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요약

Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.

초록

프리 용액을 모세관 전기 영동 (CE)은 전계의인가를 통해 용액 분석, 일반적으로 충전 된 화합물을 분리한다. 크로마토 그래피와 같은 다른 분석 분리 기술에 비해, CE 강력한, 저렴하고 효율적으로 (복잡한 자연 행렬 또는 중합체 샘플의 수에 대한) 어떤 샘플 준비가 필요하지 않습니다. CE는 빠르게 분리 된 화합물에 대해 관찰 된 신호는 용액에서의 양에 정비례로 실시간 (예를 들어, 화학 반응 속도)의 혼합물의 방출을 수행하기 위해 사용될 수있다.

여기서, CE 효율이 후속 생의학 애플리케이션 키토산 필름 상 펩티드의 공유 래프팅 모니터링 설명된다. 키토산의 항균 및 생체 특성은 이러한 세포 성장 기판 등 생물 의학 응용 프로그램에 대한 매력적인 소재 확인합니다. 공유 RGDS 펩티드를 (그 래프팅 아르기닌 - 글리신 -아스파르트 산 - 세린) 키토산 필름의 표면에 세포 부착을 향상시키는 것을 목적으로한다. 역사적으로, 크로마토 그래피 및 아미노산 분석 그래프트 펩티드의 양을 직접 측정을 제공하기 위해 사용되어왔다. 그러나 CE 제공하는 샘플 제제의 신속한 분리 부재 펩티드 래프팅 방법의 균등하면서도 정확한 실시간 모니터링을 가능하게한다. CE 분리는 반응 혼합물의 다른 구성 요소를 정량화 할 수있다 : 제 (비 그래프트) 펩타이드와 화학적 커플 링제. 이러한 방식으로 CE의 사용은 하류 어플리케이션에 개선 된 필름을 초래한다.

키토산 필름은 고체 NMR (핵 자기 공명) 분광법을 특징으로 하였다. 이 기술은 많은 시간이 걸린다 실시간으로 적용 할 수 있지만, 펩티드의 직접적인 측정치를 산출하고, 따라서 CE 기술을 검증한다.

서문

무료 용액 모세관 전기 영동 (CE)는 그 전하로 마찰 비율 1.2에 기반 솔루션의 화합물을 분리하는 기술이다. 충전 - 투 - 크기 비율은 종종 문헌에 언급되어 있지만,이 단순화는이 작품에서 폴리 펩타이드를 포함하여, 고분자 전해질에 적용되지 않습니다, 또한 작은 유기 분자 3에 적합하지 줬습니다. CE는 정지상 만 배경 전해질 (통상 버퍼)를 갖고 있지 않는 다른 분리 기술과 다르다. 이 기술은 5, 발효 양조주 6 합성 중합체 7 음식 샘플 8 지루한 샘플 준비없이 거의 용해 펩티드 (9) 상에 이식 식물 섬유 등의 복잡한 매트릭스 (4) 샘플의 넓은 범위를 분석 할 수있는 능력의 견고 할 수 정화. 이 용해 문제가 복잡한 고분자 전해질 (들에 특히 중요하다UCH 따라서 키토산 (10)와 젤란 검 11) 및뿐만 집계 또는 용액에 침전 존재하고 성공적으로 샘플 여과없이 분석되고있다. 또한, 아침 시리얼에 설탕의 분석 물 (8)에 침전 아침 시리얼 샘플의 입자 샘플을 주입하고있었습니다. 이것은 또한 분기 고분자 전해질 또는 공중 합체 (12, 13)의 분석을 확장합니다. 많은 작업은 특별히 프로테오믹스 (14), 천연 또는 합성 펩티드 15, 단백질 및 펩티드 (16)의 마이크로 칩 분리의 키랄 분리를위한 단백질의 CE 분석 기술의 개발에 완성되었다. 분리 및 분석 모세관 일어날 때문에, 단지 작은 샘플 볼륨과 용매 크로마토 5,6,17 포함한 다른 분리 기술보다 낮은 운전 비용이 CE 할 수있게하는 데 사용된다. CE 분리하여 고속이기 때문에,이 과정 제어를 허용반응 속도의 반지. 이는 개선 된 세포 부착 18 키토산 필름 상 펩티드의 이식의 경우에서 설명 하였다.

