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요약

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

초록

적응뿐만 아니라 내피 표현형과 유전자 발현의 병리학 적 변화를 유도하여 정상 수준 및 혈관 생리학 및 병태 생리에 혈관 유체 전단 중요한 역할을 패턴에서 편차. 특히주기적인 단방향 흐름 유도 된 전단 응력의 영향은 여러 부적응 혈관 세포 형태, 특히 혈관 내피 세포에 대한 다양한 효과를 트리거 할 수있다. 지금까지 다양한 해부학 적 기원에서 내피 세포 배양되었지만, 깊이있는 유체 전단에 자신의 응답이 전단 모델의 상대적 복잡성에 의해 방해 한 분석 (예를 들어, 평행 판 유량 용기, 콘 플레이트 흐름 모델). 이러한 모든 훌륭한 접근 방식을 나타내는 반면, 이러한 모델은 봇에 도전을 작성, 기술적으로 복잡하고 상대적으로 길고 복잡한 설정 시간, 낮은 표면 영역, 자주 밀봉 가스켓을 필요로하는 펌프 및 가압에 대한 요구 사항을 포함하여 결점불임 여러 실험을 실행하기 위해 무능력의 시간 유지. 흐름과 전단의 높은 처리량 모델은 혈관 내피 전단 반응에 큰 진전 사용할 수 있었던 경우에는, 분자 수준에서 특히주기적인 전단 연구는보다 신속하게 고급 수 있습니다. 쉽게에 단방향,주기적인 전단 응력 연구에서 실험 복제의 높은 숫자를 허용하는 비교적 큰 표면적 소설, 간단한 - 투 조립, 저렴한 조직 문화 모델 : 여기, 우리는 건설 및 사용 전단 링을 설명 내피 세포.

서문

시스 - 조절 요소 (6)의 기동, 히스톤 아세틸 트랜스퍼 라제 활성 (7) 및 전단 응력에 응답 요소 (SSRE) 5-8 - 유체 전단 응력은 내피 유전자 프로그램 1을 조절하는 것으로 나타났다. 조직 인자 (9) 및 조직 플라스 미노 겐 활성제 (TPA) (10) 식을 변조함으로써 응력의 영향을 응고 향해 내피 기여 전단. 전단 응력은 PDGF-B의 합성 및 응답 (8)을 조절함으로써 혈관 신생 (11)와 선박 개조의 제어에 영향을 미친다. 내피는 엔도 텔린-1, 유로 텐신 II 및 relaxin도 전단 (12)에 의해 혈관 활성 매개체의 adrenomedullin 규제 유도. 내피 산화 질소 합성 효소의 생산 및 산화 질소 생산의 전사는 모두 전단 의존 10이다. 전단은 내피 세포의 ICAM-1의 발현 (13)를 제어한다. 따라서 powerfu 수 있습니다 흐름에 의한 전단 응력에서야 베드로 내피 응답의 큰 다양성에 영향을 미친다. 중요한 혈관 맥동 이제도 14 혈관성 치매 모두 정상 혈관 노화 형태의 병태 생리에서 중요한 역할을하는 나타나고 심지어 다발성 경화증 (15)와 같은 다른 신경 퇴행성 질환에 기여할 수있다.

동맥 및 정맥 내피 세포를 본질적으로 생체 내에서 다양한 혈류 흐름 패턴에 노출되며, 많은 다른 내피 세포 표현형 16을 발휘할 수있다. 크기 및 흐름의 주기성에 따라 내피 세포에 미치는 영향은 유전자 또는 단백질 발현 (17, 18)의 변화를 반영 할 수있다 염증성 세포의 활성화 및 아폽토시스를 포함 할 수있다. 내피 세포 반응에 대한 연구는 충분히 이러한 전단 패턴을 생성 체외 모델에서 생산 때문에 어려움에 의해 복잡하게 남아 현상을 전단합니다.

