마우스 골수에서 형질 수지상 세포의 정화를위한 형광 활성화 셀 정렬

요약

우리는 PDC의 기능 연구를위한 루푸스 발생하기 쉬운 마우스의 골수로부터 고순도 형질 수지상 세포 (PDC)를 분리 정렬 형광 활성화 된 세포를 사용하여 프로토콜을보고합니다.

초록

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

서문

Efficient separation of a cell population of choice from other cells enables studies of the population that may not be possible otherwise. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a method to enrich an interesting cell population with high purity. ^1,2 Different cell types usually express unique molecules, or a unique combination of several molecules, on the plasma membrane that can distinguish one cell population from another. Upon binding of these cell surface molecules by specific fluorescence-conjugated antibodies, a detecting machine called flow cytometer/sorter is able to excite and detect the light signals of different fluorescent dyes that represent different molecule markers on the cells at the single cell level. The combined information consisting of either the presence of a light signal (representing positive expression of the corresponding surface molecule) or the absence of a light signal (representing negative expression of a molecule) defines the phenotype of the cell. After passing through the detector, cells with the same phenotype of interest are diverted towards a designated collecting tube based on electrical charge.

FACS is broadly applied in various studies as long as the population to be enriched is labeled with fluorescence.^3-7 It has been used to separate immunoglobulin (Ig)A-coated bacteria from non-IgA coated bacteria in the gut microbiota ⁸ and sort genetically engineered cell populations expressing fluorescent proteins. ⁹ Importantly, it has the capacity to separate more than one population simultaneously, which not only saves time and reagents but also allows for more sophisticated study designs. ¹⁰ However, FACS also has its limitations. If a population of interest is very rare (less than 1%), the sorting efficiency may be reduced, causing significant cell loss. In addition, some antibody binding may activate intracellular signal transduction that induces functional changes of the sorted cell population. ¹¹ Therefore, the phenotype used for sorting should be selected carefully.

Other methods exist besides FACS that are also based on cell surface markers for the enrichment of specific cell populations, such as magnetic-activated cell sorting (MCS). ¹² Similar to FACS, magnetic beads-conjugated antibodies can target specific cell surface molecules. Upon antibody-antigen interaction, magnetic beads-coated cells can be separated from non-coated cells after passing through a magnetic field. However, only a limited number of molecules can be targeted in MCS, as magnetic beads are, unlike various fluorescent colors in FACS, undistinguishable. It is thus difficult for MCS to define a cell phenotype with a complicated combination of surface markers. ^13,14 In addition, MCS is also able to cause unintended activation of target cells.

In our studies of a mouse model of systemic lupus erythematosus (SLE), ¹⁵ we intended to purify plasmacytoid dendritic cells (pDC) to investigate their functional changes with disease progression. We first used MCS to enrich pDC from the bone marrow by targeting PDCA-1, a molecule highly and uniquely expressed on murine pDC at steady state. ¹⁶ However, the cell purity was unexpectedly low, likely due to the upregulation of PDCA-1 on other cell populations in an inflammatory environment such as SLE.¹⁶ Ultimately, we have used FACS with a combination of four surface markers (CD11c, CD11b, B220 and PDCA-1) to separate high-purity pDC as CD11c+CD11b-B220+PDCA-1+ population. Murine pDC has another specific surface marker Siglec-H. We decided not to use Siglec-H, as antibody binding of this molecule represses the function of pDC to produce IFNα. ¹¹

프로토콜

참고 : MRL / MP-의 Fas의 ^LPR 루푸스 발생하기 쉬운 쥐 사육과 버지니아 공대 (동물 복지 보증 번호에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 요구 사항에 다음과 같은 특정 병원균이없는 시설에서 유지되었다 (MRL / LPR) : A3208-01). 이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드의 권장 사항을 엄격히 준수하여 실시 하였다. 모든 동물 실험은 IACUC 프로토콜 # 12-062 하에서 수행 하였다.

