바이오 필름 제거 질소 제거하지 않고 이산화탄소 에어로졸을 사용하여

요약

Biofilms on surfaces can be effectively and rapidly removed by using a periodic jet of carbon dioxide aerosols without a nitrogen purge.

초록

Biofilms can cause serious concerns in many applications. Not only can they cause economic losses, but they can also present a public health hazard. Therefore, it is highly desirable to remove biofilms from surfaces. Many studies on CO₂ aerosol cleaning have employed nitrogen purges to increase biofilm removal efficiency by reducing the moisture condensation generated during the cleaning. However, in this study, periodic jets of CO₂ aerosols without nitrogen purges were used to remove Pseudomonas putida biofilms from polished stainless steel surfaces. CO₂ aerosols are mixtures of solid and gaseous CO₂ and are generated when high-pressure CO₂ gas is adiabatically expanded through a nozzle. These high-speed aerosols were applied to a biofilm that had been grown for 24 hr. The removal efficiency ranged from 90.36% to 98.29% and was evaluated by measuring the fluorescence intensity of the biofilm as the treatment time was varied from 16 sec to 88 sec. We also performed experiments to compare the removal efficiencies with and without nitrogen purges; the measured biofilm removal efficiencies were not significantly different from each other (t-test, p > 0.55). Therefore, this technique can be used to clean various bio-contaminated surfaces within one minute.

서문

Biofilms are complex bacterial community structures in which bacterial cells are embedded within self-produced matrices of extracellular polymeric substances, held together, and protected from the external environment. Biofilms can present a public health risk and cause economic losses because they can form on various surfaces, including medical implant materials and devices, food processing equipment, and heat exchangers. In fact, biofilms have been found to be associated with 65% of all bacterial infectious diseases in humans, according to the Centers for Disease Control and Prevention¹.

Autoclaves and disinfectants such as chlorine have generally been used for the inactivation of biofilms. However, the use of an autoclave is limited for surfaces that can neither withstand high temperature steam nor be placed into the autoclave. Disinfectants are not suitable for surfaces sensitive to chemical treatment or prone to collecting toxic oxidation products². In addition, the biofilm should not only be inactivated, but also removed in order to prevent the attachment of new cells onto the surface, thereby forming a new biofilm³. However, it is difficult to remove biofilms using methods based on viscous fluid shear because the flow velocity near the surface is almost zero and the shear force usually cannot overcome the adhesive forces of micron- and submicron-sized substances. Moreover, the biofilm matrix is known to act as a physical and chemical barrier¹.

Many physical and mechanical techniques have been developed to remove biofilms from surfaces, including ultrasonic vibration¹, electric currents⁴, laser irradiation⁵, and high-pressure water sprays⁶. Each technique has its own pros and cons. Ultrasonic vibration and electric current can be used to control biofilm formation; however, they require a particular configuration and conductive surfaces, respectively, requiring additional shear stress^{1, 4}. Laser irradiation can be applied to a limited area and to hard surfaces; however, some live and dead cells remain on the surface⁵. High-pressure water sprays effectively remove biofilms; however, their high momentum can cause damage to soft substrates⁶.

Biofilm removal using CO₂ aerosols has been previously proposed. It has shown promising results, with high removal efficiencies within a short time^7-11. CO₂ aerosols are generated by adiabatic expansion of a high-pressure CO₂ gas through a nozzle, and they are applied to the surfaces contaminated with a biofilm. This cleaning technique utilizes the momentum transfer of solid CO₂ particles and the solvent action of the melted CO₂ liquids, followed by the aerodynamic shear force of the CO₂ gas¹². Compared with high-pressure N₂ gas jets, CO₂ aerosol jets at the same stagnation pressure are much more effective in removing E. coli biofilms⁷. Moreover, although the momentum of the solid CO₂ that is delivered to the bacteria is considerably high, the momentum of the total aerosol jet applied to the solid surface is substantially lower than that of water jets. Therefore, damage-free cleaning is possible using this CO₂ aerosol technique.

