEI-OC1)에서 성장 HEI-OC1 세포는 이러한 연구 권장합니다.
   1. 1.2에 기술 된 절차에 따라 HEI-OC1 세포를 수집하고 자동 세포 계수기 또는 혈구 하나로 계산. 2.0 × ¹⁰⁵ 세포 / ml로 농도를 조정한다.
   2. WH에 세포를 시드(100 μL 아니라 당) 96 웰 플레이트를 ITE 벽으로, 기판에 부착 밤새 배양 한 후 관심있는 약물로 치료. 공백 및 비 처리 된 세포 (대조군)을 포함하는 것을 잊지 마세요!
   3. 약물 치료 후 (보통 24 또는 48 시간 33 ° C에서), 각 제조 업체의 프로토콜 다음 카스파 분석을 수행합니다. 일반적으로, 분석을위한 프로토콜은 다음의 단계를 가지고
      1. , 시약을 준비들을 잘 혼합하고 실온에 평형 수 있습니다.
      2. 배양기에서 세포를 제거하고, 플레이트를 실온으로 평형을 허용한다.
      3. 같은 피펫 팁 다른 샘플을 포함 우물을 터치하지 않음으로써 교차 오염되지 않도록주의하면서 각 웰에 시약의 표시 금액을 추가합니다.
      4. 접시를 덮고 300 ~ 500 rpm으로 접시 통을 사용하여 30 초 동안 혼합한다.
      5. 적어도 30 분 동안 실온에서 플레이트를 인큐베이션. Determin경험적으로 최적의 잠복기를 전자. 실내 온도가 온도 변동이 발광 판독에 영향을 미칠 것이기 때문에, 항온 배양기를 사용하여 변동하는 경우.
      6. 물론 각각의 발광을 측정하고 카스파 제 활성화의 100 %로 대조군 세포의 평균 발광을 사용하여 값을 정상화.
3. 세포 분열 (증식)
   1. 1.2에 기술 된 절차에 따라 HEI-OC1 세포를 수집하고 자동 세포 계수기 또는 혈구 하나로 계산. 2.0 × ¹⁰⁵ 세포 / ml로 농도를 조정한다.
   2. 96 웰 분명 평평한 바닥 플레이트 (물론 당 100 μL)에 세포를 시드 기판에 부착 허용 조건에서 하룻밤 배양 한 다음 관심있는 약물로 치료. 공백 및 비 처리 된 세포 (대조군)을 포함하는 것을 잊지 마세요!
   3. 처리 1 시간 후에는, 각각의 웰에 제조 100X BrdU의 1 μL를 추가 (5- 브로 모 -2'- deoxyuri) 솔루션을 식사, 33 ° C에서 인큐베이터에 번호판을 반환합니다.
   4. 12, 24, 48 시간 후, 해당 판에서 기존 매체를 제거하고 PBS 잘 한 번 각을 씻는다.
   5. 제조사의 프로토콜에 따르는 세포 증식 분석을 수행한다. 일반적으로, 분석을위한 프로토콜은 다음의 단계를 가지고
      1. / 정착 포함 제조자의 프로토콜에 표시된 변성 용액을 세척 완충액, 일차 항체 검출 용액 이차 항체 검출 용액 및 BrdU의 솔루션 시약을 준비한다.
      2. 제조자의 프로토콜에 명시된 양으로, 각 웰에 고정 / 변성 용액을 첨가하고, 30 분 동안 실온에서 플레이트를 유지한다.
      3. 고정 / 변성 용액을 제거하고 제조 업체의 프로토콜에 표시된 농도 차 항체를 추가합니다. 실온에서 1 시간 동안 플레이트를 유지한다.
      4. 기본 개미와 솔루션을 제거ibody, 플레이트를 세척 완충액으로 3 회 세척 한 다음 제조 업체의 프로토콜에 표시된 농도에서 차 항체를 추가합니다. 실온에서 30 분 동안 이차 항체와 함께 플레이트를 유지한다.
      5. 보조 항체 솔루션을 제거 플레이트를 세척 완충액으로 3 회 세척하고, 기판을 추가합니다. 실온에서 10 분간 배양 한 후, 정지 액을 합한다. 주의 : 색상의 변화를 제어; 용액이 매우 어두운지면, 10 분의 표준 현상 시간 전에 반응을 정지.
      6. 정지 솔루션을 추가 30 분 이내에 450 nm에서 흡광도를 참조하십시오.
4. 세포 독성
   참고 : 허용 조건 (P-HEI-OC1)에서 성장 HEI-OC1 세포는 이러한 연구 권장합니다.
   1. 세포 배양 배지 단독 (대조군) 또는 중간 플러스 관심있는 약물에, 24 ~ 48 시간 동안 일반적으로 허용 조건에서 HEI-OC1 세포를 품어.
   2. 치료 끝에PBS로 세포를 세 번 세척하고, 3 분 동안 비 - 효소 적 세포 해리 용액의 ^표면적이 25cm 당 1 ml의 분리를 사용.