1. 세포 배양 매체 및 정렬 버퍼

1. 완전한 세포 배지 (C10)를 10 % 소 태아 혈청, 1 mM 피루브산 나트륨, 1 내지 100 % MEM 비 필수 아미노산, 10 mM의 HEPES, 55 μM 2- 머 캅토 에탄올, 2 mM L- 글루타민 및 보충 된 RPMI 1640을 사용하여 준비 100 U / ㎖ 페니실린 - 스트렙토 마이신.
2. 정렬 버퍼를 준비 된 10 mM HEPES가 보충 1X 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS)를 사용하여 (가득 HBSS) 2.5 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민0.05 밀리미터의 MgCl _2, 0.2 U / ㎖ DNase의 I.

2. 마우스 해부

1. 4 ML의 C10를 포함하는 두 개의 6 cm 직경 요리를 준비합니다. 얼음에 요리를 놓습니다.
2. CO ₂ 흡입 마우스를 안락사.
3. 비장을 수확하고 얼음에 C10와 함께 접시에 보관합니다.
   1. 해부 접시에 직면하고있는 배와 마우스를 아래로 핀. 70 % 에탄올을 분무하여 몸을 소독.
   2. 피부를 잘라 아래 목의 치골에서 복부 정중선을 따라 근육 벽에서 피부를 분리합니다.
   3. 발목의 첫 번째 절개에서 뒷다리를 따라 피부를 잘라.
   4. 다시 측면에있는 피부를 핀과 다이어프램하는 최초의 절개 곳에서 측면을 따라 근육 벽을 잘라.
   5. 헤드의 우측에 근육 벽 위로 고정.
   6. 소장 하부 위장 옆 마우스의 오른쪽에 비장을 찾아. 일의 한쪽 끝을 픽업전자 비장과 위장에서 분리.
4. 대퇴골과 경골을 포함, 모두 뒷다리를 잘라하고, 가능한 한 많은 모든 근육을 제거합니다.
   1. 혈관을 피하기 위해 노력하고, 날카로운 가위로 발목 골반 / 고관절에서 뒷다리를 따라 근육을 잘라.
   2. 골수 콘텐츠의 노출없이 골반 / 고관절 발목 / 발 관절 절단하여 뒷다리를 분리한다.
   3. 반복적 면도날 긁 접합 지점에서 근육을 절단함으로써 뼈 깨끗 나머지 근육.
5. 얼음에 4 ML의 C10을 포함하는 6cm 접시에 뼈를 유지합니다. 다음 마우스를 해부를 진행합니다.

3. 비장 격리

1. 더 레드 조각을 볼 수 없을 때까지 4 ML의 C10를 포함하는 접시의 상단에 70 μm의 셀 스트레이너에 대한 주사기 플런저 부드럽게 비장을 균질화.
2. 스트레이너 관통 접시에 추가 6 ML의 C10 추가ND 후 15ml의 원뿔형 튜브에 총 10 ml의 세포 현탁액을 전송.
3. 5 분, 4 °에 C 800 XG에서 원뿔 튜브를 원심 분리기.
4. 원심 분리 후, 상등액을 흡인하고 2 ㎖의 1 × 적혈구 (RBC) 용해 완충액에서 세포 펠렛을 재현 탁. 5 분 동안 실온에서 인큐베이션.
5. 배양 후, 5 분, 4 °에 C 800 XG에서 원뿔 튜브를 원심 분리기.
6. 원심 분리 후, 상등액을 흡인하고 한 ML C10에서 세포 펠렛을 재현 탁. 어떤 큰 덩어리 (죽은 세포)를 취소하고 나중에 얼음에 튜브를 유지.
   주 : 많은 작은 덩어리가있는 경우, 일단 세포 현탁액을 필터링하기 위해 70 μm의 세포 여과기를 사용한다.
7. 자동 세포 계수기를 사용하여 트리 판 블루로 세포 수를 계산.

