핵산 폴리아닐린 계 센서

요약

Nucleic acids are common analytes for assessing biological systems; however, bias from enzymatic manipulation can cause concern. Here a method is described for label-free detection of nucleic acids using polyaniline. This sensitive, cost-effective sensor technology can distinguish single nucleotide differences between molecules.

초록

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies rely on enzymatic modification that can introduce bias and artifacts. A critical element of next generation detection platforms will be direct molecular sensing, thereby avoiding a need for amplification or labels. Advanced nanomaterials may provide the suitable chemical modalities to realize label-free sensors. Conjugated polymers are ideal for biological sensing, possessing properties compatible with biomolecules and exhibit high sensitivity to localized environmental changes. In this article, a method is presented for detecting nucleic acids using the electroconductive polymer polyaniline. Simple DNA "probe" oligonucleotides complementary to target nucleic acids are attached electrostatically to the polymer, creating a sensor system that can differentiate single nucleotide differences in target molecules. Outside the specific and unbiased nature of this technology, it is highly cost effective.

서문

Conjugated polymers provide many options for molecular sensors. This includes fluorescence, electronic, and colorimetric responses¹. There have been many efforts to incorporate conjugated polymers in nucleic acid sensors. However, most systems require secondary detection, limiting sensing options². Recently, we reported a conjugated polymer-based sensor platform built on polyaniline (PANI) that exploits properties of this polymer, creating a label-free system³. PANI is an extensively conjugated electro-active polymer with properties such as fluorescence and resistance that are suitable for measuring biological systems⁴. The excitons within the structure are not localized leading to mobility of the positive charge between monomeric subunits. This provides a flexible scaffold of positive charges that can interact with the negatively charged backbone of DNA^5,6. Importantly, electrostatically attached DNA is orientated such that nitrogenous bases can participate in base pairing. Association with DNA alters the electronic properties of PANI, an effect that can be enhanced by UV irradiation (Figure 1)³. Using this system, oligonucleotides complementary to target nucleic acids can be immobilized on PANI. Multiple studies have demonstrated that upon hybridization electrostatically adsorbed oligonucleotides dissociate from PANI or other cationic matrices due to conformational changes caused by the switch to a double-stranded DNA structure^3,5,7.

In a sensor system where probe attachment modulates conjugated polymer properties, hybridization events can be transduced without labels or enzymatic modification of probes or target nucleic acids. Conjugated polymers offer great flexibility in detection methods, one of which is fluorescence. Through monitoring PANI fluorescence, concentrations of target nucleic acids as low as 10^-11 M (10 pM) can be detected³. Detection is rapid, occurring within 15 minutes of hybridization, and specific where a single mismatch in a target molecule can be differentiated³.

Fabrication of PANI-sensors is straightforward. High molecular weight PANI can be generated that is well-dispersed in water using standard synthesis procedures involving aniline monomer, surfactant, and controlled addition of an oxidant. Yield can be very high and unreacted oxidant removed by washing with water, ensuring no further PANI growth. PANI-probe association occurs spontaneously upon mixture, and complex formation is enhanced by mild UV exposure. Hybridization can be carried out immediately, and the changes in PANI fluorescence assayed following a short incubation. The simplicity of this technology makes it highly accessible to many laboratories.

프로토콜

1. 처리 가능한 PANI 합성

1. 250 mL 둥근 바닥 플라스크에 클로로 폼 60㎖를 완전히 (1 ㎖, 11 밀리몰) 아닐린을 녹인다. 600 5 분 동안 회전과 얼음 0-5 ° C까지 시원한에서 저어. 이것은 일반적으로 15 ~ 20 분 (그림 2A)를합니다.
2. 600 rpm으로 교반하면서 둥근 바닥 플라스크 내의 아닐린 용액에 소듐 도데 실 벤젠 설포 네이트 (NaDBS) (7.44 g, 21 밀리몰)을 추가한다.
3. 20 ml의 물에 황산 암모늄 (APS) (3.072 g, 13.5 밀리몰)을 용해하고 모든 드롭 현명한 30 분 이상 반응의 과열을 방지하기 위해 추가 할 수 있습니다.
4. 24 시간 동안 0 내지 5 ℃에서 반응을 수행하고, 또 다른 24 시간 동안 실온에 도달 할 수있다.
5. 반응 혼합물은 초기에 15 분 후에 유백색 차례 관찰, 2 시간 후에, 최종적으로 24 시간 (도 2B-F) 후 진한 녹색 다음 암갈색.
6. 흐너 깔때기로 PANI-NaDBS 용액 필터. 같은 80 ml의 클로로포름 120 ml의 물과 혼합eparation 깔때기 (그림 2G).
7. 수성 상청액과 반응 NaDBS APS두고, 실온에서 24 시간 동안 용액을 인큐베이션하고, 분리 깔때기에서 어두운 녹색 PANI 수집.

