3 차원 영상의 신속한 획득 고해상도 Episcopic 현미경을 사용하여

요약

We describe a detailed protocol using high-resolution episcopic microscopy to acquire three-dimensional (3D) images of mouse embryos. This improved protocol utilizes a modified tissue preparation method to enhance penetration of the fluorescent dye, thereby permitting morphometric analysis of both small and large-sized specimens.

초록

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) morphometric data. Here, we describe the detailed protocol to image the entire mouse embryo. The protocol consists of four major sections: sample preparation, embedding, image acquisition and finally, 3D visualization. The technology requires specimens to be stained with a fluorescent dye, which can be problematic for large or dense specimens. To overcome this limitation, we have improved the existing protocol to enhance tissue penetration of the dye by pretreating the specimen with a solution containing urea and sodium dodecyl sulfate. The protocol uses only routine laboratory equipment and reagents for easy adaptation in standard laboratory settings. We show that the resulting high-resolution 3D images faithfully recapitulate the detailed morphologic features of the internal organs of mouse embryos, thereby permitting morphometric analyses. Together, we present a detailed and improved protocol using standard laboratory equipment to acquire high-resolution 3D images of small and large sized specimens.

서문

The advent of 3D imaging technologies has opened the possibility of systemic analysis of detailed morphological features during fetal development. A variety of 3D imaging modalities is now available include micro-magnetic resonance imaging (micro-MRI), micro computed tomography, high frequency ultrasound, optical coherence tomography, optical project tomography and episcopic microscopy^1-4. Each modality has its own unique features in resolution, contrast, speed, cost, in utero capability and availability.

Episcopic fluorescence image capture (EFIC) and high-resolution episcopic microscopy (HREM) are episcopic microscopy imaging methods⁴. Here, high-resolution serial images are captured continuously from the block face instead of tissue sections. The resulting images faithfully reflect detailed morphological features with minimal or no tissue distortion. The acquired volumetric data is readily converted to high-resolution 3-D images suitable for accurate morphometric analysis. Because of relative low cost and high resolution, HREM and EPIC have become the superior alternatives for systemic assessment of mouse models of human birth defects^2,4-8.

Both EFIC and HREM methods require specimens to be embedded in the suitable medium. EFIC detects autofluorescence emitted from the embedded tissue. Because of this, it is limited to specimens emitting high levels of autofluorescence but not those with relatively weak autofluorescence such as early stage embryos⁹. To overcome the dependency of autofluorescence, specimens are stained with a fluorescent dye such as eosin for HREM imaging. The choices of dyes and staining methods also make HREM more compatible to detect molecular signals in the context of tissue architecture and morphology^4,10.

In this article, we present an improved HREM protocol suitable for whole body assessment of the late stage mouse embryos. To facilitate staining, we include a pretreatment step to increase tissue penetration, thereby enabling HREM imaging of older mouse embryos.

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프로토콜

모든 동물의 사용은 보스턴 아동 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인됩니다.