많은 다른 experimental 프로토콜 세포 단층 내피 유체 전단 응력을 적용하기 위해 개발되었다. (21) - 가장 일반적으로 사용되는 시스템들 중 하나는 상기 챔버 (19) 내에서 균일 한 층류를 생성하는 평행 평판 유동 챔버이다. 연동 펌프는 대개 일반적으로 생체 내의 많은 위치 22에서 발견되는 유동 특성 요점을 되풀이 할 수 주기적 유동을 생성하도록 접속된다. 또 다른 일반적인 셋업 유체의 전단 스트레스 콘 (23)의 회전 속도에 의해 결정되는 '콘 플레이트'모델을 사용한다. 그들과 비슷한 두 시스템 및 기타 배열은, 설정 많은 실험실에 상대적으로 비싸고 액세스 할 수 있습니다 구성 요소를 요구하는 지루한 될 수 있습니다.

이러한 전류 모델의 다른 중요한 제한은 동시에 상대적으로 낮은 표면적, 각각 행할 수 복제 연구의 상대적으로 낮은 수있다. 이것은 시간 및 공동 증가 이러한 접근 방식의 mplexity. 따라서, 단방향 및주기적인 전단을 유도하는 이상적인 모델은 상대적으로 큰 표면적 연구 복제의 높은 숫자를 쉽게 설정할 수 있습니다 하나, 각각 수 있습니다. 또한, 상기 모델은 많은 사용자를 위해 엄청난 비용이 될 수있는 상당히 복잡한 설치가 필요합니다. 기본적인 실험 재료를 사용하여 유체 전단 교란을 제조 할 수있는 모델은 여러 가지 이점을 가질 수 있습니다.

단방향 주기적 전단 응력을인가하는 간단하고 매우 경제적 인 방법은 진탕 기 (24)에 원형 접시의 배치를 포함한다. 이 프로토콜은 매우 간단하며, 필요에 따라 복제 연구의 높은 수치는 비교적 큰 표면적을 각각 달성하기 위해 확장 될 수있다. 그러나, 접시의 중심에 위치한 셀은 동일한 혼합 접시에 세포 표현형 반응을 수득 주연을 따라 셀과 다른 흐름 패턴에 노출된다.

_content ">이 현재 보고서에서 우리는 '전단 링', 단방향 및주기적인 전단 응력을 만들기위한 우리의 모델의 구성 및 사용에 대해 설명합니다. 디자인을 전단 반지를 효과적으로 제한 '혼합'휴대 전단에 의한 표현형을 흐름을 제한하여 내륜의 배치를 통해 주위에 순환 배양 접시 내의 통로. 전단 링의 구성 및 동작이 간단하고 경제적이며 쉽게 널리 사용할 조직 배양 공급하여 오비탈 쉐이커 광범위한 수용하도록 확장 할 수있다. 이러한 모델 병태 생리적 수준에서 단방향주기적인 유동 패턴을 제공하기 위해 내피 세포 실험에 적용 할 수있다.

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프로토콜

150mm 직경 전단 반지의 1. 건설 (그림 1)

주 : 전단 링은 외측 페트리 접시 크기를 변화 상이한 총 표면적 세포 수율 장치에서 생성 및 전단력의 범위를 개발하여 다양한 크기를 생성하도록 구성 될 수있다. 이 보고서는 98cm 2 (그림 2)의 전체 면적에 대한 내부 100mm 접시와 결합 된 150mm 요리에 대해 설명합니다.