키토산은 키틴의 N의 -deacetylation 유래의 다당류이다. 키토산의 생체 적합성으로 인해 21, 18, 20 19 생체 접착제 및 세포 증식 기질로서 키토산 필름 등 다양한 생물 의학 응용에 사용될 수있다. 피브로넥틴, 콜라겐 및 라미닌 등의 특정 세포 외 기질 단백질에 대한 세포 부착은 직접 셀 (22)의 생존에 연결된다. 특히, 다른 세포 유형은 종종 생존과 적절한 기능에 대해 서로 다른 세포 외 기질 단백질에 부착이 필요합니다. 키토산 필름에 세포 부착은 피브로넥틴 (23)의 접목을 통해 개선 된 것으로 나타났다; 그러나, 제조, 정제 및 대형 단백질의 접목은 경제적으로 실행되지 않습니다. 대안 작은 펩타이드의 범위는 근래E는 많은 세포 외 기질 단백질의 특성을 모방 할 수있는 것으로 나타났다. 예를 들어, 피브로넥틴의 모방 체로서 RGD 펩티드 (아르기닌 - 글리신 - 아스파르트 산) 및 RGDS (아르기닌 - 글리신 - 아스파라긴산 - 세린)을 촉진하고 세포 부착 (24)을 증가시키는 데 사용되어왔다. 키토산 필름 상에 RGDS의 공유 이식은 생체 내 18 피브로넥틴에 연결하는 것으로 알려진 세포에 대한 향상된 세포 부착 결과. 더 큰 단백질을 대체하는 것은 동일한 기능은 상당한 비용 절감을 제공이 작은 펩티드 피브로넥틴을 추천.

이전 18 공표 여기서, 키토산 래프팅 펩티드 하였다. 이미 증명 된 바와 같이, 이러한 접근법은되도록 RGDS의 카복실산 기능화 할 커플 링제 EDC-HCl을 (1- 에틸 -3- (3- 디메틸 아미노 프로필 ) 카 보디이 미드 ) 및 NHS (N의 -hydroxysuccinimide)를 이용하여 간편하고 효율적으로 식립을 제공 에 이식키토산 필름. 이 래프팅 방법의 두 가지 장점은 키토산 또는 펩티드의 임의의 변형을 필요로하지 않는다는 점이며, 이는 향후의 세포 배양 애플리케이션 (18, 20)과의 호환성을 극대화하는 수성 매질에서 수행된다. 커플 링제와 펩티드가 충전 될 수있는 바와 같이, CE 반응 동력학의 분석에 적합한 방법이다. 중요한 CE 통해 반응 속도 분석 래프팅 반응의 실시간 모니터링을 가능하게하고, 따라서 모두 최적화 래프팅 정도를 정량 할 수 있습니다.

그것은 통상적으로 필요하지 않다하지만, CE 분석 결과는 공유 래프팅을 입증 고체 NMR (핵 자기 공명) 분광학 25, 26를 사용하여 키토산의 필름 상에 그 래프팅 펩타이드의 직접 측정에 의해 오프라인으로 확인 될 수있다 막 (18) 상에 펩타이드. 그러나, 고체 상태 NMR 분광법에 비해 실시간 분석을 제공CE 실시간 펩티드 소모와 반응의 동역학을 평가하는 것이 기능의 정량화 할 수있다.

상술 한 방법은 간단하고, 그 래프팅 정도 간접 정량 키토산 필름 상에 그 래프팅 펩티드를 실시간으로 분석 할 수있다. 입증 된 방법은 다른 화학적 반응만큼 반응물 또는 충전 할 수있는 분석하고자하는 제품의 실시간 정량적 평가로 확장 될 수있다.

프로토콜

키토산 필름 1. 준비

  1. 초순수로 100 ㎖ 완전한 빙초산 2g을 칭량.
  2. 2 % m / m 아세트산 수용액 100 ㎖를 추가, 키토산 분말 중 1.7 g을 달아. 어느 알루미늄 박 또는 어둠에 덮여 실온에서 교반 바 및 자기 교반 플레이트 5 일 동안 교반한다.
  3. 1 시간 동안 23 ° C에서 1,076 XG에서 키토산 분산을 원심 분리기. 주사기와 뜨는을 수집하고 침전물을 버린다.
  4. 각 막 분취 액을 실온에서 9cm 플라스틱 페트리 접시에 키토산 현탁액 10ml를 들어. 최소 7 일 동안 건조 다루는 영화를 둡니다.
  5. 사용 가위는 1 × 1cm 사각형으로 건조 필름을 잘라. 참고 : 실험은이 단계에서 일시 중지 할 수 있습니다.