1. 샘플 준비

1. 시간 제한 짝짓기
   1. 같은 케이지에서 함께 C57BL6 야생 형 남성과 여성을 배치합니다.
   2. 상대 플러그의 형성 초기에 다음날 아침에 확인합니다. 결합 플러그 (일명, 질 또는 교미 플러그) 차단 질을 강화 된 젤라틴 증착이다.
   3. 배아 일 0.5 (E0.5)와 같은 플러그 날짜를 설정합니다.
2. 마우스 배아의 분리
   1. CO ₂ 질식에 의해 임신 한 여성을 안락사.
   2. 흡수 패드 부정사 쥐를 넣고 70 % 에탄올로 복부를 스프레이.
   3. 피부를 들어 올려 수술 가위를 사용하여 꼬리 복부에서 초기 5mm 절개를합니다. 잘라 완전히 내부 장기를 노출 복부 피부를 제거
   4. 버지니아 근처 잘라GINA는 전체 자궁을 제거합니다.
   5. 자궁 경적을 따라 주입 사이트간에 잘라. 각 세그먼트 또는 수태 안에 하나의 배아를해야한다.
   6. 1 배 얼음처럼 차가운 인산 완충 식염수 (PBS)에서 자궁 세그먼트를 유지합니다.
3. 배아 해부
   1. 입체경 아래에 얼음처럼 차가운 PBS와 별도의 접시에 각각의 수태를 놓습니다.
   2. 순차적으로 미세 해부 집게를 사용하여 자궁 조직, 태반 후 태아의 세포막을 제거합니다.
   3. 1 배 얼음 차가운 PBS 큰 전송 피펫을 사용하여 함께 50 ML 튜브에 해부 배아를 전송합니다. 조직 손상을 최소화하기 위해 집게와 직접 배를 따기 마십시오.
4. 정착
   1. 정착액의 10 샘플 볼륨보다 24 시간 동안 4 ° C에서 10 % 중성 완충 포르말린 용액의 해부 배아를 수정합니다.
5. 전처리
   1. 어음 솔루션을 준비 : 4M 우레아, 증류수 10 % 글리세롤 4 % 소듐 도데 실 설페이트 (SDS).
   2. 어음 솔루션과 정착액을 교체합니다.
   3. 이주 - 조심스럽게 1 시간 동안 실온에서 로커에 시료를 회전한다. 두 번째와 세 번째 날에 한 번 클리어 솔루션을 교환한다. 시편 천천히 명확하고 반투명하게된다.
   4. 10 % 포르말린으로 지우기 솔루션을 교체하고 2 일 동안 로커에 둡니다.
6. 탈수
   1. 5 분마다 1X PBS로 3 회 전처리 샘플을 씻으십시오.
   2. 부드러운 로커에 실온에서 상승 에탄올 시리즈 샘플 탈수. E15.5 태아를 들어, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % 및 100 % 에탄올, 2 시간의 각 단계를 포함하는 상승 에탄올 시리즈를 사용한다. 이전 배아, 배양 시간을 증가시킬 필요가있다.
7. 더럽히는 것
   1. 에오신 Y 품목 소금과 0.02 0.1375 g을 추가 염색 용액을 제조아 크리 딘 오렌지 헤미 (아연 클로라이드) 100 % 에탄올 50ml로 소금 75g. 2 시간 동안 교반한다. 필터 종이 필터. 실온에서 저장하고 알루미늄 호일로 덮어 빛을 피하십시오.
   2. 1 시간 동안 염색 용액에 시료를 전송합니다.
   3. 신선한 염색 솔루션 및 얼룩 하룻밤로 교체하십시오.
8. 침투
   1. 침투 솔루션을 준비 : JB-4 삽입 키트의 해결 방법 100 ㎖, 촉매 C 1.25 g, 에오신 Y 품목 소금의 0.275 g 및 아 크리 딘 오렌지 헤미 (염화 아연) 염 0.055 g을 결합한다. 2 시간 동안 얼음 버킷 (200 RPM) 혼합 교반 한 후 여과지로 걸러.
   2. 4 ° C에서 침투 솔루션을 저장하고 알루미늄 호일로 덮어 빛을 피하십시오.
   3. (1 : 1) 염색 솔루션 : 솔루션을 침투하기 위해 배아를 전송, 4 ° C에서 로커에 적어도 3 시간 동안 배양한다.
   4. 솔루션을 침투하기 위해 배아 전송하고 3 시간 동안 배양추운 방에 로커에 대한 연구.
   5. 한 번 매일 침투 솔루션을 대체, 3 일 이상 부드러운 로커에 추운 방에 둡니다.

