실험, Metagenomic, 및 계산 기법 밝히는 어떤 균 타협 꿀벌 건강 메커니즘

요약

범블 비 하이브 내 미생물 컨소시엄 풍부 하 고 꽃가루 꿀벌 애벌레에 대 한 유지. 살 균 제 잔류물 꽃가루 미생물, 및 궁극적으로 식민지로 이어지는 식민지 인구 통계를 변경 하는 가설을 테스트 하는 데 사용 하는 프로토콜을 설명 합니다이 원고 실험실 및 필드 기반 실험 다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 손실입니다.

초록

재배 자 종종 질병, 살 균 제 잔류물에 꿀벌 노출에 대 한 작물을 보호 하기 위해 꽃 동안 균 스프레이 사용 합니다. 비록 "비-안전한" 것으로 간주, 살 균 제 잔류물 꽃가루에 꿀벌 (꿀, 범블 비 종)에 대 한 감소와 관련 된 장착 증거가 있다. 메커니즘 상대적으로 알 수 없는 동안, 연구원은 비 미생물 공생 관련 된 추측 있다. 미생물 보존 또는 꽃가루는 꿀벌 애벌레에 대 한 영양 역할의 처리에서 중추적인 역할을 한다. 미생물 커뮤니티를 바꿔서 fungicides 이러한 미생물 중재 서비스를 중단 함으로써 꿀벌 건강을 손상 가능성이 높습니다. 이 원고는 간접 따라 장치를 마더보드에 있는 fungicides 식민지 감소 일으킬 수를 조사 하는 데 사용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 케이지 실험 균 치료 꽃에 꿀벌 노출 이미 fungicides 네이티브 범블 비 (Bombus 봉)에 깊은 식민지 손실 원인 첫 번째 증거 제공. 균의 필드 관련 된 복용량을 사용 하는 일련의 실험 균 노출 꽃가루의 미생물 지역 사회 역학의 미세한 설명 개발 되었습니다. 곰 팡이 및 세균 assemblages 꽃가루 미생물 내에서 구조 구성의 변화는 다음 세대 시퀀싱 및 metagenomic 분석 조사. 실험 본 개발 fungicides 꽃가루 규정의 미생물에 미치는 영향에 대 한 기계적 이해를 제공 하기 위해 설계 되었습니다. 궁극적으로, 이러한 결과 해야 통해 fungicides 식민지 하락 일으킬 수 간접 통로에 빛을 발산 하 고 있다.

서문

관리 하 고 야생 꿀벌 종 모두 자연 및 농업 시스템¹에 대 한 주요 영향으로 광범위 한 하락 발생 하는. 이 문제의 원인을 이해 하 공동된 노력에도 불구 하 고 꿀 꿀벌 감소를 촉진 하는 요인 없습니다 아직도 잘 이해^2,,34. 야생, 네이티브 꿀벌의 특정 종족에 대 한 상황이 긴박 한^5,6되고있다. 꿀벌 인구 산업 농업과 교차, 그들의 인구가을 계속 하 고 가루 (전세계 생산⁷의 35%)을 요구 하는 작물을 감당할 것 이다 때 지속 될 수 없는 수확을 감소.

살충제 노출, 질병, 그리고 서식 지 손실^1,4,8,,910 등 많은 잠재적인 요인 꿀 꿀벌 쇠퇴에 연루 되었습니다 동안 상대적으로 작은 네이티브 꿀벌 건강, 또는 농업 시스템 근처에 이러한 스트레스의 대화형 효과 대 한 알려져 있다. 많은 현재 연구 노력은 지난 연구는 균도 역할을 할 수 꿀벌 감소에 메모리 형성을 방해 하 여 나타냅니다 있지만 살충제, (예를 들어, neonicotinoids^11,,¹²)에 초점을 계속합니다 후 각 리셉션¹³, 둥지 인식¹⁴, 효소 활동 및 신진 대사 기능^15,,1617. 세계적으로, 균 꽃 중 꽃 작물에 적용 될 계속. 최근 연구는 꿀벌 일반적으로 살 균 제 잔류물 다시가지고 하이브¹⁸, 참으로, 연구 시험된 두 드러 기 포함 된 살 균 제 잔류물^19,20의 큰 비율을 문서화 했다. 추가 작업은 그 살 균 제 잔류물은 꿀 꿀벌 애벌레 사망률^21,,2223 의 높은 속도 식민지, 이내 "꽃가루 안치"의 존재와 관련 계시 했다는 비록 비-독성, 미생물 활동 없는 이며 영양 손상된²⁴입니다. 살 균 제 "비 안전"에 고려 오래는 사실에도 불구 하 고 지금 증거는 혼자 살 균 제에 노출 네이티브 범블 비 종, Bombus 봉²⁵심각한 식민지 손실을 발생할 수 있습니다.