figure-protocol-332
도 1 전단 링 조립체. 도면의 상부에는 부분적으로 조립 된 전단 고리를 나타낸다. 단단한 시일이 완전 내외 식기 사이에 형성되지 않은 경우 전송 피펫과 3mm의 구멍을 염화 메틸렌 0.5 ml에 주입한다. 전단 고리 내측 주위 EDG 실리콘 고무 접착제의 두께 1㎜ 비드를 적용하여 정지 밀봉전단 링 상단의 전자. 도면의 하단 부분은 조립 전단 고리를 나타낸다. 청색 도금 내피 세포의 영역을 나타낸다. 외부 및 내부 빨간색 화살표가 궤도 쉐이커에 배치 된 전단 링 내부의 전단 링과 미디어의 궤도 운동을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-protocol-897
(안 비율로 도시)는 150mm 전단 링 그림 2. 표면 측정. 최고 패널이 궤도 회전에 응답하여 외부 링으로 유체의 원심 이동을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 를 생성하여 전단 링 건설 템플릿 만들기150 밀리 원의 중심에 배치 된 100mm 내경 프레젠테이션 소프트웨어 150mm 외연 단면도. A4 흰색 용지에 템플릿을 인쇄합니다.
  2. 피펫 150 밀리 유리 페트리 접시에 염화 메틸렌 (디클로로 메탄)의 10 ㎖. 염화 메틸렌 대부분 플라스틱 가용화 및 플라스틱 부품 가입 여기서 사용 된 바와 같이 접시 유리하지 폴리스티렌 (또는 다른 비닐 수지) 인 것이 중요하다.
    주의 : 적절한 후드 환기 모든 건설 용 장갑을 사용하십시오. 메틸렌 클로라이드를 접촉 자극이며 간독성이다.
  3. 외부 전단 링 템플릿 상에 150mm 플라스틱 페트리 접시를 맞 춥니 다.
  4. 회전 공구를 사용하여 100mm 접시의 중심에서 3mm의 구멍을 뚫는다. 시추에서 생산되는 모든 플라스틱 부스러기를 제거합니다.
  5. 장갑을 낀 손으로 잡고 있지만, 반전 약 3 초 동안 메틸렌 클로라이드 풀에 이전 단계에서 100mm 페트리 접시의 위쪽 가장자리를 찍어.
  6. 트랜스선봉은 신중하게 표시된 템플릿 상에 100mm 접시를 정렬하는 150mm 접시의 중심 상에 100mm 접시 가장자리 다운 "젖은". 메틸렌 클로라이드는 100mm와 150mm 요리 접합 플라스틱 융합된다. 조심스럽게 100mm 접시를 시계 방향으로 회전하고 몇 번 반 시계 방향으로 150 밀리미터 접시에 우수한 접착 성을 보장하기 위해.
    참고 : 외부 접시의 중심에 내부 접시의 적절한 정렬을 보장하기 위해 상당한주의를 기울입니다. 편심 정렬은 전단 링에서 서로 다른 위치에서 전단 응력의 변화가 발생할 수 있습니다. 염화 메틸렌 실수로 100mm 접시의 위치 동안 150mm 페트리 접시의 바깥 쪽 트랙 부분에 물방울을 허용하지주의하십시오. 이는 유동 교란을 일으킬 수있는 표면에 요철을 만들어 세포가 성장되는 바닥면에 플라스틱을 용융한다.
  7. 염화 메틸렌 건조되면, 이상 새로 결합 된 배양 접시를 뒤집어 신중을 보장하기 위하여 접촉 포인트를 검사꽉 도장은이 배양 접시 사이에 형성되고있다.
  8. 단단한 시일이 완전히 형성되지 않으면, 전송 피펫과 3mm의 구멍을 염화 메틸렌 0.5 ml에 주입. 접시를 들고 부드럽게는 염화 메틸렌 가장자리에 도달 할 수 있도록 회전합니다.
    주 : 너무 빨리 회전하면, 염화 메틸렌 세포가 성장할 표면 변형과 전단 파괴 링은 150mm 접시의 외측 부분으로 유출 할 수있다. 누출 전단 링은 폐기해야합니다.
  9. 실리콘 고무 시일의 3mm의 비드를 적용하여 100mm 접시 구멍을 봉쇄.
  10. 평평한 절삭 헤드가 장착 된 회전 공구를 사용하여, 캡 아래 튜브의 적어도 1cm 떠나는 15 ml의 폴리스티렌 원뿔형 조직 배양 튜브의 상부 3cm 부를 잘라. 밋밋은 절삭 헤드의 평탄면을 사용까지 절단 튜브의 에지 연마. 연마에 의해 생성 된 모든 플라스틱 부스러기를 제거합니다.
  11. 상에 차단 15 ml의에게 원뿔 튜브를 추적약 0.5 cm 떨어진 접시 가장자리로부터 마커와 150mm 접시 뚜껑. 약 원의 가장자리 1~2mm을 여백을 남겨 그려진 원 안에 구멍을 드릴.
  12. 드릴 구멍을 통해 차단 원뿔 튜브 탑을 배치합니다. 전달 피펫을 사용하여, 150mm의 뚜껑 원뿔형 튜브에 결합하는 원뿔형 튜브의 절단 모서리에 염화 메틸렌 250 μL를 적용한다.
  13. 상단 페트리 접시의 내주 주위에 실리콘 고무 밀봉 제의 1 mm 두께의 비드를 적용하여 150mm 접시 상 150mm 뚜껑을 밀봉.