2. 퍼가기

1. 얼음에 해결 B 및 침투 솔루션을 유지합니다.
2. 바로 삽입하기 전에 (용액 B 및 침투 솔루션 1:25) 임베딩 솔루션을합니다.
3. 포함 금형 동양 시편은, 부드럽게 삽입 금형에 차가운 임베딩 솔루션을 붓는다. 다시 방향 필요한 경우 핀.
4. 퍼가기 솔루션이 응고되어 있는지 여부를 조사하기 위해 핀을 사용합니다. 시편 블록을 밀어하고, 필요한 경우 트림.
5. 교차 방향을 얻기 위하여 별도의 금형을 사용하여 시험편 블록의 방향.
6. 매립 금형의 상단에 블록 홀더를 넣습니다. 금형 및 블록 홀더 솔루션을 포함하기로 침수 될 때까지 조심스럽게 금형에 임베딩 솔루션을 붓는다.
7. 보조 용기에 시료를 유지하고 맡겨흄 후드에서 4 시간 - 3 얼음.
8. 4 °의 C에서 응고 표본을 저장합니다.
9. 매입 형을 벗겨. 블록의 시험편의 위치를 ​​검사하도록 경사 조명하여 실체 현미경 블록을 넣는다. 시편 주변 블록의 얼굴에, 마크 그리드 선.
10. 참조로 표시된 눈금 선을 이용하여 물질을 매립 접근 양을 제거 할 수있는 블록을 낸다.

3. 이미지 인식

1. 마이크로톰에 시편 블록을 고정하고 신선한 잘라 표면을 구하십시오. 설정 섹션 두께 (예를 들어, e9.5-10.5, 1.5 μm의, e11.5-12.5, 2.0 μm의, e13.5-15.5, 2.5 μm의, E16.5-이전, 3 μm의). 마이크로톰의 홈 위치에서 시료 / 블록을 유지합니다.
2. 수평 시편의 블록 표면에 직면 스테레오 줌 현미경을 탑재합니다.
3. 컴퓨터와 현미경 켜고 이미지 수집 소프트웨어를 시작합니다.
4. 시각화 및 블록면에 광학 초점이미징 소프트웨어의 '라이브 뷰'모드에서.
5. 블록 얼굴이 뷰 파인더의 중심에 있도록 필요한 경우 현미경 마이크로톰을 맞 춥니 다.
6. 전체 블록 얼굴이 뷰 파인더 안에 들어 오도록 줌을 조정합니다.
7. 녹색 형광 단백질 (GFP) 필터 (여자 470 ± 20 nm의, 다이크로 익 495 nm의, 방출 525 ± 25 nm의)를 선택하고 필요한 경우 집중할.
8. 수동 측정하고 노출 시간을 설정 (예를 들면, 80-400 미니 초).
9. 각 신선한 잘라 후 블록 얼굴의 이미지를 획득하고 가능하면 자동으로 이미지를 저장합니다.
10. 해상도, 단면 두께 및 줌을 포함하여 기록 중요한 매개 변수.
11. 전체 표본, 수출을 마무리하고 필요한 경우 JPEG 형식으로 모든 이미지 파일을 변환 한 후.
12. 이미징 처리 소프트웨어를 사용하여 모든 원본 이미지를 반전하고, 밝기 및 대비를 조정합니다.
13. 별도의 폴더에있는 모든 처리 된 이미지를 저장합니다.

4. 3D심상

1. 지침에 따라 3 차원 시각화 소프트웨어에 대한 모든 처리 된 이미지를 업로드합니다.
2. 입력 해상도와 부분 두께는 체적 데이터 (즉, 복셀 크기)의 모든 이미지를 변환 및 3D 파일을 저장합니다.
3. 자동 모드를 사용하여 모든 이미지를 맞 춥니 다. 필요한 경우 수동으로 개별 이미지를 조정합니다.
4. 새 파일 이름으로 정렬 된 이미지를 저장합니다.
5. 3 차원 시각화 소프트웨어를 사용하여 시험편의 형태 학적 특징을 분석한다.