   3. 분리 후, 수집하고 5 분 동안 3000 × g으로 원심 분리하여 세포를 펠릿, 상층 액을 제거하고 세포 독성 분석에 포함 된 시약으로 어둠 속에서 15 분 동안 세포를 염색.
   4. 흐름 cytometer 제조업체로 나타낸 바와 같이 유동 세포 계측법에 의해 라이브 HEI-OC1 세포의 수를 결정한다.
5. 노화
   1. 세포 배양 배지 단독 (대조군) 또는 중간 플러스 관심있는 약물에, 24 ~ 48 시간 동안 일반적으로 허용 조건에서 HEI-OC1 세포를 품어.
   2. 신뢰할 수있는 결과를 제공하는 것으로 알려져 Debacq-Chainiaux 외. ⁽¹⁵⁾ 또는 다른 방법에 의해 기재된 프로토콜 유세포하여 노화 관련 베타 - 갈 락토시다 제 양성 세포의 수를 결정한다. 유동 세포 계수를위한 간단한 프로토콜은 다음이다 :
      <리> 실험 치료 끝에, PBS로 세포를 세 번 세척하고 허가 조건에서 1 시간 동안 세포 배양 배지에 100 nM의 Bafilomycin A1 그들을 부화.
      1. ~ 33 μM의 최종 농도 C12FDG을 추가하고 1-2 시간 동안 세포를 배양 계속합니다.
      2. 3 분 동안 비 - 효소 적 세포 해리 용액의 표면적이 25 ^cm2로 당 한 용액을 사용하여 수확 PBS로 두 번 세포를 씻어, 5 분 동안 3000 × g으로 원심 분리하여이를 펠릿.
      3. 얼음 - 냉각 PBS로 세포를 재현 탁하고 흐름 cytometer 제조업체로 나타낸 바와 같이 유세포 포지티브 HEI-OC1 세포의 수를 결정한다.
6. 자식 작용
   1. HEI-OC1 셀 제어 결핍 1.2에 기재된 절차를 수행하여 (48 시간 동안 혈청을 박탈) 표준 프로토콜 다음 웨스턴 블롯 그들을 처리 모은다. 일반적으로 웨스턴 블롯을위한 프로토콜은 다음과 같은 일이분기 EPS :
      1. 1.0 × ¹⁰⁵ 세포 / ml의 농도로 6 웰 플레이트에 시드 HEI-OC1 세포. 24 및 / 또는 48 시간 후, 빙냉 PBS로 세포를 세척 하였다.
      2. 를 Lyse와 TNESV 버퍼 (1 % NP40, 50 mM 트리스 - 염산의 pH 7.5, 100 mM의 NaCl을, 2mM의 EDTA, 1 mM의 나 ₃ VO ₄₎ 얼음에 5 분간 프로테아제 억제제 칵테일과 1 ㎜ PMSF 200 μL.
      3. (각 웰의 바닥을 긁어) 세포를 모으고 4 ℃에서 5 분 동안 16,800 XG에서 마이크로 원심 분리기 튜브에 옮긴다.
      4. 상청액을 수집하고 BCA 분석을 사용하여 단백질 농도를 정량화.
      5. 단백질을 변성 5 분 동안 5 배 로딩 버퍼와 각 샘플에 1 mM의 DTT과 종기를 추가합니다.
      6. 4-12 %의 겔에서 SDS-PAGE를 사용하여 샘​​플을 실행하고 PVDF 막에 전송할 수 있습니다.
      7. 실온에서 60 분 동안 트윈 20 0.1 %와 TBS-T에서 5 % 무 지방 건조 우유와 세포막을 차단합니다.
      8. 주 개미와 4 ° C에서 하룻밤 멤브레인을 품어ibodies.
      9. 다음 날, TBS-T로 광범위하게 막을 세척하고, 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP) (1 : 1,500)에 접합 보조 IgG 항체와 함께 품어 1 시간 동안.
      10. 강화 된 화학 발광 (ECL) 감지 시스템과 면역 반응을 감지합니다. 표준 : (10 %의 무 지방 건조 우유, TBS-T에서 000 일) GAPDH를 사용하여 단백질의 발현 수준을 정상화.
   2. 웨스턴 블롯에서의 발현을 조사하는 적어도 그러한 Beclin-1과 같은 LC3B 자식 작용의 두 가지 지표 (통상적으로 1 : 2.5 %의 BSA와 TBS-T 1000 희석). GAPDH 또는 액틴 등의 단백질 발현의 제어를 찾을 것을 잊지 마십시오.
   3. 이러한 공개 도메인 NIH 이미지 또는 ImageJ에 (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/)와 같은 디지털 오 스캐너 또는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 농도계 관심있는 단백질의 발현을 평가한다.

