챔버의 coverglass 모델을 사용하여 바이오 필름 개발에 객담의 효과를 시각화

요약

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

초록

바이오 필름은 자체 분비 매트릭스으로 쌌다 박테리아의 그룹으로 구성되어 있습니다. 이들은 산업 오염뿐만 아니라 많은 건강 관련 감염 현상 및 지속성에 중요한 역할을한다. 인간의 질병에서 가장 잘 설명하고 연구 바이오 필름 중 하나는 낭포 성 섬유증 환자의 만성 폐 감염으로 발생합니다. 호스트의 컨텍스트에서 생물막을 연구 할 때, 여러 가지 요인이 바이오 필름 형성 및 발달에 영향을 미칠 수있다. 호스트 요인 생물막 형성 및 발달에 영향을 미칠 수있는 방법을 확인하기 위해, 우리는 객담 상청액의 형태로 숙주 - 유도 인자의 존재 생물막의 성장에 고정 커브 글라스 챔버 법을 이용했다. 박테리아는 챔버에 접종 및 객담 여과 액에 노출되어있다. 성장의 48 시간 이후, 생물막 전에 공 초점 현미경 및 분석에 상업 생물막 생존 키트로 염색된다. 이미지 획득 후, 바이오 필름 특성은 다른 소프트웨어 플랫폼을 사용하여 평가 될 수있다.이 방법은 우리가 항생제를 포함한 다양한 물질의 존재 생물막 성장의 주요 특성을 시각화 할 수 있습니다.

서문

세균 생물막은 서로에 부착되어 자기 분비 매트릭스 이탈되는 미생물의 기이다. ^1,2- 고전, 그들은 물리적 흐름 조건 하에서 형성된 비 생물 적 또는 생물학적 표면에 부착 된 세균을 나타낸다. 바이오 필름은 또한 테스트 튜브에 형성된 열 풀 또는 펠리클의 공기 - 액체 계면의 표면과 같은 정적 상태 (흐름의 유무) 및 말단부에서 증가하는 것으로 나타났다. 그들은의 생물 연료, 부식 및 막힘의 결과, 저수지 또는 파이프에 형성 할 수있는 이러한 바이오 필름은 오래, 산업 공정에 큰 손해를 환경으로 인식하고 있습니다되었습니다. ^3,4

그들은 카테터 관련된 감염, 낭포 성 섬유증 환자에서 폐 감염뿐만 아니라 수많은 다른 감염에 관여 된 바와 같이 바이오 필름은 또한 건강 관리 세팅에서 중요하다. 생물막 감염의 특징 중 ^5,6 하나는 드입니다항생제로 세균의 감수성을 주름과 선천성 면역 시스템에 의해 허가를 손상. 생물막 계 감염을 포함하는 ^7-9 가장 잘 연구, 임상 적 시나리오는 만성적 녹농균 생물막 감염된 낭포 성 섬유증 (CF), 환자에서 발생한다. 녹농균은 매우 어려운 치료를 할 수 있도록 만성 감염의 설립 동안 많은 변화를 겪을 수 있습니다. ^{10, 11} 바이오 필름은 차등 선천성 면역을 활성화하고 염증을 구동 할 수있다. 이러한 감염은 CF 환자에서 증가 된 이환율 및 사망률을 초래할 ^{12-14으로,이} 컨텍스트에서 생물막 발달에 영향을 미칠 수있는 요인을 이해하는 것이 중요하다.

최근의 연구는 호스트 요인 녹농균 생물막 집계의 형성에 중요 제안합니다. ^15이 바이오 필름은 항생제와 숙주 방어 메커니즘 감소 감수성에 기여한다. prese이러한 호중구 엘라 스타 제,뿐만 아니라, CF 폐에 존재하는 미생물로부터 분비 제품과 같은 숙주 유래 요인 NCE가 크게 생물막 형성 및 발달을 조절하는 잠재력을 가지고있다. ⁽¹⁶⁾ 또한, 바이오 필름은 다양한 경로의 발현을 조절하고 염증을 시작하는 호스트와 상호 작용합니다. 이러한 표준 크리스탈 바이올렛 분석 높은 처리량 방법, 생물막 공정에 관해서 몇 가지 정보를 제공 할 수 있지만, 이러한 요소에 대한 응답으로 바이오 필름의 시각화는보다 심층적 인 정보를 제공합니다.

