개 호중구 세포 외 트랩 릴리스의 정량화를위한 ​​간단한 형광 분석

요약

호중구 세포 트랩 (그물) DNA, 히스톤 및 호중구 단백질의 네트워크입니다. 선천성 면역 반응의 구성 요소이지만, 그물자가 면역 및 혈전증에 연루되어있다. 이 프로토콜은 개과 호중구 분리 및 마이크로 플레이트 형광 분석법을 이용하여 그물 정량화하기위한 간단한 방법을 설명한다.

초록

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.

서문

만 70 애완 동물 개 ^{1 혼자} 미국에 있습니다. 소중한 가족으로,이 동물은 종종 가장자리 치료를 절단받을 수 있습니다. 그들은 우리의 환경을 공유 마찬가지로 때문에, 개는 인간의 질병 ^1의 병인과 치료에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 그러나, 의학적 치료 또는 그 반대에 인간 의약 발견 변환 여부는 완전히 같은 선천성 면역 반응 심지어 고도로 보존 시스템 종 변형을 특성화하는 것이 중요하다. 송곳니와 인간의 선천성 면역 시스템 사이의 차이의 예는 개 호중구 ⁽²⁾ 높은 표현 CD4을 포함한다; 개 ^3의 세포질 플라 젤린 센서 IPAF의 기능 동족체의 부재와 육식 ^4에서 카스파 제 1/4 하이브리드의 표현.

호중구 세포 트랩 (그물) 선천성 면역 ^(5)의 비교적 최근에 발견 된 구성 요소입니다. 그물 네트워크입니다감염성 또는 염증성 자극 ^(6)의 넓은 범위에 응답하여 해제 DNA, 핵 단백질의 입상. NET 같은 구조 닭 ^{7, 8} 물고기, 연체 동물류 ^{(9, 10)을} 포함하는 많은 종 acoelomates 통해 입증되었지만 종 차이가있다. 예를 들어, 쥐의 호중구 인간 호중구보다 NETosis 자극에 더 느리게 응답, 덜 확산 그물 ^{(11)을 형성한다.} 그물 직접 병원균 ^12,13 죽이는 데 관여 할 수 이상의 논쟁 미생물 포획, 복수 종 증거하는 큰 몸체있다. 그러나 NET 구성 요소는 또한, 조직 손상을 강화 ^{14, 15을자가} 항원으로 혈전증 행동을 촉진. 그물의 유익하고 해로운 영향 사이의 균형은 종과 관심의 조건에 모두 그물을 조사하는 것이 중요하다 제안, 다른 질병과 다른 종 사이에 차이가있을 수 있습니다.

여기에 우리유도와 송곳니 호중구 그물의 방출을 측정하기위한 간단한 프로토콜을 설명한다. 이 방법은 호중구 ^(16)을 분리하여 다른 종 NETosis을 유도하기 위해 사용 된 것과 유사하지만, 이러한 효능 제 농도 및 배양 시간 등의 조건은 개과 호중구에 대해 최적화되었다. 유사한 NET 정량화 DNA 분리 분석은 다른 종에서 설명되었지만, 여기에 제시된 방법은 또한 개 ^8,17,18에 최적화되어있다.

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프로토콜

모든 실험은 아이오와 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에서 윤리적 허가 하였다.

1. 혈액 컬렉션

1. 직접 항응고제로 복재, 두부 또는 경정맥에서 혈액의 9 ml의 그리기 (예를 들어, 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 1.8 mg의 K ₂ EDTA / ml의 혈액) vacutainers, 또는 EDTA 함유 혈액 튜브에 즉시 전송 주사기로. 부드럽게 굴러 또는 혈액 항응고제의 적절한 혼합을 보장하기 위해 혈액 튜브를 반전한다.

2. 호중구 격리

1. 한 50㎖ 원추형 튜브에 멸균 실온 동량 혈액을 3 % 혼합하여 부드러운 반전 덱스-500 (0.9 % 멸균 식염수에 만든). 실온에서 18 ~ 20 분 동안 똑바로 서 둡니다. 그것은 더 이상 낮은 적색 층에 의해 오염없이 수집 할 수 없습니다 때까지 새로운 튜브에 밀짚 색깔의 상위 계층을 전송합니다. 일의 적혈구즉 원래 튜브는 폐기 될 수있다.
2. 4 ℃에서 10 분 동안 500 XG에 뜨는을 원심 분리기. 오프 그리기 및 상층 액을 버린다. 수동 10 ㎖를 실온 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)으로 세포 펠렛을 다시 일시. 그 텍싱이 프로토콜의 모든 단계에서 다시 일시 중지 호중구에 사용하지 않아야합니다. 수동으로하지 않고 또한 세포 수율을 극대화하기 위해 프로토콜을 통해 추천 상층 액을 붓는 것보다, 오프 그리기.
3. 한 50㎖ 원추형 튜브에 실온 polysucrose 나트륨 diatrizoate 세포 분리 용액 (예, Histopaque 1077) 10 ㎖를 추가한다. 조심스럽게 세포 분리 용액을 통해 셀 - 함유 용액을 층을 포함한다. 셀의 수율을 감소시킬 수 실온으로 평형화되지 않았다고하여 세포 분리 용액을 참고.
4. 브레이크 해제와 함께 실온에서 30 분 동안 300 XG에 원심 분리기.
5. 호중구는 그라데이션의 가장 낮은 층에있는 바와 같이, 오프 그릴과 uppe을 폐기혈장, 혈소판, 단핵 세포의 좁은 대역 흰색 및 밀도 구배 매체를 클리어 층 상층 이루어지는 R 3 층.
6. 나머지 적혈구를 용해시키기 위해, 실온에서 물 10ml에 호중구 펠렛을 다시 일시.
7. 30 초 후, 멸균 실온 1.8 % 염화 나트륨 10 ㎖를 첨가하여 긴장성 복원하고 온화한 역전에 의해 혼합한다.
8. 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에 원심 분리기. 상층 액을 그려 버린다.
9. 펠렛 여전히 적색 인 경우, 용해하는 단계를 반복한다. 펠렛은 백색 (또는 용해 이미 두 번 수행 된 경우), 부드럽게 멸균 PBS 10 ㎖로 세포를 다시 정지합니다.
10. 자동 카운터 또는 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. 일반적인 금리는 혈액 1 ㎖ 당 적어도 10 ⁶ 세포이다.
11. 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에 원심 분리기. 상층 액을 그려 버린다.
12. 멸균 PBS 실온에서 원하는 농도로 세포를 다시 일시. FOR DNA를 분리 분석은 ml의 당 5 × 10 ⁶ 세포에서, 섹션 2에 resuspend을 설명했다.
13. 경우에 따라, 세포의 소량을 직접 전송하거나 유리 슬라이드에 cytocentrifuge을 사용. 세포가 건조 얼룩 (가) '지침을 제조에 따라 빠른 고정 및 염색 키트를 사용 할 수 있습니다. 현미경으로 관찰 할 때 호중구의 분리가 성공한 경우 유핵 세포의 적어도 95 %는 최소한의 오염 적혈구와 과립구 (호중구, 호염기구, 호산구)이어야한다.