4. 골수 세포 분리

1. 박격포로 4 ML의 C10과 뼈를 전송하고 총 10 ML의 C10의 볼륨을 만들기 위해 6 ML의 C10을 추가합니다.
2. AP를 이용하여 모르타르에서 가볍게 뼈 균열estle.
3. C10에 골수를 해제 유봉으로 가볍게 저어.
4. 70 μm의 세포 여과기를 통해 얼음에 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 골수를 함유하는 10 ㎖의 C10 전송. 아직 뼈가 포함 된 박격포에 10 ml의 신선한 C10을 추가합니다.
   주 : 피펫 붉은 덩어리가 표시하는 경우 여과기를 통과하기 전에 골수 위아래로 수회 함유 용액.
5. 반복 두 번 4.4-4.2 단계를 반복합니다. 마지막 세척 후, 뼈 흰색 나타납니다.
6. 5 분, 4 °에 C 800 XG에 50 ML 원뿔 튜브를 원심 분리기. 한편, 실온에서 15 ml의 원추형 원심 분리 튜브에 5 ㎖를 즉시 사용 가능한 밀도 구배 매질을 제조.
7. 원심 분리 후, 상등액을 흡인하고 10 ㎖의 C10에서 세포 펠렛을 재현 탁.
8. 천천히 두 단계 들간의 인터페이스를 유지하면서 5 ml의 밀도 구배 매체의 상부에 10 ml의 세포 현탁액을 층을 포함한다. 그런 다음 30 분에 대한 1,363g에서 15 ML 원뿔 튜브를 원심 분리0 (또는 브레이크 OFF)로 설정 가속 9로 설정하고 감속와 RT (20 ° C).
9. 원심 분리 한 후 조심스럽게 가기 8 mL의 용액을 제거하고 새로운 15ml의 원뿔형 튜브에 인터페이스 (단핵 세포 층)의 2 mL의 버피 코트를 수집한다.
10. 골수 단핵 세포, 캡을 포함하는 15 ML 원뿔 관에 12 ml의 차가운 얼음 C10을 추가 한 다음, 잘 혼합 10 분, 4 °에 C 800 XG에서 튜브를 원심 분리기 여러 번 반전.

