정맥 삽입 위치 모델 : 바이 패스 이식 개통을 연구하기위한 적절한 모델

요약

This video demonstrates a model to study the development of myointimal hyperplasia after venous interposition surgery in rats.

초록

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. Research models for bypass graft failure are essential for a better understanding of pathobiological and pathophysiological processes during graft patency loss. Large animal models, such as pigs or sheep, resemble human anatomical structures but require special facilities and equipment. This video describes a rat vein interposition model to investigate vein graft patency loss. Rats are inexpensive and easy to handle. Compared to mouse models, the convenient size of rats permits better operability and enables a sufficient amount of material to be obtained for further diverse analysis. In brief, the inferior epigastric vein of a donor rat is harvested and used to replace a segment of the femoral artery. Anastomosis is conducted via single stitches and sealed with fibrin glue. Graft patency can be monitored non-invasively using duplex sonography. Myointimal hyperplasia, which is the main cause for graft patency loss, develops progressively over time and can be calculated from histological cross sections.

서문

관상 동맥 질환과 그 합병증은 전세계 사망의 주요 원인 중입니다. 현재 치료 전략을 재 확립 혈류에 어느 좁아진 혈관을 확장시키고 또는 바이 패스를 작성하여 초점. 정맥자가 이식을 이용하여 관상 동맥 우회술 (CABG) 먼저 1968 년에 설명하고, 수년에 걸쳐 정제하고있다. 외에도 왼쪽 전방의 재관류는 관상 동맥을 내림차순에서, 복재 정맥 도관은 가장 일반적으로 ^1을 사용합니다. 그러나, 이식 개통은 복재 정맥 이식 (SVG)의 약점 남아있다. 한 해 수술 후 이식 개통은 십년 ^2,3 후 61 %로 떨어지고, 85 %이다. SVG 개통 손실의 병태 생리 학적 기전과 원인을 공개하는 것은 그러므로 중요한 작업입니다.

이 동영상은 정맥 이식편 손실을 조사하기 위해 쥐의 정맥 개재 모델을 보여줍니다. 이 방법의 전반적인 목표는 기본 병인 학적 탐구한다및 질병의 진행 동안 -physiological 과정은 약물이나 치료 옵션 테스트에 적합한 모델을 개발한다. 동맥 시스템으로 표면 상복부 정맥 이식함으로써,이 모델은 밀접하게 관상 동맥 우회술의 임상을 모방. 외과 외상, 허혈, 벽 스트레스는 병적 인 혈관 변화의 중요한 트리거하고 설명하는 모델을 모방하고 있습니다.

다른 모델과 종은 정맥 이식편 개통 손실을 조사 할 수 있습니다. 이러한 돼지 ^4, 양 ⁵ 개 ^(6), 원숭이 ^(7)과 같은 대형 동물 모델은 인간의 용기와 해부학 적 구조와 유사하므로 ^팔을 테스트 할 이러한 바이 패스 스텐트 삽입하거나 새로운 수술 기법과 같은 복잡한 치료 전략을, 수 있습니다. 그러나, 특수 하우징, 장비 및 인력이 필요합니다. 또한, 고비용 및 수술 중에 마취 추가의 필요성은 광범위한 응용을 방해. SM래트를 포함한 모든 동물은 특수 하우징을 필요로하지 않으며, 취급이 용이하며, 관리 비용을 갖는다. 마우스 모델 ^9,10-에 비해 래트 모델 결과의 더 조작성을 이용하므로 적은 변동을 가지고있다. 쥐 생리 학적 및 유전 마우스 ^{(11, 12)보다} 인체에 더 유사하다. 또한 대부분의 야생형 마우스는 II 에러를 입력하는 경향이 마우스 모델을 한정 myointima ¹³ 개발한다. 예 하대 정맥 등 주요 마우스 정맥의 조직학은 단지 몇 세포 층으로 구성되어 있으며, 초기 평가 어려운 ^{(13)를 렌더링합니다.} 다른 단점은 그래프트 복구 후 후속 분석 가능한 조직의 작은 양이다.

동영상에서 설명한 모델 수행 재현성 저렴하고, 용이하고, 신속하고 확실하게 설정할 수있다. 이 같은 바이러스 벡터와 같은 고가의 실험 치료제를 평가에 특히 적합경제적 인 방식으로 유전자 치료를위한.

프로토콜

동물 실험 동물의 원리, 실험 동물 자원 연구소에 의해 제조 및 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의해 출판에 대한 가이드를 준수 인도적인 치료를 받았다. 모든 동물 프로토콜은 책임있는 지방 자치 단체 ( "AMT 사의 대 아퍼 싶게 Verbraucherschutz, Hansestadt (보건 및 소비자 보호를위한 사무실) 함부르크")에 의해 승인되었다.

1. 동물 관리

1. 실험 동물 연구소에서 300-350g 무게 루이스 쥐 (LEW / CRL) 쥐와 ROSA / 루시 페라 - LEW 형질 전환 쥐를 얻습니다.
2. 통풍 캐비닛에 기존의 조건에서 쥐를 유지하고 그들에게 표준 쥐 차우와 멸균 임의 량의 물을 공급.
3. 기증자와받는 사람과 syngenic LEW / CRL 쥐와 ROSA / 루시 페라 - LEW 형질 전환 쥐를 사용하여 이식 이식을 수행합니다.