3. DNA 자료 분석

1. 호중구 차단 후 바로 DNA 자료 분석을 설정합니다.
2. 세포 응집 광 현미경 원액 시험에 있으면, 즉시 분석을 설정하기 전에 멸균 70 ㎛의 멸균 필터를 이용하여 세포 현탁액을 통과한다.
3. 멸균 96 웰 플레이트의 각 실험 웰에 5 × ¹⁰⁴ 세포 / 웰을 추가; 작용제 및 로스웰 파크 메모페놀 레드와 100-200 μL의 최종 부피로 0.5 % 열 - 불 활성화 소 태아 혈청이없는 리알 연구소-1640 (RPMI) 매체. 호중구 원액 PBS 동량으로 대체되는 작용제 당 적어도 두 블랭크 웰을 포함한다. 각 작용제에 대한 빈 우물을 설정하면 형광 분석과 함께 작용제에 의해 작용제 또는 간섭의 DNA 오염을 배제 중요합니다.
4. 탄산 가스 (4 %) 인큐베이터에서 30 분 동안 39 ℃에서 인큐베이션.
5. 원하는 농도와 세포 투과성 핵산 염료에 효능을 추가합니다. 다른 핵산 염료 사이에 다릅니다 세포 투과성 염료의 최적 농도를합니다. 작용제 미디어 동량으로 대체되는 무 자극 제어는 각각의 실험에 포함되어야한다.
   주 : 웰 사이의 일관된 상태를 유지하기 위해 배양액의 유사한 양의 효능을 희석하는 것이 바람직하다. (200)의 최종 아니라 볼륨 &# 181; 난 성공적으로 사용되어왔다이이 변경되는 경우, 잘 볼륨은 모든 조건이 동일 유지해야한다. 포볼 -12- 미리 스테이트 -13- 아세테이트 (PMA) (최종 농도 ≥0.1 μM) 혈소판 활성화 인자 (PAF) (최종 농도 ≥31 μM)을 양성 대조군으로 사용할 수있다. 작용제 중복 적어도 측정해야한다.
6. 39 ° C에서 품어. 2시간 후, 또는 소정의 간격으로 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 형광을 측정한다. 최적의 시간 간격을 사용 작용제에 따라 달라질 수 있습니다.
   참고 : 파장이 사용 염료에 따라 달라집니다.
7. 평균 형광을 계산하기 전에 빈 형광을 뺍니다.
8. 개인간 및 플레이트 사이의 비교를 위해, 비 자극 된 웰의 평균 형광 자극 웰의 평균 형광을 나누어 형광 폴드 변화를 계산한다.

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결과

이 프로토콜을 이용하여, 양성 대조군, 및 PAF PMA로 호중구를 자극 후의 형광 강한 배의 변화가있을 것이다. 비 자극 세포 (범위 2.0-5.8, N = 5 개) ^18에 비해 형광의 평균 4.0 배 증가에서 1 시간 결과 31 μM PAF와 그림 1B, 송곳니 호중구의 자극에 도시 된 바와 같이. 0.1 μM (도 1a)에서 PMA 2 시간까지 형광을 증가시키지 않는 느린 작용제하지만 궁극?...

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토론

제시된 DNA 분리 분석은 세포 DNA에 대한 용이 한 정량 분석한다. 이 방법은 다른 종에서 NET 형성을 평가하기 위해 사용 된 유사한 기술에서 채택되었지만, 원심 속도 작용제 농도와 항온 처리 시간은 개과 호중구 ^8,17,18 함께 사용하기위한 방법을 최적화하기 위해 변경되었다. 유사한 조정이 다른 종의 방법을 적용하도록 할 수있다. 분석은 유동 세포 계측법 또는 이미지 분석으로 NETosis을 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA	BD	367835
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771
Dextran-500	Accurate chemical and scientific corp.	AN228410
Phosphate buffered saline	ThermoFisher scientific	20012043
Fetal bovine calf serum, heat inactivated	ThermoFisher scientific	10100139
RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine	ThermoFisher scientific	32404-014	Should be free from phenol red
96 well flat bottomed sterile polystyrene plate	Falcon	353072
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P1585
Platelet activating factor	Sigma-Aldrich	P4904
SYTOX Green Nucleic Acid Stain	ThermoFisher scientific	S7020
Synergy 2 Multi-Mode Reader	BioTek	NA