In this protocol, periodic jets of CO₂ aerosols without nitrogen purges were used to remove Pseudomonas putida biofilms from a polished stainless steel surface. In fact, nitrogen purges have been used in many CO₂ aerosol studies to increase the removal efficiency by reducing the moisture condensation generated during the cleaning, even though heating with a hot plate or infrared lamps and employing dry boxes have also been adopted¹². The surface biofilm formation and the optimized cleaning procedures are described below. The removal efficiency was evaluated by measuring the fluorescence intensity of the biofilm on the surface.

프로토콜

바이오 필름 형성을위한 표면의 1. 준비

1. 기계적 커터 칩으로 304 1 mm 두께의 스테인레스 판 (10 × 10 mm ^2)를 잘라.
2. 10 분 각각 아세톤, 메탄올, 탈 (DI) 물 순차적 칩의 초음파 세척을 수행합니다. 유기 오염 물질을 제거하고, 유리와 같은 물질로 이루어진 제성 컨테이너를 사용한다.
3. 3-5 초 동안 DI 물 흐르는 칩을 헹군다.
4. 3-5 초 동안 N ₂ 가스 흐름을 이용하여 칩을 건조.

세균성 문화의 2. 준비

1. P.를 타고 -80 ° C 깊은 냉동고에 저장 재고 (친절 교수 성 동국 리, UNIST, 한국에서 제공) 푸티 다 KT2440.
2. 1 분 후 상온에서 해동 한 동결 스톡 용액의 상층에 슬러시집니다. 원액의 용융 층으로 루프를 담근다.
3. 루리아에 행진에 세균이 루프를 사용하여1.5 % 한천을 포함 -Bertani (LB) 플레이트.
4. 박테리아 식민지 성장을 30 ℃에서 하룻밤 접시를 품어.
5. 새로운 루프를 사용하여 플레이트에서 하나의 식민지를 선택합니다.
6. 단일 박테리아 콜로니를 함유하는 루프와 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 LB 배지 10 ㎖를 접종한다.
7. 30 ° C에서 16 시간 160 RPM의 진탕 배양기에서 국물을 품어.

표면에 3 biofilm 형성

1. 각 칩의 표면을 살균, 1-2 초마다 5 회 핀셋 제조 된 칩의 각각을 픽업 70 % 에탄올에 담갔다. 칩이 침지시 핀셋으로 개최되어 있는지 확인합니다.
2. 남아있는 에탄올을 제거 멸균 된 DI 물과 LB 배지 순차적으로 각 칩, 1 ~ 2 초마다 5 번 찍어.
3. 이 칩과 잘 당 5 ml의 LB 배지로 6 웰 배양 판에이 칩을 놓습니다.
4. LB 배지에 도달의 농도까지 박테리아 문화를 희석8 × ¹⁰⁸ 세포 / ㎖ (파장 600nm에서의 광학 밀도 : 0.8 ~).
5. 희석 세균 배양의 50 μl를 잘 각각 접종.
6. 바이오 필름의 형성을위한 24 시간 동안 흔들림없이 30 ° C에서 접시를 품어.

4. CO ₂ 에어로졸 청소

1. 10 mM의 초산 암모늄 버퍼에 바이오 필름 형성 칩을 찍어 (휘발성) 5 회 느슨하게 부착 플랑크톤 박테리아를 제거합니다.
2. 공기가 온화하게 흐르는 바이오 안전성 캐비닛에이 칩을 건조시킵니다.
3. 건조 직후, 제트의 축선을 따라 CO ₂ 노즐로부터 20mm 인로드 위치에 칩을 배치했다. 40 ° 각도로 분사 축을 기울입니다.
4. 가스 압력 조절기를 사용하여, 각각 5.3 MPa의 0.7 MPa의에 CO _2와 N ₂ 가스의 정체 압력을 설정합니다.
5. 칩의 중앙 부분에 에어로졸 젯을 적용합니다. _(2)해야 고체 CO 포함 화이트 에어로졸볼 수 있습니다. 5 초 동안 CO _2의 솔레노이드 밸브 "의"를 켠 다음 3 초 동안 "OFF"전원을 켜 : 주기적으로 수동으로 제어 스위치를 사용하여 (사이클 8 초). 질소 퍼지를 이용해야하는 경우, N _(2)의 연속 공급을위한 솔레노이드 밸브를 켜.
6. 16, 40 CO ₂ 에어로졸을 칩을 치료하고와 질소 퍼지없이 88 초. 음성 대조군으로 처리없이 칩을 유지합니다.