기증자 쥐 2. 준비

1. 입회를 사용하여이온 챔버는 이소 플루 란 (2.5-3 %)와 쥐를 마취시키다합니다.
2. 그 뒷면에있는 쥐를 놓고 입과 코를 커버하는 안면 마스크로 마취를 유지한다. 뒷다리 다리를 곤란과 반사의 부재를 확인하여 마취의 충분한 깊이를 확인합니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 일부 수의사 연고를 적용합니다.
3. 뒷다리를 확산하고 테이프를 사용하여 자신의 위치를 ​​고정.
4. 헤어 트리머 사타구니 모발을 면도하고, 80 % 에탄올을 다음 포비돈 요오드를 사용하여 전체 영역을 소독. 두 번 소독 단계를 반복합니다.
   참고 : 외과 영역, 거즈, 및 수술 도구를 소독해야한다. 절차를 통해 멸균 필드를 유지하고 단일 사용, 무균 수술 장갑, 마스크와 모자를 착용하십시오.
5. 현미경 하에서, 원격 교육의 inguinalis을 따라 수직 절개를 수행합니다. 부드럽게 피하 조직을 분리하는 두 개의 집게를 사용하고 오라에서 표면 상복부 정맥을 노출대퇴 정맥에 진. 조심스럽게 주위 조직에서 피상적 인 상복부 정맥을 격리 할 것.
6. 이 마이크로 클램프를 사용하여 표면 상복부의 정맥에서 혈액의 흐름을 중지합니다.
7. 조심스럽게 집게로 분리 된 정맥을 올리고 microscissors과 용기를 절단하여 정맥의 약 0.5 ~ 1 cm 세그먼트를 수확. 혈액의 손실을 방지하기 위해 용기 밑둥 마이크로 클램프를 떠난다. 멸균 거즈에 정맥의 제거 조각을 놓습니다. 조심스럽게 수확 정맥의 일단 내부에 30 G 바늘을 배치하고 헤파린과 용기 (50 단위 / ml)로 세척하십시오.
   참고 :주의 정맥을 처리 및 리프팅, 절단 및 세척시 손상을 방지. 헤파린의 적절한 양의 이식을 세척해야합니다.
8. 받는 사람 쥐에 이식 혈관 경련을 방지하기 위해 때까지 얼음에 1 % 리도카인에서 선박 세그먼트를 유지합니다.
9. 5 % 이소 플루 란으로 마취를 증가시킴으로써 도너 래트를 안락사. 2 ~ 3 분, 연산 후원격 교육 알바 따라 복부 욕실, 다이어프램을 극복하고, 혈액 순환을 중지 마음을 제거합니다.

받는 사람 쥐 3. 준비

1. 마취 및 공여 쥐와 같은 방법으로 수신자 쥐를 고정한다.
2. 헤어 트리머 다리의 내측부를 면도 포비돈 요오드 및 80 % 에탄올을 3 회 소독.
3. 마취 깊이를 모니터링하고 뒷다리 곤란 때 반사의 유무를 확인하여 충분하다는 것을 보장한다.
4. 사타구니 배에 무릎에서 평균 대퇴부 절개를 수행합니다. 현미경으로, 그 주변에서 대퇴 동맥을 분리하는 2 집게를 사용합니다.
5. 혈액의 흐름을 중지 마이크로 클램프를 사용합니다. 말초 클램프 다음 먼저 근위 클램프를 놓습니다.
6. microscissors와 클램프 대퇴 동맥의 짧은 세그먼트를 잘라 그것을 폐기합니다. 인 차이를 만들어 microscissors와 나머지 동맥 루터 단축정맥 이식편보다 큰 1-2mm. 30 G 바늘을 사용하여 헤파린과 동맥 그루터기를 플래시합니다.
   참고 : 외막 약간 용기 밑둥을 넘어 돌출하는 경우, 용기의 말을 통해 살짝 당겨 조각을 제거하기 위해 집게를 사용합니다.
7. 동맥 젊고 아름다운 여자 사이의 단계 2.8에서 수확 정맥을 놓고는 간극에 적절하게 맞도록 길이를 조정합니다. 정맥의 방향을합니다.
8. 먼저 10-0 prolene의 봉합을 사용하여 근위 문합을 수행합니다. (그림 1D) 표시된 순서대로 하나의 스티치를 실시한다. 복부 측면에 3 개의 봉합을 추가하기 전에 각 측면에 봉합 시작합니다. 그 후, 문합을 완료하기 위해 용기의 지느러미 편에서 3 바늘을 배치합니다.
9. 단계 3.8에 기재된 근위 문합과 동일한 기술을 사용하여 그래프트 원위 혈관을 연결한다. 또, 각 측면에 봉합사로 시작하고 복부 SID 세 봉합 배치전자와 지느러미 쪽.
10. 피브린 접착제 성분 1, 2와 부하이 1 ML의 주사기를 조심스럽게 집게로 이식을 들어 올려 구성 요소 (2) 다음, 이식에서 피브린 접착제 성분 1의 약 100 μl를 놓습니다.
    주 : 1의 비율 : 구성 요소 1과 2는 1에 적용되어 있는지 확인합니다.
11. 다시 위치에 이식을 놓고 이식의 상단에 구성 요소 1과 2의 추가 100 μl를 놓습니다. 접착제는 이식 및 문합 부전과 정맥 이식편의 과도한 팽창을 방지하기 위해 문합을 모두 다루고 있는지 확인하십시오.
12. 조심스럽게 근위 다음에 말초 클램프를 엽니 다.
13. 이식 된 정맥 이식편의 말초 동맥에서 볼 수 펄스를 확인하여 성공적인 수술을 확인합니다.
14. 피부 폐쇄를 방해하는 과도한 접착제를 제거합니다. 경화 접착제를 들어 올려 microscissors와 과잉을 제거하기 위해 집게를 사용합니다. 5-0 prolene의 봉합으로 피부 층을 닫습니다.
15. 4-5m를 주입g / kg 카프로 펜 피하 쥐가 일어나 허용하기 전에. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오. 완전히 복구 될 때까지 하나의 새장에 동물을 유지합니다.
16. 다음 3 일간 진통제로 마시는 물 (100 ㎖ 당 50 mg의 설피 린)에 설피 린을 추가하고 매일 동물을 모니터링 할 수 있습니다.