살 균 제 노출 및 식민지 사이의 인과 관계를 설정 하려면 사망률, 이러한 화학 물질의 식 은 결정 될 필요가 있다. 균 류를 대상으로 토양²⁶, 퇴적 물²⁷, 및 수 중 환경²⁸, 입증, fungicides 가장 가능성이 변경 곰 팡이 풍부 하 고 꽃가루-규정, 주요 지역 사회를 호출 함으로써 다양성을 이동 강력 하 게 박테리아를 선호 하는 수 있습니다. 곰 팡이 경쟁 또는 길 항 근, 없이 특정 병원 성 박테리아 상대적으로 되지 않은, 꽃가루 규정의 부패를 촉진 확산 수 있습니다. 과거의 연구 보여주었다 미생물, 효 모 및 filamentous 곰 팡이, 특히 꿀벌^29,,3031영양 symbionts 역할 기생충 및 병원 균^{32 ,33}, 꽃가루 점포의 장기 보존을 제공. 살 균 제, 따라서 수 있습니다 직접 해 하지 미 숙 꿀벌 및 기회 주의 병원 체와 기생충¹²민감성을 증가 하 여 이러한 서비스를 제공 하는 데 필요한 미생물 지역 사회를 방해 하 여. 식량 생산에 대 한 요구 증가 함께 전세계 작물은 되 고 살포 매년 균 같은 균 유발 효과의 정도 이해 하는 필요를 강조 하는 꽃 중.

날짜, 생태 다음과 같은 질문으로 나타낼 수 있습니다 네이티브 벌 미생물에 관한 기본 지식 간격: 어느 정도 살 균 제 변경지 않습니다 꿀벌 꽃가루-규정 내에서 미생물 커뮤니티? 뿌리깊은 변경 된 미생물 지역 사회와 함께 꽃가루를 소모의 다운스트림 영향 입니까? 이러한 생태학적으로 밀접 한 질문에, 실험 1을 공개 하는의 기본 목표와 함께 개발 되었다) 그 살 균 제 잔류물 혼자 네이티브 꿀벌 종; 가혹한 식민지 감소를 일으킬 수 있습니다 2) 꽃가루 조항에 미생물 지역 사회 살 균 제, 및 3 변경 되는 있는 정도) 어떻게 꿀벌 건강 심각 하 게 변경 된 미생물 지역 사회에 의해 영향을 받습니다. 실험 목표는 실험실 및 필드 기반 실험의 조합을 사용 하 여 위의 질문을 해결 하기 위해 정의 되었다. 의 상태--예술 metagenomic 및 현장 관찰의 전통적인 방법과 함께 분자 기술을 사용 하 여,이 연구는 꿀벌 건강에 균의 잠재적인 영향을 목표로 한다.