이 논문에서는 체외 생물막의 개발 연구를 CF 환자의 객담에서 요소를 사용하는 방법을 설명한다. 이 방법은 상용 생물막 생존 키트를 사용 객담 함유 숙주 요인에 노출 생물막의 신속한 시각화 가능하다. 이 방법은 시각적 exogeno의 존재 생물막의 성장 중에 발생하는 변화를 식별하기 위해 사용될 수있다우리 제품 등 다양한 조건 하에서 생물막 개발의 변화를 분석하기위한 개선 된 방법을 나타낸다.

프로토콜

연구 윤리위원회 (REB)를 수집하고 인체에서 객담 샘플을 저장하는 데 필요합니다. 이 연구는 아픈 어린이 REB 번호 1000019444를 위해 병원에 의해 승인되었다.

1. 준비 CF 객담 샘플

1. 낭포 성 섬유증 클리닉에 일상적인 방문시 환자의 객담 샘플을 수집하고 얼음에 보관하십시오.
2. 처리를 받아야하는, 연구 실험실, 컬렉션의 첫 번째 시간 이내에 얼음에 객담 샘플을 전송.

2. 객담 처리

1. 얻어진 객담 시료의 양을 기록한다. 샘플 (즉, PBS 2 부 1 부 샘플)의 양을 2 배 인산염 완충 식염수 (PBS)를 추가한다.
2. 전송 피펫과 잘 샘플을 섞는다. 소용돌이 1 분 완전히 혼합하는 가장 높은 설정에 샘플.
3. 나누어지는 적절한 수의 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 상기 혼합물 1 ㎖ 및 5,000 XG에 스핀 다운4 ℃에서 20 분.
4. 원심 분리 후, 상청액을 제거하고 펠렛을 버린다.
5. 필터 0.22 μm의 필터를 통해 뜨는을 소독하고 깨끗한 microcentrifuge 관에 수집합니다.
   참고 : 여과 액의 무균는 LB 한천에 도금 및 액체 매체를 접종하여 시험한다.
6. 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 가래 뜨는을 저장합니다.
   참고 : 객담 여러 환자도 여과 다음 풀링 할 수 있습니다에서.
7. 객담 여과 액을 1/10 v / V를 원하는 미디어 (가래 100 ㎕, 미디어 900 μl를) 희석, 사용하기 전에.
   참고 : 여기에, 표준 원성 국물 (LB) 미디어가 사용되었다.

바이오 필름 형성 3. 챔버의 coverglass 방법

1. (200 rpm)으로 진탕 37 ° C에서 원하는 미디어에 대한 관심이 하룻밤의 세균 분리를 성장.
   주의 : 다른 박테리아의 수를 사용하여, 녹농균, 황색 포도상 구균이 임상 분리 포함부르크 홀데 리아의 cepacia의 복잡하고 아크 로모 박터의 아크 로모. 미디어의 선택은 그러나 LB 미디어가 초기 실험에 사용할 수있는 균주와 관심의 조건에 따라 달라집니다.
2. 밤새 배양 물로부터 신선한 미디어 4 ㎖ 중에 배양의 40 μl를 넣고 약 0.5 내지 600 nm의 (OD _{600)에서의} 광학 밀도를 갖는 배양을 얻었다 (200 RPM)를 흔들면서 37 ℃에서 3-4 시간 동안 성장 -0.6.
3. 10 % 객담 여과 또는 (제어 등) 객담 여과없이 원하는 미디어에서 1/5 단계 3.2에서 문화를 희석. 객담 여과 액의 다른 농도를 테스트 할 수 있습니다 (즉, 50 % 또는 100 %).
4. 슬라이드 챔버의 우물을 배정하는 것을 희석 200 μl를 사용합니다.
5. 박테리아가 흔들림없이 37 ° C에서 4 시간 동안 부착 할 수 있습니다.
6. 4 시간 후, 미디어를 제거하고 부드럽게 1 배 신선한 매체와 바이오 필름을 씻는다. 200 ㎕의 새로운 미디어로 교체하십시오.
   참고 : 생물막의 가래를 Fres의 효과를 연구시간 미디어는 객담 뜨는을 포함해야합니다.
7. 바이오 필름은 현미경을위한 시간이 될 때까지 세척하지 않고, 미디어마다 12 시간을 대체 흔들림없이 37 ° C에서의 시간 원하는 시간 동안 성장하도록 허용합니다.
   참고 : 생물막 항생제 감수성에 가래 상층 액의 효과를 연구하려면, 항생제는 생물막 성장의 24 시간을 다음과 같은 미디어에 추가되고 염색 및 바이오 필름의 영상까지 언론에 유지됩니다.