FACS 5. 세포 표면 염색

1. 샘플 염색
   1. 항 - 마우스 CD16 / 32 항체 용액 (에서 1-100 희석 HBSS - 전체 / ml의 최종 농도 5 μg의)를 준비합니다.
   2. 단계 4.10의 원심 분리 후, 상등액을 흡인하고, 단핵 세포상의 Fc 수용체를 차단하기 위해 100 ㎕의 항 - 마우스 CD16 / 32 항체 용액 중에 세포 펠렛을 재현 탁. 10 분 동안 빙상에서 인큐베이션.
   3. (개미 형광 - 복합 항체 혼합물을 준비내가 마우스의 CD11c-PE 1시 40분 희석, 항 - 마우스 CD11b를-APC-CY7 1:80 희석, 항 - 마우스 PDCA-1-FITC 1시 40분 희석 및 항 마우스 B220-V500 HBSS-에서 1시 40분 희석 샘플 당 100 ㎕의 최종 부피)의 제조업체에서 권장 전체.
      참고 : 사용하기 전에 항체를 적정하는 것이 중요하다.
   4. 단계 5.1.2에서 10 분 배양 한 후, 항 마우스 CD16 / 32 언 바운드 제거하기 위해 5 분, 4 ° C 800 XG에 4 ml의 얼음 차가운 HBSS - 전체와 원심 분리기를 추가합니다.
   5. 원심 분리 후, 상등액을 흡인하고 100 ㎕의 형광 접합 된 항체 혼합물의 세포 펠렛을 재현 탁. 어둠 속에서 15 분 동안 빙상에서 인큐베이션.
   6. 15 분 부화 후, 언 바운드 형광 복합 항체를 제거하는 5 분, 4 ° C 800 XG에 4 ml의 얼음 차가운 HBSS - 전체와 원심 분리기를 추가합니다.
   7. FACS 로딩 솔루션 (HBSS-전체 500 NG / ㎖ DAPI)를 준비합니다.
   8. 단계 5.1.6에서 원심 분리 후, 상층 액을 대기음 500 μ의 세포 펠렛을 재현 탁; 리터 FACS 로딩 솔루션입니다. 12 X 75mm 둥근 바닥 튜브 (FACS 튜브)에 세포 현탁액을 전송하고 1 시간 내에 정렬 될 때까지 어둠 속에서 얼음에 튜브를 유지.
2. 보상 염색
   1. PE, APC-CY7, FITC, V500, DAPI 또는 염색 등의 레이블 6 FACS 튜브. 1 × 10 ⁶ 세포 /를 FACS 튜브에 튜브 및에서 나누어지는 비장 세포는 5 분, 4 °에 C 800 XG에 4 ml의 HBSS - 전체 씻어.
      주 : 사용 사균의 생균을 구별하는 형광 염료, DAPI를 DNA 결합. DAPI는 죽은 세포의 세포막 (그러나 살아있는 세포) 및 바인드 염색체 DNA를 통과 할 수 있습니다.
   2. 뜨는을 대기음, 100 μl의 HBSS-전체에서 세포 펠렛을 resuspend.
   3. 항 - 마우스 CD19-PE 1시 40분 희석, 항 - 마우스 CD11b를-APC-CY7 1:80 희석 항 마우스 PDCA -1- FITC 1시 40분 희석 또는 각각 대응 FACS 튜브 내의 다음 항체 중 하나를 추가 manufa의 권장 방지 마우스 B220-V500 1시 40분 희석cturer. 그대로 5 ^일 (DAPI)과 6 ^일 (흠) FACS 튜브를 남겨주세요. 흔들어 잘 혼합하고 15 분 동안 어둠 속에서 얼음에 모든 FACS 튜브를 품어.
   4. 배양 후, 5 분, 4 ° C 800 XG에서 각 튜브와 원심 분리기에 FACS 튜브를 4 ml의 차가운 얼음 HBSS-전체를 추가합니다.
   5. 원심 분리 후, 상층 액을 대기음, 500 μl의 얼음에있는 세포 펠렛을 500 ㎕의 FACS로드 용액에 재현 탁 DAPI 표시된 튜브에 펠렛을 제외하고 차가운 HBSS-전체를 재현 탁. 정렬 될 때까지 어둠 속에서 얼음에 모두 6 튜브를 유지.

6. 셀 분류기에 정렬

주 : 사이토와 소프트웨어 절차를 정렬하는 동작은, 회사가 제공하는 구체적인 명령으로 표준화된다. 간단히 말해서, 우리는 20 psi에서 100 미크론 노즐, 5 사이의 설정 대상 셀 농도 사용 - ml의 당 10 만, 70 % 이상으로 효율을 조정 (즉, 충돌 30 아래에 보관%).

1. 100 U / ㎖ 페니실린 - 스트렙토 마이신이 포함 된 500 μL의 FBS / 튜브 수집 FACS 튜브를 준비합니다.
2. 단계 5.2에서 단일 얼룩 보정 튜브를 이용한 셀 소터의 보정 파라미터를 조정한다.
   1. 각각의 형광 강도에 대한 부정적인 게이트를 설정 흠 튜브 만 셀을 기록합니다.
   2. 각각의 형광 강도에 대한 긍정적 인 게이트를 설정하는 다른 단일 얼룩 보상 튜브 만 셀을 기록합니다.
      주 : 소프트웨어가 자동으로 보정 파라미터를 계산합니다.
3. 3,000 셀을 기록하여 정렬 된 세포 집단의 게이트를 설정하는 단계 5.1에서 하나의 샘플을 사용합니다. 수동 분명히 다른 점에서 분리 점 그룹으로 X 및 Y 축 그래프 게이트 표적 세포 집단의 파라미터 형광 강도 사용.
   참고 :이 게이팅 세트는 연구자의 요구 사항에 따라 유연하고 임의이다. 연구자들은 하나 이상의 마커에 기초하여 높은 순도를 기대하는 경우, 게이트 이동높은 대응하는 형광 강도에 따라.
4. 컬렉션 튜브를로드하고 대상 세포 인구를 정렬 시작합니다.
5. 모든 샘플 튜브가 완료 될 때까지 정렬 한 후 얼음에 포집 관을 유지합니다.
6. 4 ml의, 모자까지 포집 관에 얼음 감기의 C10을 추가하고 혼합하는 반전.
7. 5 분, 4 ° C 800 XG에서 수집 튜브를 원심 분리기, 다음의 손길이 닿지 않은 세포 펠렛으로 약 200 μl를 떠나, 뜨는을 대기음.
8. 세포 펠렛을 재현 탁하고, 1.5 ml의 원심 분리 관에 모든 세포 현탁액을 전송하기 위해 1 ml의 얼음 추위에 C10을 추가합니다.
9. 원심 분리기의 손길이 닿지 않은 세포 펠렛 100 μl를 떠나는 1.5 ML의 5 분, 4 ° C 800 XG에 튜브와 뜨는을 대기음.
10. 사용할 때까지 얼음에 정렬 된 세포 집단을 저장합니다.

결과

우리는 높은 순도 골수 PDC를 풍부하게하는 것을 목표로하고 IFNα를 생산하는 능력에 대한 PDC의 기능 변화를 연구하는 젊은이와 노인 모두의 MRL / LPR의 루푸스 발생하기 쉬운 마우스에서 다른 세포 유형의 영향없이. 사용 된 첫 번째 정제 전략은 그림 1과 같이 농축 후 만 7.75 % 순도 주도, MCS했다. MCS에 비해 FACS은 96.4 %로 높은 순도의 PDC 농후. 높은 순도를 보장?...

토론

The protocol described in this manuscript is for high purity enrichment of live pDC that retain the ability to produce IFNα. The applications of this protocol include, but are not limited to, purification of pDC and/or any other mononuclear cells from the bone marrow of MRL/lpr and any other mouse strains for studies of cellular and molecular functions. Several critical steps in this protocol are to ensure high viability and purity of the sorted pDC. The first key step is the release of bone marrow from bones. To mi...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	gibco by life technologies	11875-093
Fetal bovine serum	HyClone	SH30396.03
Sodium pyruvate	gibco by life technologies	11360-070
MEM non-essential amino acids	gibco by life technologies	11140-050
HEPES	gibco by life technologies	15630-080
2-mercaptoethanol	gibco by life technologies	21985-023
L-glutamine	gibco by life technologies	25030-164
Penicillin-Streptomycin	gibco by life technologies	15140-122
1x Hank’s Balanced Salt Solution	gibco by life technologies	14175-079
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	130-091-376
MgCl2	SIGMA	M8266
DNase I	SIGMA	D4527
Red blood cell (RBC) lysis buffer	eBioscience	00-4300-54
Density gradient medium	GE Healthcare	17-1440-02	Ficoll-Paque Plus
anti-mouse CD19-PE	BD Pharmingen	553786
anti-mouse CD11c-PE	eBioscience	12-0114-82
anti-mouse CD11b-APC-CY7	BD Pharmingen	557657
anti-mouse PDCA-1-FITC	eBioscience	11-3172-81
anti-mouse B220-V500	BD Pharmingen	561226
DAPI	invitrogen	D3571
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotec	130-092-786
BD FACSAria I flow cytometer	BD Biosciences	643178
BD FACS Diva version 6	BD Biosciences