인산염 완충 식염수 2. 준비 (PBS)

  1. 8g 염화나트륨을 달아, 0.2 g의 염화 칼륨, 1.44 g 소듐 수소 진료 기관 연합phate 0.24 g 인산이 수소 칼륨.
  2. 초순수 800 ㎖에 이들 칭량 화학 용해시키고, pH 7.4의 농축 염산으로 용액을 적정한다.
    참고 : 실험은이 단계에서 일시 중지 할 수 있습니다.

pH가 9.2에서 75 mM의 나트륨 붕산염 완충액 3. 준비

  1. 붕산의 3.0915 g을 달아. 초순수 75ml를 그것을 녹인다.
  2. 10 M 이상의 농도의 수산화 나트륨 용액으로 pH가 9.2로 붕산 용액을 적정한다.
    주의 : 농축 수산화 나트륨 용액은 부식성와 장갑으로 취급되어야한다.
  3. 초순수 완전한 용액 100 ㎖을 얻었다. 이것은 pH가 9.2에서 500 mM의 붕산 나트륨 완충액을 산출한다.
  4. 75 mM의 붕산 나트륨 완충액을 초순수로 500 mM의 붕산 나트륨 완충액을 희석. 참고 : 실험은이 단계에서 일시 중지 할 수 있습니다.

키토산 인터넷 4. 준비그 래프팅 반응에 대한 LMS

  1. 실온에서 배양 접시에서 2 시간 동안 PBS 5ml에 10 평방 키토산 필름 (1 × 1cm)을 헹군다.
  2. 이 기간 동안, 준비 및 모세관 전기 기기 (5 단계) 유효성.

모세관 전기 영동 장비의 5. 준비 및 검증

  1. 50㎛의 내부 직경이 43.5 cm 노출 된 용융 실리카 모세관 준비 A의 설정된 길이에서 모세관의 폴리머 외피를 약하게하여 (전체 길이, 검출 윈도우의 유효 길이는 43.5 cm 보통 35 cm이다) 무딘기구는 모세관을 스냅.
    1. 입구에서 8.5 cm의 폴리머 코팅을 구울 라이터를 사용하여 모세관을위한 창을 만들고이를 냉각 한 후 에탄올로 깨끗하게 닦아냅니다. 라이터와 함께 몇 밀리미터의 각 끝 부분에있는 모세관의 코팅 굽기, 그것은 냉각 후 에탄올로 깨끗하게 닦아냅니다.
    2. 장소 모세관 INSI드 검출 창은 입구와 출구가 동일한 길이로 그 배치 및 카세트의 스핀들 주위를 감아 모세관 카세트에 설치하고. 그런 다음, 모세관 전기 영동 기기에서 카세트를 설치합니다.
  2. 각 분리 방법의 파라미터를 설정한다. 소프트웨어 메뉴에서 "전체 방법을 편집"다음 "방법"을 선택합니다. (예를 들면 25 ° C, 10 분, 30 kV로) 분리에 이용되는 온도, 시간, 전압, 바이알을 설정한다.
    1. (수중) 1 M 수산화 나트륨 (물), 0.1 M 수산화 나트륨, 초순수로 5 분, 75 mM의 나트륨 붕산염 완충액으로 5 분 5 분 10 분 : 프리 컨디셔닝 섹션 연속 플러시 세트 분석의 시리즈의 첫 번째 방법의 pH 9.2에서.
    2. (수중) 1 M 수산화 나트륨, pH가 9에서 75 mM의 나트륨 붕산염 완충액으로 5 분 1 분 : 연속 방식의 경우, 세트를 프리 컨디셔닝 섹션의 연속 플러시를 설정한다.2.
    3. 주입 섹션에서 모든 방법을 10 초 동안 30 mbar의 압력을 가진 유체 분사에 대한 매개 변수를 설정합니다. 상기 분리 부에서 모든 방법 9 분 동안 25 ° C에서 30 kV로의 분리 조건을 설정한다.
      주 : 제조 업체 사이에 다를 수 있습니다 CE 기기를 조작하기위한 절차로 특정 CE 기기의 사용자 설명서를 참조하십시오. 하루에 1 M 수산화 나트륨 용액을 준비한다.
  3. 주사하고 (75 mM의 나트륨 붕산염 완충액 450 μL로 희석하고 물, 10 % v / v의 디메틸 술폭 시드 10 μL (DMSO)) 중성 내부 표준 물질을 분리한다. 주입 한 후 동일한 방법에 oligoacrylate 표준 분리, 모세관의 유효성을 확인하기 위해 (10g ∙ L -1로 초순수에 용해 된 물질을 목록 참조). 그 래프팅 반응이 시작할 준비가 될 때까지 여기 순서를 일시 중지합니다.