전단 반지의 2. 살균

  1. 피펫 인산 약 10 ㎖를 15 ㎖의 원뿔형 튜브 포트를 통해 새로 형성된 전단 링에 완충 식염수. 전단 링 내부의 이물질을 제거하기 위해 주위에 소용돌이 친다. 파스퇴르 피펫 / 진공 흡입기와 인산염 완충 생리 식염수를 제거합니다.
  2. 이물질이 제거 될 때까지 이전 단계를 반복합니다.
  3. steri하려면리제 전단 링, UV 조사와 70 % 에탄올 세정을 조합하여 사용한다.
    1. 액세스 포트를 통해 배출 캡, 피펫 70 % 에탄올의 약 10 ml의 나사를 풀고, 그리고 다시 뚜껑을 조입니다. 회전 전단 링의 내부를 철저히 세척 보장, 전단 링을 여러 번 뒤집어.
    2. 흄 후드에서 초과 70 % 에탄올을 대기음. 스프레이 병으로, 철저하게 70 % 에탄올로 모자와 액세스 포트를 스프레이.
    3. 완전히 건조 될 때까지 조직 문화 후드 내에서 자외선 아래에서 전단 링과 캡을 놓습니다.
  4. 세포 배양 도금에 사용되는 때까지 건조한 후, 실온에서 다시 모자 및 저장 멸균 전단 링을 조입니다.