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결과

우리는 E9.5과 E13.5 ⁸ 사이의 마우스 배아의 높은 품질의 HREM 이미지를보고했다. 후반 개최 배아의 이미지 품질은, 그러나, 크게 때문에 형광 염료 에오신의 제한된 조직 침투의 손상. 염색 효율을 높이기 위해, 형광 영상 ^(11)에 호환되는 여러 전처리 방법을 시험 하였다. 특히, E15.5 마우스 배아는 무서 / 전자 A2 ⁽¹²⁾ 또는 전신 ¹³ CUBIC 중 하나를...

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토론

여기서는 급격한 차원 시각화 및 복잡한 구조의 형태 학적 분석을 위해 호환되는 직렬 HREM 화상 취득 루틴 실험실 장비를 사용하여 변형 된 프로토콜을 제시한다. 고해상도 이미지 대신 개별 섹션의 블록 표면에서 직접 수행되기 때문에, 미세한 형태 적 특징은 유지하고 신속 차원 시각화 프로그램에서 디지털로 복원된다.

3D 영상을 시각화하고 복잡한 형태 적 특징을 이해하...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice	The Jackson Laboratory	C57BL6
Ethyl Alcohol	Pharmco-Aaper	111000200	200 Proof, Absolute, ACS/USP/Kosher Grade
Formalin	Sigma	HT501128-4L
Urea	Sigma	U5128	Clearing Solution
Glycerol	Fisher scientific	G33-4	Clearing Solution
Sodium Dodecyl Sulfate	Invitrogen	15525-017	Clearing Solution
Eosin Y Disodium Salt	Fisher scientific	BP241925	Infiltration Solution
Acridine Orange hemi (zinc chloride) salt	Sigma	A6014	Infiltration Solution
Whatman paper	GE	3030-153
JB-4 Embedding Kit - Solution A	Polysciences, Inc.	0226A-800	Infiltration Solution
JB-4 Embedding Kit - Solution B	Polysciences, Inc.	0226B-30	Embedding Solution
JB-4 Embedding Kit - Catalyst	Polysciences, Inc.	02618-12	Infiltration Solution
Embedding Molds	Polysciences, Inc.	23185-1	16 x 8 mm
Peel-A-Way Sharp Embedding Molds	Polysciences, Inc.	18986-1	22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm
JB-4 Plastic Block Holders	Polysciences, Inc.	15899
Disposable Graduated Transfer Pipes	VWR	414004-014
Petrl Dish	VWR	25384-088	Embryo dissection
Forceps Inox Tip	ROBOZ	RS-5015	Embryo dissection
Graefe Tissue Forcep	ROBOZ	RS-5153	Embryo dissection
Delicate Operating Scissor	ROBOZ	RS-6700	Embryo dissection
14 ml Polypropylene Round-Bottom Tubes	Falcon	352059
50 ml Polypropylene Conical Tubes	Falcon	352098
Ice Bucket	Magic Touch Iceware International Corp.	R19-343
100 ml (3.4 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats	VWR	89106-766
330 ml (11.2 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats	VWR	89106-770
Sodium Chloride	MP Biomedicals	102892	PBS Solution
Potassium Chloride	Sigma	P0662	PBS Solution
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5405	PBS Solution
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	S9390	PBS Solution
Digital Camera	Hamamatsu Photonics	C11440-10C
Microtome	Leica	RM2265
Illuminator	Carl Zeiss	HXP 200C
Fluorescence Stereo Zoom Microscope	Carl Zeiss	Axio Zoom.V16
Stereo Microscope	Olympus	SZX16
Fiber Optic Light Source	Leica	KL 1500 LCD
Disposable Microtome Blade	VWR	95057-832
Single Edge Dispenser	Personna	62-0330-0000
ZEN	Carl Zeiss	pro 2012
Photoshop	Adobe	CS6 v13.0
Amira 3D Software	Visage Imaging	5.4
Computer	Dell T7600, 2x900GB SAS hard drive and 64 GB DDR3 RDIMM memory
Rocking Platform Shakers	VWR	40000-304
Standard Hot Plate Stirrer	VWR	12365-382
Analytical Balance	Mettler Toledo	AB54-S