이 연구의 첫 번째 목적은 혼자 살 균 제 노출 네이티브 꿀벌 종 가운데 중요 한 식민지 손실을 발생할 수 있습니다 설명 하는 것입니다. 큰 필드 연습장을 포함 한 연구 Bombus 봉, (그림 1, 그림 2, 그림 3) 미국에서 유비 쿼터 스, 풍부한 네이티브 꿀벌의 식민지 성장에 살 균 제 노출의 효과 조사 하기 위해 사용 되었다. 그것은 낮은 체력과 비정형 인구 비 노출 두 드러 기에 비해 균 치료 하이브 제시는 가설 했다. 이 실험에서 얻은 데이터 꽃가루 내에서 살 균 제 잔류물 네이티브 범블 비 종²⁵에 깊은 식민지 손실의 유일한 원인이 될 수 있습니다을 보여주는이 가설을 지원. 이 연구의 두 번째 목적은 꽃가루 미생물 살 균 제 노출에 대 한 응답을 조사 하는 것입니다. 균에 노출 되어 꽃가루 규정 내에서 미생물의 커뮤니티 구성 치료 꽃가루의 다른 것을 가정 했다. 곰 팡이 풍요로 움과 다양성은 크게 하락 예상, 박테리아 및/또는 하나의 지배적인 균 종 다른 경쟁 곰 팡이의 부재에서 선택 하지 않은 성장할 가능성이 것입니다. Vivo에서 시험의 시리즈를 통해 미생물 지역 사회 구성에 이러한 교대 metagenomics를 사용 하 여 분석 됩니다.

프로토콜

1. 윙윙 거리 다 꿀벌 식민지 성공을 사용 하 여 필드 케이지 실험에서 살 균 제 노출의 효과 검사

필드에서

1. 세트 10 최대 메쉬 케이지 귀리 심어 져. 각 케이지 주위에 참호를 파고 하 고 꿀벌도 주 할 수 있도록 지상으로 메쉬 케이지의 모든 4 개의 가장자리를 파고. 재고, 꽃 화분 (예: 메 밀, borage, 냉이, 코스모스와 해바라기) 꿀벌을 매력적인 것으로 알려진와 케이지 ( 그림 2).
2. 보충에 꽃 클로버의 단일 트레이 (36 cm x 42 cm)와 감 금 소. 감 금 소, 귀리에 의해 약 2.5 m x 1 m. 단조로운 나머지 케이지 영역 공간을 점령의 한 구석에 꽃 리소스 클러스터.
3. 무작위로 할당 범블 비 식민지, 각 포함 된 노동자와 단일 여왕, 치료 (균 현재/결 석, N = 치료 당 5 식민지, 총 10 식민지), 필드 케이지 내에서 그들을 장소 (N = 1/케이지) 29 일 (6 월 23 일 -2014 년 7 월 21 일).
4. 동양 식민지 상자는 식민지 ' 남쪽 꿀벌 최적의 탐색 조건 제공으로 가리키도록 s 구멍. 설탕 물 방광, 과즙 가용성을 보완 하기 위해 하이브 상자 내부에 배치와 함께 식민지 보조금.
5. 적용 균 chlorothalonil 기반 5 균 치료 장에 꽃 식물 분야 관련 수준 (20 g/L), 연구 (0, 13 일) 기간 동안 두 번 농약 분무기를 개최 손을 사용 하 여. 아니 더 액체 꽃 표면 ( 그림 3)에 고착 되도록 균일 하 게 꽃을 코트.
6. 필드 케이지 연구의 결론에는 연습장에서 B. 봉 식민지를 손으로 제거, 20 분-20 ° C 냉장고에 배치 하 여 두 드러 기를 냉각
7. 소독 집게를 사용 하 여 꿀벌을 제거 하 고 애벌레, 번데기, 성인 여성 수를 기록 (나. e. 채집), 그리고 성인 남성. 어머니 여왕, 애벌레, pupae, 성인 여성 (즉 채집), 그리고 성인 남성의 건조 중량을 기록 분석 균형을 사용 하 여.

2. 엉망으로 꿀벌 둥지를 사용 하 여 실험실 기반 Vivo에서 시험의 꽃가루 규정에 미생물 지역 사회에 살 균 제 노출의 효과 검사

1. Pulverize 상업적으로 구입한 꽃가루는 표준을 사용 하 여 정밀한 분말에 실험실 볼-밀입니다. UV 빛 아래에서 하룻밤 증발을 70% 에탄올에 몸을 담글 하 여 가루 꽃가루를 소독. ~0.5 mg 범용 한 천 매체에 도금 하 여 꽃가루의 무 균을 확인 합니다.
   1. 건조, 소독된 꽃가루, 소독된 펫을 사용 하 여 추가 균의 필드 관련 된 복용량: 14.3%;에서 propiconazole 치료에 대 한 22.9%에서 azoxystrobin (0.74 µ L 및 0.65 µ L 각각 / 일 / 하이브). 잘 소독된 나무 막대기를 사용 하 여 혼합.
2. 장소 6 실험 하이브 (n = 3 각 제어 및 치료에 대 한) 깨끗 하 고 위생 실험실 벤치탑 실내 온도에 유지에서. 매일 무게 꽃가루 ^{34 , 35} (치료)에 대 한 살 균 제 또는 표준 무 균 기술을 사용 하 여 후드 안쪽 (컨트롤)에 대 한 살 균 물과 혼합의 4.27 g.
   1. 트랩 문 바깥쪽 두 드러 기, 골 판지 상자의 측에 의해 제공를 사용 하 여 두 드러 기 안에 꽃가루 소개. 매주 소독된 설탕 솔루션으로 두 드러 기를 보충 한다. 4 주 동안 정권 먹이 계속.
3. 20 분 긁어 소독된 집게 주걱을 사용 하 여 브루 드 챔버 내에 포함 된 꽃가루 규정 밖으로-20 ° C 냉장고에 놓고 멸 균 저장 관에서 두 드러 기 연구소 기반 연구의 결론에 냉각. 스토어-80 ° C. 수 및 기록 노동자와 시작 및 실험 (단계 1.7)의 끝에 여왕 어머니의 무게.
4. 상용 DNA 격리를 사용 하 여 꽃가루 제공 샘플에서 DNA 분리 키트 (자세한 자료 표 참조).
   1. 조항의 꽃가루-추출 0.25 g 튜브, 짧게 소용돌이를 섞어 추가.
   2. 는 Lysozyme 솔루션 50 µ L/샘플에 대 한 충분 한 이온을 제거 된 증류수에 200 mg/mL 확인합니다. 완전히 양식 솔루션을 적극적으로 악수.
   3. , 샘플 추출 관을 lysozyme 솔루션의 50 µ L을 추가 하 고 여러 번을 반전 하 여 잘 혼합. 물 욕조에 37 ° C에서 10 분 동안 튜브를 품 어. 침전을 형성 하는 경우 열 솔루션을 사용 하기 전에 해산 될 때까지 60 ° C.
   4. 추출 관에 수성 세포 솔루션의 추가 70 µ L 테이프, 평판 소용돌이 패드에 가로로 보안 및 30에 대 한 10000 x g에서 10 분 원심 분리기에 대 한 소용돌이 관 실 온에서 s.
   5. 깨끗 한 2 mL 컬렉션 튜브는 상쾌한 전송. 250 µ L 단백질 강 수 솔루션, 그리고 소용돌이의 얼음 욕조에 5 분 동안 4 ° C에서 5 미 품 추가.
      참고: 상쾌한의 500 µ L 400 µ L 사이 기대 합니다. 상쾌한 여전히 몇 가지 입자를 포함할 수 있습니다.
   6. 10000 x g에서 1 분 동안 실내 온도에 튜브 원심 하 고 깨끗 한 2 mL 컬렉션 튜브에 상쾌한의 최대 600 µ L를 전송. 수성 억제제 제거 솔루션, 짧게, 소용돌이의 200 µ L을 추가 하 고 5 분 원심 분리기 10000 x g.에 1 분 동안 실내 온도에 튜브는 깨끗 한 2 mL 컬렉션 튜브로 상쾌한의 750 µ L까지 전송 4 ° C에서 품 어.
   7. 상쾌한, 그리고 5와 동을 수성 바인딩 솔루션의 추가 1200 µ L s. 스핀 필터, 실내 온도에 1 분 동안 10000 x g에서 원심 분리기에 상쾌한의 약 675 µ L 로드. 삭제를 통해 흐름.
   8. 반복 2.4.7. 두 번.
      참고: 각 샘플 처리에 대 한 3 중의 총은 필요.
   9. 추가 500 µ L 에탄올, 및 30에 대 한 상 온에서 원심 분리기 10000 x g.에서 s, 흐름을 무시 하 고 g. 장소 스핀 필터 청소 2 mL 컬렉션 튜브에서 x 10, 000에서 1 분 동안 실내 온도에 다시 원심.
   10. 차입의 추가 100 µ L 버퍼 필터 멤브레인의 중심입니다. 30에 대 한 상 온에서 원심 분리기 s 10000 x g. 스핀 필터 삭제. 스토어-20 ° C-80 ° C 사이의 DNA 수집
5. 사용 절연 DNA 시퀀싱.
6. 계량,
   그리고 fluorometric 분석에 의해 고립 된 DNA 2 ng / µ L를 정상화. 각 추출 샘플 28S의 상대적 양을 비교 3 중에
   1. 준비 반응 (공장), 그 (곰 팡이), 분석 및 각 화분 제공 샘플 ³⁶의 16S (세균성) 구성 요소. 10 각 반응에 포함 되어 있는지 확인 전체 DNA, 비대칭 cyanine 염료 기반 마스터, 믹스의 2 배 및 2.5 µ L 각 정방향 및 역방향 뇌관 쌍 28KJ/28B ³⁷ 식물 및 균 dna ITS1/ITS5.8R ng ³⁸ .
   1. 다음 매개 변수를 사용 하 여 증폭 DNA: 50 ℃, 95 ℃에서 2 분 초기 변성에서 2 분 전 변성의 40 주기 (15 98 ° C, 15에서 s s 58 ° C, 60에서 72 ° C에), 용융 곡선 뒤.
   2. 준비 16S rRNA를 대상으로 차세대 시퀀싱 라이브러리를 사용 하 여 2 단계, 중첩 된 PCR 프로토콜 v 3/V4 변수 지역 및 ITS / 5.8s rRNA 공백 지역.
      1. 5 DNA의 추가 12.5 µ L pmol 각 뇌관 및 마스터 믹스 x 2의. 각 지역 (16S 또는 ITS; 표 1 참조)에 대 한 별도 반응을 확인 합니다. 시퀀서 특정 어댑터 오버행 뉴클레오티드 순서 유전자 특정 시퀀스에 추가 하려면 앞에서 설명한 ^{39 , 40} 지역 특정 뇌관 수정.
      2. 다음 매개 변수를 사용 하 여 초기 증폭을 수행: 95 ° C에서 3 분 초기 변성, 25의 주기 (30 s 95 ° C, 30에서 55 ° C, 30에서 s s 72 ° C에서), 72에서 5 분 최종 확장 ° c.
      3. 다음 초기 증폭, 전기 이동 기동성에 의해 라이브러리 크기 및 수량을 확인 하 고 볼륨 단단한 단계의 가역 imm x 1를 사용 하 여 청소obilization 구슬 잔여 뇌관 및 반응 시 약을 제거. 수영장 16 및 양적 각 샘플에 대 한 단일 amplicon 풀을 만들려고 그 amplicons.
      4. 는 시퀀서 특정 어댑터를 추가 하 고 다음 뇌관 (표 1 참조)를 사용 하 여 특정 듀얼 인덱스 샘플. 각 뇌관 및 마스터 믹스 x 2의 5 pmol에 증폭 된 DNA의 2.5 µ L를 추가 합니다. 다음 매개 변수를 사용 하 여 라이브러리 증폭을 수행: 95 ° C에서 3 분 초기 변성, 8의 사이클 (30 s 95 ° C, 30에서 55 ° C, 30에서 s s 72 ° C에), 72에서 5 분 최종 확장 ° c.
   3. 다음 PCR, 단단한 단계의 가역 immobilization 구슬의 1 x 볼륨을 사용 하 여 깨끗 한 완성 된 라이브러리. 전기 이동 기동성, 그리고 fluorometry, 각각 사용 하 여 완성 된 라이브러리의 양과 품질을 평가 합니다. 2 µ M 및 시퀀싱 전에 풀 라이브러리 표준화.
   4. 전체 amplicon ⁴¹을 충당 하기 위해 적절 한 길이와 2 차 PCR에 추가 어댑터를 유사 플랫폼에서 다음-세대 시퀀싱을 수행.
7. 주석 및 미생물 구성 분석 시퀀스.
8. 모든 시퀀스 된 라이브러리에 대 한 단일 contigs 결합 쌍-엔드 시퀀싱 데이터 (R1 및 R2)
   . R1 및 r 2 파일을 병합, 후 각 라이브러리에 대 한 단일 fasta 파일 생성.
   참고:이 단계 고 (하지 않는 한 달리 명시) 아래에 설명 된 프로세스에서에서 수행 Mothur 버전 1.38.0 ³⁸.
   1. 모호한 기지, 예기치 않은 긴 시퀀스, 그리고 긴 homopolymers를 제거 하려면 각 fasta 파일 화면.
      참고: 심사, 그리고 시퀀스 제거에 대 한 매개 변수는 maxambig = 0, maxlength = 600, 및 maxhomop = 8 두 유전자에 대 한. 동일한 시퀀스를 제거 하지만 모든 라이브러리 (일명 수 표에 Mothur)에 대해 별도로 contingence 테이블.
   2. 123, 실바 데이터베이스 버전에 대 한 유전자 16S 도서관과 ⁴² 단결의 데이터베이스 대 한 유전자는 라이브러리의 고유한 시퀀스 정렬.
      참고: 시퀀스 수 주석 첨부 합니다 왕국 수준에서 속 수준.
      1. 클러스터 시퀀스를 정렬 하는 그 후, 비교를 사용 하 여 함수 pre.cluster = 5, 그리고 키메라 제거.
   3. 왕 ⁴³ (16 진)에 대 한 실바와 단결의 (유전자 ITS)에 대 한 분류 파일 (컷오프 값의 80%)에 따라 메서드를 사용 하 여 시퀀스를 분류.
   4. 로드 R ⁴⁴ Mothur에 분류 과정에서 생성 된 contingence 테이블 (유전자 하나씩). 미생물 커뮤니티 변경의 추가 분석을 위한 라이브러리 당 관계 되는 풍부를 얻을 각 분류학 수준.
      참고: 각 분류학 수준에서 병합 함께 분류학 그룹 관계 되는 풍부는 모든 실험 반복에 대 한 2% 미만 때.

결과

필드 케이지 연구:

케이지 실험에서 얻은 데이터 범블 꿀벌 식민지 살 균 제 노출에 대 한 중요 한 응답 했다는 것을 보여주었다. 균 치료 두 드러 기 생산 제어 두 드러 기 보다 훨씬 적은 수의 노동자 (12.2 ± 3.8, 평균 ± SE) (43.2 ± 11.2, F_{1, 9}= 6.8, p = 0.03) (그림 4). 또한, 균 치료 하이?...

토론

꿀벌 건강에 균의 효과에 대 한 조사는 해충 관리 전략의 understudied 측면 남아 있다. 우리의 연구 명시적으로 꿀벌 감소 운전 잠재적인 요소를 분리 하는 보완 기술의 제품군을 사용 하 여이 지식 격차를 해소 하는 것을 목표로. 계획, 근거, 그리고이 실험의 렌더링 아래 자세히 나와 있습니다.

없는 꿀벌이 인구 통계학 분석을 손상 할 것입니다 이후 케이지 실험의 메쉬를 탈출 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Natupol Beehive	Koppert	USRESM1	16 hives
Propiconazole 14.3	Quali-Ppro	60207-90-1	Propiconazole 14.3%
Abound	Syngenta	4033540	Azoxystrobin 22.9%
Chlorothalonil	Syngenta	3452	Fungicide used for trials
Pollen granules	Bee rescued	B004D5650C	3X 16oz bottles, pollen for trials
Bacterial strains for inoculation	Currie Lab
Yeast strains for inoculation	Hittinger lab
Primer pairs	UW Biotech Center
DNA Isolation Kit	Mo Bio	12830-50	Commercial DNA isolation kit
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher	Q32851	DNA quantification tool
Select Master Mix for CFX	Thermo Fisher	4472952	Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye.
Real-Time PCR Detection System	Bio Rad	1855196	Instrument used for PCR amplification
PCR Clean-Up Kit,	Axygen	10159-696	Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes
DNA 1000 Kit	Agilent	5067-1504	Used for sizing and analysis of DNA fragments
MiSeq Sequencer	Illumina		Used for next-generation sequencing
Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters)	VWR