2. PANI 프로브 혼합 UV 조사

1. 클로로포름 - 물 PANI 용액을 10 배 희석 (1 : 3 v / v)로 및 미세 원심 분리 튜브에서 15 분 동안 부드럽게 흔들하여 프로브 DNA 올리고 뉴클레오티드 6.4 μmol 희석 PANI 200 μL를 혼합한다.
2. 2 분 동안 가교제의 UV 1,200 μJ / ^㎠로 PANI-DNA 용액을 조사한다. 자외선 노출이 표시된 양을 제한하는 것이 중요합니다. UV에 노출 확장은 PANI 및 DNA의 공유 가교에 의한 가능성 PANI의 형광 변화를 타협.
3. 6 분 동안 17,000 XG에 원심 분리하여 펠렛 단지 및 인산염 완충 식염수 (PBS)으로 씻는다. 다시 펠렛 및 PBS에 다시 일시 중지합니다.

3. HPANI 프로브의 ybridization

1. PANI 프로브 단지의 200 μL에 핵산을 100 μM 보완 DNA 올리고 뉴클레오타이드의 8 μl를 추가 또는 대상.
2. 40에서 15 분 동안 혼합 용액을 흔들어 하이브리드를 수행 기음.
3. 6 분 동안 17,000 XG에서 원심 분리하여 PANI 단지 펠렛. PBS로 세척하고 물에 다시 일시 중지합니다.

4. 배출 정상 상태 형광 측정

1. 250 nm에서 여기로 96 웰 마이크로 플레이트에 다른 치료에서 PANI를 추가하고 270-850 nm의 범위에서 방출 형광을 측정한다. PANI위한 발광 피크가 500 nm의 주위를 관찰해야한다.

하이브리드 이중 5. 형광 현미경 측정

1. 48 시간 40 ° C에서 붕규산 유리 커버 슬립 건조에 코트 PANI를 삭제합니다.
2. 건조 PANI 필름에 프로브 (100 μM의 8 μl를) 추가하고 자외선 (1,200 μJ / ^㎠로 조사 ) 2 분.
3. 48 시간 동안 40 ° C에서 PANI-프로브 PBS 필름을 건조 씻으십시오.
4. 표적 핵산을 첨가하여 15 분 동안 혼성화를 수행한다. 이는 생물학적 샘플 또는 제어 표적 올리고 뉴클레오타이드 (100 μM 8 μL) 일 수있다. PBS의 세척에 따릅니다.
5. 500 nm의 긴 패스 필터, 40X 배율에서 형광 이미지를 얻습니다.

결과

도 2a는 APS 부가 전 중합 공정, 즉 개시시 반응 셋업을 캡처한다. 미셀 형성은 미셀 계면 프로세스 PANI 합성이 발생하는 반응의 초기 단계이다.도 2b는 5 분 후에 유백색 용액을 나타낸다. APS 반응 첨가 후 30 분 약간 갈색으로 변.도 2c는 올리고머의 형성과 연관된 색상 변화를 보여준다.도 2D가 함께 일관성 단쇄 PANI의 ...

토론

핵산의 PANI 기반 센서는 DNA 및 RNA와 상호 작용하기 위해서 물에 대한 중합체의 용해를 필요로한다. 물 PANI의 분산 이전 ^8보고 미셀을 형성하는 계면 활성제를 사용하여 달성된다. 4- sulfophthalic 산 도데 실 에스테르와 같은 다른 음이온 성 계면 활성제 여기서 사용 NaDBS 이외에도, 노닐 페놀에 톡실 레이트, 또는 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드와 같은 양이온 성 계면 활성제 등의 비이 온성...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aniline	Fisher Scientific	A7401-500	ACS, liquid, refrigerated
Ammonium peroxydisulfate	Fisher Scientific	A682-500	ACS, crystalline
Sodium dodecylbenzene sulfonate	Pfaltz & Bauer	D56340	95% solid
Chloroform	Fisher Scientific	MCX 10601	Liquid
DNA primers	MWG operon	n/a	custom DNA sequence ~20 bps
Microplate	USA Scientific	1402-9800	96 well, polypropylene as it is unreactive to chloroform
Microplate Adhesive Film	USA Scientific	2920-0000	Reduces well-to-well contamination, sample spillage and evaporation
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-544-D	PANI coated on UV irradiated cover glass
UV crosslinker	UVP	HL-2000	Energy: X100 μJ/cm2; Time: 2 min
Hybridization Oven	VWR	01014705 T	Temperature: 400 °C; with rocking for 15 min
Glass Apparatus	Fisher Scientific		Three necked round bottom flask for reaction; dropping funnel, stoppers, condenser, separating funnel
Microscope	Leica Microsystems	Leica IMC S80	Magnification 20X; Pseudo color 536 nm; Exposure 86 msec; Gain 1.0x; Gamma 1.6
Microplate Reader	Molecular Devices	89429-536