HEI-OC1 세포 3. 전기 생리학 실험

1. 수확 세포
   참고 : 사용 세포가 50 % -80 %의 포화 상태에서 100mm 직경 배양 접시에 성장합니다. 트립신, Accutase하는 cetic 산 (PBS-EDTA)를 ETRA thylene D iamine t uffered의 알린 + 전자 나 효소가없는 솔루션, 또는 P hosphate-는 gigaseals의 수와 질에 심각한 영향없이 세포를 해제 사용할 수있다 . 그러나 어떤 경우에는, 트립신 처리 세포가 더 약해한다. 이러한 경우에, 세포는 실험을 시작하기 전에 약 30 분 동안 회복 할 수있다.
   1. 10 ml의 칼슘없이 PBS ^{2 +} Mg를 ^{2 +로} 두 번 세포를 씻으십시오.
   2. 5 % CO _2, 37 ℃에서 3 분 동안 요리를 같은 비 효소 세포 분리 솔루션으로 효소가없는 분리기 용액 2 ㎖를 추가하고 품어.
   3. 세포의 분리를 확인하기 위해 거꾸로 현미경을 사용합니다. 필요한 경우, 이동 CELL 배양 접시 더 세포를 분리하지만 가볍게 할.
      참고 : 접시를 흔들지 마십시오.
   4. DMEM + 10 % FBS 10 ML을 추가하고 부드럽게 및 10 ml의 피펫 다섯 번 아래로 세포를 피펫.
   5. 현미경으로 세포 봐. 셀> 80 %가 이미 (싱글)을 분리하는 경우, 더 피펫 팅이 필요하지 않습니다. 세포 클러스터 여전히 경우 80 % 이상의 세포가 하나가 될 때까지, 부드럽게 피펫 팅을 반복한다.
   6. 100 XG에 2 분, 15 ML 원뿔 튜브에 원심 분리기를 정지 세포의 ~ 10 ml에 배치하고 상층 액을 버린다.
   7. 세포를 재현 탁하기 - 외부 기록 솔루션 ~ 200 μl를 사용 (증류수로 310 mOsm 라이 보 비츠의 L-15 배지는 305로 조정). 셀의 광 제어 부드러운 막 가장자리 많은 단일 라운드 셀을 표시해야합니다.
2. 패치 클램프 및 NLC 측정
   1. 패치 클램프와를 사용하여 전압 의존 비선형 용량의 측정 (NLC)을 수행dequate 증폭기 및 소프트웨어뿐만 아니라 표준 전기 생리 학적 방법. 내부 (intrapipette) 용액 사용 150 밀리미터의 KCl, 1 ㎜의 MgCl _2, 0.1 mM의 EGTA, 2 mM의 ATP-마그네슘으로서, 0.1 mM의 GTP-나트륨, 10 mM의 HEPES; 트리스와 7.2로 산도를 조정합니다.
   2. 현미경, 라운드 부드러운 막 가장자리 하나, 건강한 셀을 선택합니다. 세포 표면에 유리 피펫의 끝을 첨부하여 막 저항을 확인한다. 이는 1 ~ 2 ㎛, 피펫 팁의 내경 (ID)에 대응하는 약 3-6 수 MΩ이어야한다.
   3. 조심스럽게 세포의 세포막에 대한 마이크로 피펫 팁을 누른 다음 흡입을 적용합니다. 100 기가 옴 (기가 시일) - 세포막의 일부 (10)의 순서로 전기 저항을 발생 피펫으로 흡입한다.
   4. 흡입 펄스와 세포막을 파괴하여 전체 셀 조건을 확립한다.
   5. 제어 ^9로, 같은 HEK-293과 같은 prestin을 표현하지 않는 세포를 사용하여.
      참고 : 현재 응답은 5 kHz에서 필터링해야하고, 수정 잔류 직렬 저항의 효과를했다. 모든 데이터 수집 및 분석은 가장 일반적으로 로크 증폭기가 포함 된 소프트웨어를 사용하여 수행 될 수있다. 용량 함수는 막 전압 ¹⁶ 비선형 전하 관한 두 상태 볼츠만 함수의 1 차 도함수에 장착 될 수있다.
      
      

결과

최근 출판물의 몇에서 우리는 몇 가지 일반적으로 사용되는 약물 약물 HEI-OC1 세포의 반응을 평가뿐만 아니라 prestin 기능 ^8,9을 조사하기위한 연구의 포괄적 인 세트를보고했다. 이 연구에서 우리는 이전 섹션에 설명 된 모든 프로토콜을 사용했다.

이들 이전 연구의 결과들 중 하나는 HEI-OC1 세포가 비 - 허용 조건에서 ?...

토론

이 보고서에서 우리는 어떻게 문화 HEI-OC1 세포에 대해 설명하고 약물 유발 세포 독성의 메커니즘을 평가하기 위해 그들을 사용하고 prestin, 인공 OHCs의 분자 모터의 기능적 특성을 조사. 기술적 방법은, 그러나, 다른 연구에 쉽게 적응 될 정도로 일반적이다.

여기에 설명 된 모든 프로토콜은 잘 확립 된 세포 배양 기술 ^(10)의 올바른 사용을 필요로한다. 그냥 다른 세포?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEI-OC1 cells			ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS
Class II Biological Safety cabinet	The Baker Company	Sterilgard III	AND COMPANIES INDICATED IN THE
Refrigerated centrifuge	Eppendorf	5810R	PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY
Inverted microscope	Zeiss	Axiovert 25	EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR
Waterbath	Stovall	HWB115	PRODUCT COULD BE USED.
Cell counter	Nexcelom	Cellometer Auto T4
Two (2) Cell incubators, one at 33 °C/10% CO2 and other at 39 °C/5% CO2	Forma Scientific	3110
Cell culture dishes, PS, 100 mm x 20 mm with vents	Greinier Bio-One	664-160
Cell culture dishes , PS,  60 mm x 15 mm with vents	Greiner Bio-One	628160
Cellstar tissue culture flasks  250 ml	Greiner Bio-One	658-175
Cellstar tissue cultur  flasks 550 ml	Greiner Bio-One	660-175
6 well cell culture plate, with lid-Cellstar	Greiner Bio-One	657-160
Microtest Tissue culture plate, 96 well, flat bottom with lid	Becton Dickinson	353072
Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white, clear bottom	Greiner Bio-One	655098
50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars	Becton Dickinson	352070
15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars	Greiner Bio-One	188-271
PBS pH 7.4 (1x)	Life Technologies	10010-023
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-084
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH10073.1
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red	Gibco/Invitrogen	21083-027
Trypsin, 0.25%	Life Technologies	25200-056
TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit	Trevigen	4890-25-K
Caspase-Glo 3/7 Assay  kit	Promega	G8091
BrdU Cell Proliferation Assay Kit	Cell Signaling	6813
Non-enzymatic cell dissociation solution	Sigma-Aldrich	C5789
Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit	Promega	G8741
FACSAriaIII instrument	BD Biosciences	FACSAriaIII	With 488 nm excitation (blue laser)
Digital Blot Scanner	LI-COR	C-DiGit
Electrophoresis and Blotting Unit	Hoefer	SE300 miniVE
Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software	Molecular Devices	SpectraMax 5
Patch-clamp amplifier	HEKA	EPC-10
Puller for preparing patch electrodes	Sutter Instruments	P-97