4. 염색 바이오 필름 및 공 초점 현미경

1. 원하는 성장 시간 (24 ~ 48 시간이 잘 작동)에 따라, 챔버 우물에서 미디어를 제거하고 부드럽게 멸균 PBS 300 μL로 두 번 각 챔버를 씻는다.
2. 필요한 솔루션의 각 ml의 대한 (생존 키트에 제공) 각 염료의 1 μl를 혼합하여 바이오 필름에 대한 염색 혼합물을 준비합니다. 물이나 미디어 솔루션에 염료를 확인합니다.
   참고 : 물은 제조업체가 권장된다.
3. 챔버 covergla의 각 웰에 염료 혼합물 200 μl를 추가SS 45 분간 어둠 속에서 실온에서 부화.
4. 실에서 염색 혼합물을 제거하고 멸균 PBS 300 μL 잘 각을 씻는다. PBS를 제거하고 신선한 물 또는 용지로 교체합니다.
5. 공 초점 현미경을 통해 바이오 필름의 시각화를 진행합니다.

5. 공 초점 현미경으로 바이오 필름을 시각화

1. 즉시 (1 시간 이내) 염색 후 챔버 스테인드 생물막을 읽어보십시오. 한 번에 2 ~ 8 잘 챔버에 1을 염색하여 슬라이드의 시각화 지연을 최소화합니다.
2. 인수 여기 및 필터 세트의 레이저와 공 초점 현미경을 사용하여 이미지를 수행합니다.
   참고 : 여기에, 스펙트럼 얼리스 레이저와 함께 회전하는 디스크 공 촛점 시스템 (녹색 : 491nm, 적색 : 561 nm의) 여기에 사용 하였다. 40분의 515 및 40분의 624의 배출 필터 세트는 생물막 생존 키트에서 얼룩을 시각화하는 데 사용되었다.
3. 카메라와 공 초점 현미경에 25X 물 목표를 사용하여 이미지를 가져 가라.
사용 Z-스택은 바이오 필름을 모델링합니다. 모든 0.5 μm의는 생물막의 마지막에 초점 프레임에 첫 번째에 초점 비행기에서 시작하는 이미지를 가지고 (일반적으로 30 ~ 80 μm의 48 시간의 바이오 필름에 걸친)
4. 각 우물에서 3-5 이미지를 가져 가라.
   참고 : 따라서 8 잘 챔버의 coverglass를 들어, 24-40 이미지가 생성됩니다.
5. 분석을 위해 이미지를 저장합니다.
   참고 : OME-TIFF 파일이 COMSTAT ^{(18, 19)를} 사용하여 분석로서 이미지를 저장해야합니다. 생물막 이미지 분석에 대한 지침은 http://www.comstat.dk/에서 찾을 수 있습니다. 이미지가 수입되면, 이러한 각각의 채널 (빨강 및 녹색)의 평균 두께, 바이오 매스 및 표면 범위 등의 매개 변수를 분석 할 수 있습니다.

결과

실험의 전반적인 디자인은도 1에 표시된다. 이 프로토콜의 사용은 다양한 기간 (예, 24, 48 또는 72 시간) 동안 성장 생물막의 변화를 시각화하기위한 편리한 방법을 제공한다. 중요한 것은 이러한 객담 여액 같은 외인성 신호 생물막 개발의 변화를 시각적으로 첨가 할 수있다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 10 % 객담 여액의 존재는 생물막의 구조 ...

토론

본원에 기재된 방법은 외인성 제품의 존재 하에서 성장 세균 생물막의 시각화를 허용. 이러한 유형의 시스템을 사용하지 않을 때는 놀랍게도, exoproducts의 생산은 중요하다. 예를 들어, 디티 오 트레이 톨 (DTT)는 종종 샘플을 액화하기 위해 인간의 객담 샘플에 사용됩니다. 그러나, 단독 DTT의 효과 생물막 개발 가능성을 감소시킬 수있다 (데이터는 보이지 않음). 따라서, 모든 조건에 대한 적절한 통?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well	Thermo Sicher Scientific	155409
Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit	Thermo Fisher Scientific	L10316
Blood agar plates	Thermo Fisher Scientific	R10215	Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation
COMSTAT	Availble software online		COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk
Millers LB Broth	Thermo Fisher Scientific	12780-052	Standard media for overnight gowth/biofilm growth
Millex-GV Syringe Filters	Millipore	SLGV013SL	Filtering of sputum supernants
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)	Oxoid	BR0014G	Washing of biofilm chambers after media removal
Zeiss AxioVert 200M	Carl Zeiss
Hamamatsu C9100-13 EM-CCD	QS Technologies Inc.
Spectral Borealis	Qs Technologies Inc.
Perkin Elmer Volocity	QS Technologies Inc.		Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf