HIV-1에 감염된 세포에서 엑소 좀의 SILAC 기반 단백체 특성

요약

여기서는 호스트 exosomal의 프로테옴에서 HIV-1 감염의 효과를 분석하기 위해, 세포 배양 (SILAC)의 아미노산이 안정 동위 원소에 의한 표지의 기술을 이용하여 정량적 프로테오믹스 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 쉽게 다른 스트레스 또는 감염 조건 하에서 세포에 적용 할 수있다.

초록

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.

서문

바이러스 감염을 포함한 많은 인간의 질병은 종종 및 영향을받는 세포 주위에 발생하는 독특한 세포 과정과 연결되어 있습니다. 단백질은 종종 이러한 과정을 중재 궁극적 이펙터 세포로서 작용. 단백질의 분석은 종종 영향을 세포의 지역 환경에 관한 귀중한 정보를 제공하고 질병 발병의 기본 메커니즘을 이해하는 데 도움이 있습니다. 다양한 단백질 분석 기법 중 프로테오믹스 특히 큰 약속을 보유하고있다. 강력한 대규모 도구로서 특히 프로테오믹스 기능과 단백질의 상호 작용의 영역에서 세포 과정의 체계적인 이해를 제공 할 수있다. 특정 단백질을 분석하여 조사 부위에서 연구자들은 세포 성분, 특히 단백질의 발현을 모니터링 할 수 있도록 분류 기술의 개발을 간단하게한다. 많은 프로테옴 분석은 세포에서 수행되었지만프로테옴 규모, 세포 내 구획에 단백체 특성화 ¹ 특히 유익한 것으로 판명했다. 이는 HIV-1 감염의 연구에서 잘들 수있다.

엑소 좀 셀 타입 ^{2, 3,} 광범위한 분비 30-100 nm의 막 소포 간 통신 및 분자 수송의 중요한 구성 요소이다. 이들은 이전에 HIV-1 신진 공정 ^{4, 5에} 중요한 역할을하는 발견되었다. 기능 해부와 단백체 분석을 결합함으로써, 우리는 HIV-1에 감염된 세포에서 방출 엑소 좀은 세포 사멸 및 증식 ^(6)을 포함하여 수용 세포를 이웃에 휴대 속성에 영향을 미칠 독특하고 정량적으로 다른 단백질 서명과 항구 규제 분자로 구성되어 있음을 발견했다. 방법이 프로토콜에 설명되어즉 SILAC HIV-1에 감염된 세포에서 엑소 좀 ⁷ 기반 단백체 특성 (세포 배양에서 아미노산에 의해 안정 동위 원소 라벨). 비슷한 접근 방식은 더 나은 특정 구획 또는이자의 일부에 실험 스트레스를 조절하고 설명 된 절차에 필요한 사항을 변경하여 발병하는 동안 다른 세포 내 구획을 이해하고 적용 할 수 있습니다.

정량 프로테오믹스 방법의 최근 발전을 감안할 때, 특정 실험을 위해 가장 효율적인 방법을 선택 할 때 선택할 많은있다. 이 중 화학 기반 iTRAQ (상대 및 절대 정량 동중 태그) ⁽⁸⁾ 및 라벨없는 MRM (다중 반응 모니터링) ⁽⁹⁾ 기술이다. 두 방법 모두 강력한 도구이며 특정 설정을위한 좋은 선택입니다. 일반적인 실험실은 주로 세포 라인 작업을 위해, 그러나,이 두 가지 방법이 relativel이Y 높은 비용은 더 많은 시간이 걸리는 SILAC 기반 방법에 비해. SILAC 세포질 단백질로 배양 배지로부터 아미노산의 비 방사성 동위 형태를 포함 대사 라벨링 기반 기술이다. 일반적으로 SILAC 실험 예를 들어 두 개의 세포 집단, 감염 및 감염되지 않은 시작합니다. 전체 라벨이 달성 될 때까지 각각 차등의 특정 동위 원소 환경에서 레이블이 붙어 있습니다. 이러한 세포의 표지 엑소 좀이어서 단백질 추출을 실시한다. 일단 분류 exosomal 단백질 액체 크로마토 그래피 탠덤 질량 분광법 ^(10)를 사용하여 분석된다 추출 하였다. 마지막으로, 질량 분석 결과와 유의 표지 단백질은 통계를 실시하고 정보학 엄격한 생화학 검증뿐만 아니라 분석한다. 이전 조사 보고서 세포주는 일반적되는 것과 SILAC / 엑소 절차, 일차 전지보다 세포주에 더 적합한 것으로 제안효율적인 동위 원소 라벨에 대한 활성 증식 상태,

프로토콜

1. 세포 배양 및 HIV-1 감염

참고 : 실험을 시작하기 전에,이 MTT 분석 ^(12)를 통해 트리 판 블루 염색 ^(11)를 통해 세포의 생존과 증식을 확인하는 것이 좋습니다. 또한 새롭게 준비 SILAC 매체를 사용하는 것이 중요합니다. 다양한 세포주가 활발하게 증식 단계에 있으며, HIV-1 감염, 또는 원하는 시험 조건에 민감한만큼 사용될 수있다. 이 프로토콜에서, 예로서, H9 세포주를 사용한다.

1. 각 세포 배양 플라스크에 종자 2 × ¹⁰⁶ H9 세포. 10 % 투석 된 소 태아 혈청 (FBS), 100 ㎎ / ℓ ⁽¹³⁾ C ₍₆₎ L- 라이신 및 100 ㎎ / ℓ ^{13 15} C ₆ N ₄ L 아르기닌을 함유하는 RPMI 1640 배지 10ml에 표시된 하나의 그룹으로 성장한다. 투석 FBS 10 %, 100 ㎎ / ℓ의 L- 라이신 및 100 ㎎ / ℓ L- 아르기닌과 함께 10 mL의 표지되지 않은 RPMI 1640 배지에서 다른 그룹 성장.
2. 큰 아미노산으로 표지 된 배지에서 세포의 단백질이 실질적으로 완전히 분류되는 점을 6 분열 (> 99 %)에 대한 세포 성장. 신선한 매체를 추가 또는 정기적으로 미디어를 변경 (모든 1~3일 세포의 종류에 따라. H9 세포의 경우, 중간 3 일마다 변경). 라벨의 끝에서보다 세포의 성장을 수용하기 위해 배양 부피 (예를 들어 ~ 30 ㎖)을 증가시킨다.
   주 : 트립 판 블루 염색법 및 세포 계수를 통해 실험의 시작 시간을 두배 정확한 셀을 결정한다.
3. HIV-1 _{NL4-3 48} 시간 동안 표준 HIV-1 감염 프로토콜 ^13을 사용으로 표시된 세포를 감염. 0.3 주변 감염의 다중성 (MOI)로 바이러스의 적절한 양의 세포를 인큐베이션. 에이즈-1 P24 항원 ELISA 키트를 사용하여 배양 상층 액의 P24 정량에 의해 HIV-1 감염을 확인합니다. 세포의 성공적인 감염을 확인하기 위해 면역 형광 분석 ^{(14)을 수행합니다.} KEEp는 HIV-1 감염없이 레이블이없는 배지에서 레이블이없는 세포를 성장.
4. 감염의 끝 (2.1 단계)에서 두 그룹의 상층 액을 수확.

2. 엑소 좀 격리

주 : 초 원심 분리의 일련의 단계를 통해, 배양 상청액 분획으로부터 exosomal ¹⁵ 농축된다. 적어도 100,000 × g으로의 속도에 도달 할 수있는 초 원심 분리기 로터와 4 ° C에서 다음의 모든 단계를 수행합니다.

1. 세포를 피하고, 50 ML 원뿔 튜브의 문화의 상층 액을 수집합니다. 잔여 세포를 제거하기 위해 300 × g으로 10 분 동안이를 원심 분리기.
2. 새로운 50 ML 원뿔 튜브의 상층 액을 수집하고 죽은 세포를 제거하는 2,000 XG에 10 분을 원심 분리기. 초 원심을 견딜 수있는 상업 회 호환 튜브에 상층 액을 결과로 전송.
3. 초원 심 분리기 튜브의 균형을해야합니다. 제거 10,000 × g으로 30 분 동안 튜브를 원심세포 파편.
4. 100,000 x g에서 70 분 동안 초 원심 분리기 튜브의 상층 액을 원심 분리기를 수집합니다. 상층 액을 버린다.
5. 신선한 PBS 5ml에 엑소 좀 풍부한 펠릿 재현 탁. 100,000 x g에서 70 분 동안 다시 신선한 초원 심 분리기 튜브와 원심 분리기에 솔루션을 전송합니다.
6. 취소 상층 액. 엑소 좀을 장기 저장하려면, -80 ° C에서 PBS와 저장소의 50 μL에 펠렛을 재현 탁. 아래 그림과 같이 다른 방법으로, 단백질 추출에 직접 진행합니다.

3. 단백질 추출 및 준비

1. 추가 프로테아제 억제제 칵테일 100 ~ 200 ㎕를 RIPA 용해 및 추출 버퍼에 격리 exosomal 알약을 녹여. 버퍼을 pH 7.6에서 25 mM 트리스 - 하이드로 클로라이드, 150mM 염화나트륨, 1 % NP-40, 1 % 나트륨 데 옥시 콜레이트, 0.1 % SDS (도데 실 황산나트륨)로 구성된다. 프로테아제 저해제 칵테일은 아프로 티닌, bestatin, L 같은 프로테아제 억제제의 다양한 포함해야eupeptin는 및 EDTA (에틸렌 디아민 테트라 아세트산) 펩 스타틴, 즉 프로테아제의 전체 범위를 억제 할 수있다.
2. 13,000 XG (4 ° C)에서 10 분 동안 용해 된 솔루션을 원심 분리기, 새로운 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 삭제 상층 액을 전송합니다.
3. bicinchoninic 산 (BCA) 또는 브래드 포드 분석법 ^(16)을 이용하여 엑소 좀의 각 샘플의 단백질 농도를 정량화.
4. 레이블과 레이블이없는 샘플에서 단백질의 동일한 양 (2 μg의)를 혼합하고 120mA에서 4-20 % SDS-PAGE 겔에 동일한 혼합물을 실행 / 200 V 분 30.
5. 쿠마시 블루 염색 된 겔 ^(17)을 탈색 하였다.
6. 면도날을 사용하여 겔로부터 샘플 레인 잘랐다. 그런 다음 10 ~ 15과 동일한 조각으로 겔 차선을 잘라. 10 ~ 15 튜브의 총 신선한 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 각 조각을 넣어.
7. 50 % 아세토 니트릴, 소용돌이 25 mM의 NH ₄ HCO ₃ 큐브를 체험하고, 상층 액을 버린다. 두 번 반복합니다. 마른진공 농축기 ^{(18, 19)에} 큐브.
8. 10 mM 디티 오 트레이 톨 (DTT), 소용돌이, 그리고 원심 분리기 간단히 큐브를 재수. 1 시간 동안 56 ° C에서 품어. 폐기 뜨는.
9. 55 MM의 요오도 아세트 아미드, 소용돌이, 스핀에서 젤 큐브를 담가. 45 분 동안 어둠 속에서 실온에서 인큐베이션. 폐기 뜨는.
10. 25 mM의 NH ₄ HCO _3, 소용돌이, 스핀 큐브를 체험하고, 상층 액을 버린다.
11. 50 % 아세토 니트릴, 소용돌이, 스핀에서 25 mM의 NH ₄ HCO ₃ 조각을 담가. 3.9와 3.10를 반복합니다.
12. 진공 농축기에서 큐브를 건조. 25 mM의 NH ₄ HCO _3에서 25 ㎕의 서열 등급 수정 트립신을 추가, 30 분 동안 4 ° C에서 배양하고, 초과 솔루션을 폐기합니다. 트립신없이 25 mM의 NH ₄ HCO ₃ 큐브를 담그고, 하룻밤에 37 ° C를 품어.
13. 간단히 아래로 큐브를 회전 및 추가 생성 된 펩타이드를 전송새로운 튜브에 중부 표준시. 30 분, 스핀를 들어, 큐브에 50 % 아세토 니트릴 소용돌이를 5 % 포름산의 30 μl를 추가합니다. 추출물에 뜨는을 결합합니다. 이하의 5 μL을 진공 농축기와 펩티드 추출물을 건조.
14. LC-MS / MS 분석을 위해 질량 분석기 핵심 기능 샘플을 제출한다. 오픈 소스 소프트웨어에서 생성 할 수있는 MS 분석 데이터는 전형적으로 기탁 식별 된 각각의 단백질 번호 표지 / 비 표지 된 펩티드 및 식별 된 고유의 수를 포함한다.

4. 웨스턴 블로 팅 확인

참고 : 웨스턴 블롯은 질량 분석 결과를 확인하는 것이 좋습니다.

1. 표준 웨스턴 블로 팅 프로토콜에 따라로드되는 각 그룹에서 단백질의 동일한 금액을 보장합니다. MS에 의해 식별 관심의 단백질에 대한 항체 (예를 들어 넥신 A5, 젖산 탈수소 효소의 B 체인)를 사용합니다. 농도계의 analysi와 함께 웨스턴 블로 팅 검출,의, MS 단백질 식별 및 정량이 올바른지 재확인 할 수 있습니다.

5. 단백체 데이터 분석

참고 : 각 MS 복제에 대한 중요한 단백질 후보의 데이터 품질 평가, 데이터 전처리, 계산 및 결정은 개별적으로 수행됩니다. 상기 분석이 완료되면, 복제에서 분석 된 데이터를 ^{비교하고, (21) 20 (6)} 합성.

1. MS 데이터의 품질을 평가한다.
   1. 우선, SILAC-MS 스프레드 시트 프로그램 / 정량 단백질 표지 된 비 표지 변환 LOG2.
   2. 과학적 그래프 통계 소프트웨어 그룹의 비율이 40-100 빈들에 비하고 히스토그램을 생성하기 위해 빈 당 비의 수를 플롯. 히스토그램의 정규 분포는 MS 데이터 ^(6)의 좋은 품질을 나타냅니다. 모든 MS가 복제에 대해이 단계를 수행합니다.
2. MS는 펩티드의 비 신뢰성 및 정확성을 높이기 위해 2 개 미만 정량화 펩타이드가 단백질을 제거하는 것을 고려.
3. 크게 상향 및 하향 조절 단백질 후보를 결정하기 위해, 의미 ^(22)을 임계 값 계산하기 위해 다음 단계를 사용하십시오.
   1. 과학적 그래프 통계 소프트웨어, 도수 분포 데이터를 비선형 회귀 또는 곡선 맞춤을 생성한다. 이 단계는 컷오프 값을 계산하는데 사용될 수있는 값을 산출한다. 99 % 신뢰 한계에 대해 1.96, 95 % 신뢰 한계에 대한 σ 또는 2.56 σ ± 평균과 한계 값을 계산합니다.
      참고 : 컷오프를 계산의 구체적인 세부 사항은 Emmott 등의 알에서 찾을 수 있습니다. ^22.
   2. 중 중간 아래 (크게 과발현) 중간 위보다 1.96 (또는 2.56) 표준 편차 이하보다 1.96 (또는 2.56) 표준 편차 (누구의 비율 인 단백질 후보를 선택크게 아래의 발현).
4. 일관성을 달성하기 위해 상기 식별 된 중요한 후보의 복제를 비교한다. 그들은이 최종 선택 단계를 통과하기 위해 다음과 같은 기준을 충족하는지 확인하십시오 후보가 일관되게 모든 복제에서 확인되어야한다 그리고 후보의 복제가 규제 자신의 방향으로 일관성이 있어야합니다 (규제 상향 또는 하향 조정 바람직 후보의 3 복제 중 적어도 2 중이어야 함).
5. 그 복제의 데이터를 병합하여 상기 언급 된 기준을 충족 후보 데이터 확정.

6. 생물 정보학 확인 및 특성

참고 : 기존의 게놈 및 생물 정보학 정보는 거의 모든 단백질에 대한 풍부한 정보를 제공합니다. 정보에 대한 데이터 마이닝 및 생물 정보학 분석은 중요한 후보자의 재산과 기능에 대한 통찰력의 큰 거래를 확보에 도움이 될 수 있습니다. 이 proce을SS는 적절한 하류 습식 실험실 실험을 설계하는 것이 필요하다.

1. 자신의 GenBank 액 번호 또는 UniProt ID를, 현재의 엑소 좀 데이터베이스에 대해 후보자를 검색 (Exocarta ²³ Evpedia ^24)를 사용하여 후보 단백질 이전 엑소에서 발견되어 있는지 확인합니다. 이 단계는 후보 엑소 좀에 참으로 신뢰의 레이어를 추가합니다.
   1. 액세스 http://www.exocarta.org/는 "조회"입력하거나 유전자 또는 단백질 이름 / 가입 번호를 클릭합니다. 요약 페이지가 나타납니다와 엑소의 증거는 존재하는 경우 제공, 표시됩니다.
2. 에이즈-1과 인간 단백질 상호 작용 데이터베이스 ^(25)에 대한 후보를 검색 할 수 있습니다. 대안 적으로, 후보 단백질의 상호 작용 및 테스트 조건에 대한 정보를 제공 할 수있는 특정 데이터베이스를 검색.
   1. www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIV에서 데이터베이스에 액세스상호 작용. '단백질 도메인 이름'항목에서 후보자의 이름 또는 가입 번호를 입력하고 검색을 클릭합니다. 검색 결과는 HIV-1 단백질 후보들 간의 상호 작용에 대한 통찰력을 제공하고, 진정으로 HIV-1이 연관 될 수있는 후보들의 제안 할 수있다.
3. 오기 GenBank 등록 번호 또는 (예컨대 FunRich 기능적 보충 분석 도구 ⁽²⁶⁾⁾ GO 분석 소프트웨어로 후보 UniProt ID 및 소프트웨어를 실행.
   1. http://www.funrich.org/에서 소프트웨어를 다운로드합니다. 설치 후, 농축 분석에서, 클릭 "데이터 세트 추가"소프트웨어를 열고, 단백질 / 유전자의 목록을 업로드 할 수 있습니다. 다음으로, GO 분석을 시각화 할 수있는 차트 유형을 선택합니다.
      참고 : GO 분석 결과는 파이 차트의 형태로 가시화 될 것이다. 이 단계는 (생물학적 프로세스 (BP), 세포 구성 요소의 분야에서 후보자와 관련된 글로벌 통찰력을 얻을 C를 도움이C), 분자 기능 (MF).
4. 액세스 데이비드는 http://david.ncifcrf.gov/ ^27, 자사의 웹 사이트에 "기능 주석 도구"를 클릭합니다. , 예를 들면 "UniProt ID"로 유전자의 "식별자"를 선택, 후보 목록을 입력 "유전자 목록"및 검색을 선택합니다. 농축 GO 조건, P-값 및 다른 매개 변수는 "Gene_Ontology"카테고리에서 "주석 요약 결과"페이지를 클릭하여 확인할 수 있습니다.
5. 다른 단백질과 후보자의 잠재적 인 상호 작용을 조사하기 위해, 잠재적 인 단백질 - 단백질 상호 작용이 가능한 생화학 적 경로를 명료하게 공개적으로 액세스 할 수 STRING 데이터베이스 ^{(28)를 사용합니다.}
   주 : 분석 기능성 주석 (제 6.3-6.4)를 이동도 최신 STRING 소프트웨어를 사용하여 수행 될 수있다.
   1. http://string-db.org/에서 데이터베이스에 액세스 할 수 있습니다. 지정된 S에 입력 단백질 ID 또는 시퀀스earch 상자와 분석에 대한 올바른 종을 선택합니다. "검색"을 클릭합니다. 결과는 모두 직접 (물리적) 및 간접 (기능) 협회에 대한 정보를 제공합니다. exosomal 후보에 대한 상위 10 알려진 경기가 표시됩니다 상당한 후보 선택을 위해 고려되어야한다.
      주 : 후보와 관련된 많은 정보는 위의 단계를 사용하여 분석 될 수있다. 가장 중요한 후보 하류 분자 및 생화학 적 분석을 위해 선택 될 수있다.

결과

도 1a는 SILAC 라벨링 방법 ^{(21)을 개략적으로} 나타내는 흐름도이다. 엑소 좀을 정제하기 위해, 샘플은 원심 분리를 통해 스핀 다운되어야한다. 도 1b는 직렬 초 원심 분리하여 엑소 좀 ²¹ 정화 단계를 도시한다. 정제하면 절차에 설명 된 바와 같이, 엑소 좀 실험 단백체 분석 될 수 있습니다.

토론

이 논문에 기재된 절차에서는 호스트 exosomal 프로테옴에서 HIV-1 감염의 효과를 조사하기 SILAC 기술의 적용을 설명했다. 처음에 감염되지 않은 및 HIV-1에 감염된 세포는 차동 동위 원소 표지입니다. 차등 표지 엑소 좀은 단백질 추출을 수행하기 전에 정제된다. 다음에, 액체 크로마토 그래피 - 탠덤 질량 분석은 exosomal 프로테옴을 분석하기 위해 사용된다. 마지막으로, 생성 된 질량 분석 데이터 및 잠...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
H9 cell line	ATCC	HTB-176
Trypan Blue	Thermo Fisher	15250061
MTT assay kit	Thermo Fisher	V13154
Dialyzed fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher	26400044
SILAC Protein Quantitation Kit – RPMI 1640	Thermo Fisher	89982	DMEM version (89983)
L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC	Thermo Fisher	88434
L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC	Thermo Fisher	88431
HIV-1 NL4-3	NIH AIDS Reagent Program	2480
Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit	PerkinElmer	NEK050001KT
Refrigerated super-speed centrifuge	Eppendorf	22628045
Refrigerated ultracentrifuge	Beckman Coulter	363118	Should be able to reach 100,000 x g
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher	14-432-22
Ultracentrifuge Tubes	Beckman Coulter	326823
SW 32 Ti Rotor	Beckman Coulter	369694
RIPA buffer	Thermo Fisher	89900
Protease Inhibitor Cocktails	Thermo Fisher	78430
ThermoMixer	Eppendorf	5384000020
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher	23250
Spectrophotometer	Biorad	1702525
SDS PAGE Gel apparatus	Thermo Fisher	EI0001
Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels	Novex	XV04200PK20
Gel staining reagent	Sigma Aldrich	G1041
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5111
SpeedVac Concentrator	Thermo Fisher	SPD131DDA
Antibody to human annexin A5	Abcam	ab14196
Antibody to human lactate dehydrogenase B chain	Abcam	ab53292
Graphing and Statistical Software	Systat	SigmaPlot	Or GraphPad Prism
Quantitative proteomics software suite	Max Planck Institue of Biochemistry	Maxquant
Software and databases	Various vendors		Refer to main text for details