3. 전단 응력 연구

  1. 형질 내피 세포주 4 분할 비 : 통상적으로 (1)를 이용한 표준 세포 배양 프로토콜 다음 멸균 전단 링 내피 세포 접시.
    참고 : 쥐 망막 microvascular 내피 세포 상업적으로 수득 하였다. 인간의 두뇌 내피 세포 (hCMEC / D3) 세포는 박사 피에르 - 올리버 Couraud (INSERM, 프랑스)에서 관대 한 선물로 제공하고 완전한 내피 기초 매체 (EBM)에서 배양 하였다.
  2. 문화가 이전의 흐름 연구의 시작에 합류에 도달 할 수 있습니다. 조직 배양 배지 30 ㎖ (10 % 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 / 암포 테리 가진 둘 베코 변형 이글 배지)를 사용한다. 3 일마다 세포 배양 배지를 바꾸고 7.5 % CO 2 및 92.5 %의 실내 공기와 37 ℃에서 세포를 유지한다.
  3. 인큐베이터에서 궤도 통을 놓습니다.
    참고 : 궤도 셰이커는 일반적으로 무거운 (> 10kg). 선반 응력과 진동을 최소화하기 위해 인큐베이터의 바닥 선반에 궤도 통을 놓습니다.
  4. 궤도 통에 실험 전단 반지를 놓습니다. 같은 인큐베이터 안에 정적 대조군 전단 반지를 놓습니다.
  5. 쉬 내에서 최대 전단 응력을 추정방정식과 귀 반지 figure-protocol-4331 어디에 figure-protocol-4398 진탕 기의 회전 반경 (cm 단위)이며 figure-protocol-4483 매체의 점도 (포이즈 단위)이며 figure-protocol-4564 (g / ㎖)에서, 매체의 밀도, figure-protocol-4646 (24) (회전 / 초)에서의 회전 주파수이다.
  6. 전단 응력 응용 프로그램 (예를 들어, 72 시간)의 원하는 기간 동안 통에 전단 링을 떠나, 원하는 회전 수 (예를 들어, 90 RPM)에 궤도 통에 회전 설정을 시작합니다.
    참고 : 인큐베이터 온도가 37 ° C는 실험 기간 내내 유지하기 위해 초기에 모니터링해야하므로 궤도 셰이커가, 열을 생성 할 수 있습니다. 또한,이야듣고 반지는 회전 인큐베이터 내에 배치 후 환경 챔버 (예를 들어, 모듈 형 인큐베이터 실) 및로 전송할 수 있습니다.
  7. 셀 층을 원하는 시간에 대한 전단 인큐베이터에서 전단 링을 제거에 노출 된 후. 전단 링 뚜껑을 당겨 원하는 엔드 포인트 분석 (예를 들어, 웨스턴 블로 팅, 형광 활성 세포 정렬 등) (25) 검사에 대한 세포 및 / 또는 미디어를 검색 할 수 있습니다.

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결과

여기에서 우리는 전단 링에서 배양 hCMEC / D3 뇌 내피 세포와 쥐의 망막 미세 혈관 내피 세포 단일 층 모두에서 대표적인 결과를 제시한다.

hCMEC / D3 뇌 내피 세포 단층이 완전한 EBM에 합류하도록 성장시킨 후, 전단 링 72 시간 동안 진탕 기 상에 두었다. 단계 3.5에서의 방정식을 사용하여, 최대 전단 응력을 계산

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토론

전단 내피 세포를 노출 전단 고리 시스템의 구성은 전단 응력의 연구를 수행하는 간단한 방법이다. 그럼에도 불구하고, 우수한 전단 반지와 더 나은 결과를 얻기위한 중요한 몇 가지 단계가 있습니다. 완전 밀봉 된 샘플간에 일치 전단 응력을 생성 할 수있는 미디어 누출을 방지하기 위해 내부 및 외륜 사이에 만들어 져야한다. 완벽한 밀봉이 수행되지 않은 경우, 메틸렌 클로라이드의 최소량은 ?...

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공개

J. 위니 윤은 아네트 Funicello 재단에서 연구비가 있습니다. J. 스티븐 알렉산더는 신경과, LSUHSC-S의 부서에서 연구 지원을하고 있습니다.

감사의 말

저자는 크리스토퍼 씨 응우 엔, 아론 헌터와 슈 리브 포트의 Jumpstart, SMART 및 Biostart 교육 프로그램의 지원뿐만 아니라, 생물 물리학, 슈 리브 포트, LA의 100 주년 대학 루이지애나의 부서를 인정하고 싶습니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
100 x 20 mm plastic tissue culture dishCorning430167The dishes must be polystyrene
150 x 25 mm plastic tissue culture dishCorning430599The dishes must be polystyrene
150 mm glass Petri dishFisher3160150BO
15 ml polystyrene tissue culture plastic tubesFalcon352099
Methylene chlorideSigma-AldrichD65100
silicone rubber sealantDAP7079808641
ethanolDecon2701
3 ml transfer pipetteBecton-Dickinson357524
printer paper
scissors
gloves
rotary tool and setDremel4000-6/50
rotary tool cutting headDremelEZ476
rotary tool drill head
distilled water
orbital shakerVWR57018-754
incubator
Rat retinal microvascular endothelial cellsCell BiologicsRA-6065

참고문헌

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