제거 효율 5. 분석

1. 제어 및 에어로졸 처리 칩 세균 세포를 염색하기 위해 DI 물 : 1 μM 녹색 형광 핵산 얼룩 (500분의 480 nm의 여기 / 방출 파장)을 준비한다.
2. 염색 용액에 칩을 놓습니다.
3. 30 분 동안 37 ° C에서 빛이없는 배양기에서 배양 한 칩.
4. 배양 후, 부드럽게 과도한 형광 색소를 제거하는 DI 워터를 흐르는 칩을 헹군다.
5. 칩 위스콘신을 건조제 N ₂ 가스 흐름.
6. 표면 형광 현미경하는 40X 대물 렌즈와 CCD 카메라를 사용하여 각각의 칩에 대한보기의 5 랜덤 필드 (321 × 240 μm의 ^2)의 현미경 이미지를 형광 가져 가라.
7. 이러한 ImageJ에 같은 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 각 이미지에 대한 형광 강도를 얻었다. ImageJ에에서 "프로세스"메뉴에서 "빼기 배경"기능을 사용하고 "분석"메뉴의 "설정 측정"창에서 "통합 밀도"를 선택합니다. 형광 강도를 얻기 위해 "분석"메뉴에서 "측정"을 수행.
8. 다음 식에 따라 생물막 제거 효율을 계산한다 : 100 % × (제어 칩 I를 - 처리 칩 Ⅰ) / I 계산 된 형광 강도이다 (제어 칩 I).
9. 제거 효율과 표준 편차 평균을 구합니다. 에 사용각각의 경우에 대해 최소 4 칩입니다.

결과

CO ₂ 에어로졸은 P.을 제거하는 데 사용 된 푸티은 SUS304 표면 (그림 1)에서 생물막. 표면의 대부분은 성장의 24 시간 후, 바이오 필름으로 덮여 있었다. 생물막의 대부분은 CO ₂ 에어로졸 (도 2)를 이용하여 제거 하였다. 예상대로,도 3은 증가 CO ₂ 에어로졸 처리 시간 등의 생물막 제거 효율의 증가를 나타낸다. 88 초의 처리 시?...

토론

Previously, we conducted optimization studies on CO₂ gas pressure, jet angle, and distance to the solid surface in CO₂ aerosol cleaning⁷. Unlike our previous studies, in the present study, a nitrogen purge was not included in the aerosol (Figure 1). Moreover, 304 stainless steel was used in this protocol, since it is one of the most common stainless steels and is widely used in the food industry. The polished surface is beneficial for fluorescence analysis because of a un...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
304 stainless steel	Steelni (South Korea)		Polished and diced ones
Ultrasonic cleaner	Branson (USA)	5510E-DTH
Luria-Bertani (LB)	Becton, Dickinson and Company (USA)	244620	500 g
Agar	Becton, Dickinson and Company (USA)	214010	500 g
6-well culture plate	SPL Life Sciences (South Korea)	32006
Ammonium acetate buffer	Sigma-Aldrich (USA)	667404	10 mM
Dual gas unit	Applied Surface Technologies (USA)	K6-10DG	One nozzle for CO2 gas & 8 nozzles for N2 gas
SYTO9	Thermo Fissher Scientific (USA)	Invitrogen	Excitaion: 480 nm Emission: 500 nm
Epifluorescence microscope	Nikon (Japan)	Eclipse 80i
40X objective lens	Nikon (Japan)	Plan Fluor	NA: 0.75
CCD camera	Photometrics (USA)	Cool SNAP HQ2	Monochrome