키토산 필름에 RGDS 6. 손톱

  1. 펩타이드를 체중 (1 mg을 RGDS)상기 커플 링제 (3 mg의 EDC-HCl을 2 mg을 NHS).
  2. 2 시간 PBS에서 키토산 막 균열의 개시 후, 상기 펩티드 및 PBS 5ml에 커플 링 에이전트를 녹인다.
    1. 이 솔루션의 50 μL 나누어지는 가져 가라. 표본에 내부 중립 표준으로 물에 10 % V / V의 DMSO의 2 μl를 추가합니다. CE로 나누어 분석 (7 단계 참조).
  3. PBS의 5 ㎖를 페트리 접시에서 키토산 필름을 세척하는 데 사용 제거합니다. 키토산 필름을 포함하는 페트리 접시에 펩타이드 커플 링 에이전트의 5 ml의 솔루션을 추가합니다.
  4. 파라핀 필름 페트리 접시를 덮고 실온에서 궤도 통에 놓습니다. 설정 한 시간에 반응 미디어의 50 μl의 분취 량을 가져 가라.
    주 : CE으로 총 분석 시간은 15 분이며, 따라서 분취 액을 15 분마다 (또는 두 반응이 병렬로 모니터하는 경우 30 분마다 등)를 취할 수있다.
    1. 각각의 알에 내부 중립 표준으로 물에 10 % V / V의 DMSO의 2 μl를 추가iquot.
      참고 : 분취 량은 즉시이 촬영으로 CE와 함께 분석해야한다 (7 단계 참조).
  5. 흔들어 나누어지는 제거의 4 시간 후, 진탕 기에서 페트리 접시를 제거합니다. 페트리 접시에서 반응 매질을 제거합니다. 키토산 필름을 씻어 PBS의 5 ML을 추가합니다.
  6. , 페트리 접시에서 PBS를 제거 초순수와 키토산 필름을 세척하고 밤새 건조 할 수 있습니다. 초순수를 제거하고 플라스틱 페트리 접시에서 -20 ° C에서 영화를 저장합니다.

그 래프팅 반응의 제 모니터링 CE 사용

  1. 주사 즉시 5.2 절과 분석 조건을 사용하여 배양 접시로부터 분리 한 후 반응 매질의 별개 분취.
  2. 분판 종료 후 10 분간 초순수 모세관을 헹군다. 10 분 동안 빈 유리 병 (공기)와 플러시를 통해 건조.
    주 : 실험은이 단계에서 일시 중지 할 수 있습니다.

8. 데이터 누 CE에 대한 tment

  1. 분리시의 전류 (이 경우 DMSO) 상기 전기 이동 마커의 이동 시간 모두 oligoacrylate 표준 분리 관찰 된 것과 유사하다는 것을 확인하여, 각각 분리의 유효성을 확인한다.
    주 : 변화가 50 μA 1.3 분의 이동 시간 값의 예상 전류 값으로부터 허용 10-15%까지 (더 높은 재현성이 요구되는 경우, 전기 영동 이동도의 값이 아닌 이동 시간으로 표기).
  2. 각각의 성공적인 분리를 들어, 오른쪽 수출 클릭하고 적절한 신호를 선택, 특정 데이터 세트를 선택하여 모세관 전기 영동 소프트웨어의 원시 데이터를 내보낼 수 있습니다.
  3. 세륨에 의해 기록 된 원시 데이터를 변환 (이동 시간의 함수로서 UV 흡광도로 표시). 수학 식 1에 따라, 전기 영동 이동도 μ에 X 축 (이동 시간 t의 m)를 변환 :
    n은 1 "SRC ="/ 파일 / ftp_upload / 54549 / 54549eq1.jpg "/> (1)
    L (D)가 상기 검출기의 길이이고, L의 t는 모세관의 총 길이는, V는 전압이고, t의 EO 중성 종 (이 경우 DMSO 내부 표준 물질) (27)의 이동 시간이다.
    28 : 다음의 수학 식 2의 전기 영동 이동성의 W (μ)의 분포에 대한 원시 데이터 (AU의 흡광도)의 Y 축 변환
    figure-protocol-4636 (2)

펩타이드 이식 필름 (18) 9. 추가 특성

  1. 4mm의 고체 NMR 로터에 자신의 주위에 롤 펩타이드 이식 키토산 필름을 삽입합니다. 영화를 팽창하고, 회 전자를 닫 인산 완충 식염수로 로터를 입력합니다. 몇 시간 동안 기다립니다.
  2. (13) 필름 분석 </ SUP> C NMR 스펙트럼 (18).

결과

CE 키토산 필름 상 펩티드 (예, RGDS)의 이식을 모니터링에 적합하다. 적합한 커플 링제는 키토산에 이식 할 (그림 1) 펩티드를 활성화 EDC 염산 및 NHS를 포함한다. CE는 반응 매질로부터 관심있는 다른 분자를 분리 할 수있다. electropherogram에 피크를 지정하려면, 순수한 RGDS는, EDC-HCl을하고 NHS는, 용해 주입 별도로 분리 하였다. 피크 할당 한 후, 반응 매질을 ?...

토론

여기에 설명 된 프로토콜의 단순함은 광범위한 애플리케이션에 이상적으로 적합하다. 그러나, 특별한주의는 다음과 같은 주요 단계에 지불해야합니다.

적절한 CE 악기 준비

이는 하루에 모세관 및 기기의 정당성을 확인하는 미지 시료의 분리 직전에 공지 된 표준 (뿐만 아니라 분리의 일련의 끝)를 분리하는 것이 중요하다. 이 표준은 oligoacr...

공개

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

감사의 말

MG, MO'C and PC thank the Molecular Medicine Research Group at WSU for Research Seed Funding, as well as Michele Mason (WSU), Richard Wuhrer (Advanced Materials Characterisation Facility, AMCF, WSU) and Hervé Cottet (Montpellier) for discussions.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
WaterMilliporeAll water used in the experiment has to be of Milli-Q quality
Chitosan powder (medium molecular weight)Sigma-Aldrich448877lot MKBH1108V was used. Significant batch-to-batch variations occur with natural products such as polysaccharides
Acetic acid - UnilabAjax Finechem2-2.5L GLlaboratory reagent
DimethylsulfoxideSigma-AldrichD4540laboratory reagent, slightly hazardous to skin, hazardous if ingested
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich221465 laboratory reagent, corrosive 
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Sigma-AldrichD80002Irritant to skin 
N-hydroxysuccinimide Sigma-Aldrich130672Irritant to skin
Sodium chloride Ajax Finechem466-500Glaboratory reagent
Potassium chloride - UnivarAjax Finechem384-500Ganalytical reagent, slight skin irritant
Disodium hydrogen phosphate - UnilabAjax Finechem1234-500Glaboratory reagent, slight skin irritant
Potassium dihydrogen phosphate - UnivarAjax Finechem4745-500Ganalytical reagent, slight skin irritant
Oligoacrylate standardcustom madeSee reference for synthetic protocol: Castignolles, P.; Gaborieau, M.; Hilder, E. F.; Sprong, E.; Ferguson, C. J.; Gilbert, R. G. Macromol. Rapid Commun. 2006, 27, 42-46
Boric acid BDH AnalR, Merck Pty Ltd10058Corrosive
Hydrochloric acid - UnilabAjax FinechemA1367-2.5Llaboratory reagent, corrosivie
Fused silica tubingPolymicro (Molex)TSP050375Flexible fused silica capillary tubing with standard polyimide coating, 50 µm internal diameter, 363 µm outer diameter 
Agilent 7100 CEAgilent TechnologiesG7100CECapillary electrophoresis instrument
Orbital shaker IKAKS260
Electronic balanceMettler ToledoMS204S
Milli-Q Synthesis MilliporeZMQS5VF01Ultrapure water filtration system
Parafilm LabtekPM966Parrafin wax

참고문헌

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