4. 이중 초음파 검사

참고 : 사용 duxplex 초음파 쥐 ^(14)에 비 침습적 혈액의 흐름을 시각화합니다.

1. 유도 챔버 (이소 플루 란 2 %)에서 쥐를 마취. 그 뒷면에있는 쥐를 놓고 코를 덮는 보호구로 마취를 유지한다.
2. 허벅지의 지역 주위에 머리를 제거하기 위해 헤어 가위 헤어 제거 크림을 사용합니다.
3. 허벅지에 초음파 젤을 적용합니다. 기포가 없는지 확인합니다. 석사 400 변환기를 사용하여 이중 초음파 영상을 획득 (중심 주파수 : 30 M/ 초 230-400 프레임의 프레임 레이트와 Hz에서).

5. 조직 병리학

참고 : 수확이 형태 계측 학적 분석 ¹⁵ 메이슨의 트리 크롬 염색과 용기를 얼룩합니다.

1. 하룻밤 동안 4 % 파라 포름 알데히드에서 수거 용기를 고정하고 에탄올 농도 증가에 탈수. 파라핀의 샘플을 포함하고 마이크로톰을 사용하여 5 μm의 두께 조각으로 잘라.
   참고 : 파라 포름 알데히드는 독성이 특별한주의하여 취급해야합니다.
2. 트리 크롬 염색 용액을 염색하기 전에 슬라이드 Deparaffinize. , 스테인드 슬라이드를 탈수 자일 렌 그들을 취소 한 매체를 장착 그들을 탑재합니다. 슬라이드를 건조시킨 후, 현미경으로 샘플을 볼 수 있습니다.

6. 생물 발광 영상 (BLI)

참고 : 수술 후 이식은 생물 발광 신호 ^1을 측정하여 생체 내에서 시간이 지남에 따라 추적했다6.

1. PBS 22 ㎖에 D-루시페린 칼륨 염 1 g을 용해시키고 복강 래트 (375 ㎎ / ㎏ 체중)에 주입. 루시페린이 동물에서 순환하는 15 분을 기다립니다.
2. 실시간 생물 발광 정량화 시스템으로 쥐를 놓고 생물 발광 신호를 액세스 할 수 있습니다.

결과

쥐의 정맥 개재 모델은 myointima 증식 및 혈관 이식 실패의 개발을 연구하기에 적합합니다. 동물 수술에서 잘 회복하고 우수한 신체 조건 포스트 동작을 보여줍니다. 그림 1은 키 수술 단계를 보여줍니다. 원격 교육의 inguinalis을 따라 피부를 절개 한 후, 상복부 표면 정맥과 대퇴 동맥 (그림 1A)를 식별된다. 이 초기 이식 실패 및 개통 손실을 초래할 수있는 이식의 수확은 이?...

토론

이 동영상은 정맥 이식편 손실을 조사 및 기본 병리학 적 과정의 탐사 및 새로운 약물이나 치료 옵션의 테스트를 위해 허용하는 쥐의 정맥 개재 모델을 보여줍니다.

마취는 수술 절차의 중요한 측면이다. 이것은 특히 장시간 작업 중에, 안전하고 쉬운 방법으로 연속 inhalative 마취 시스템은 좋습니다. 이 동작은 이상 1 시간 소요 트레이닝 단계 동안 매우 중요 할 수있다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat LEW/Crl	Charles River	Stock number 004
Rat LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor- 1 luc)11Jmsk	Institute of laboratory animals, Kyoto University, Japan	NBPR rat number 0299	http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/
PFA 4%	Electron Microscopy Sciences	#157135S	20%
hair clipper	WAHL	8786-451A ARCO SE
Forene	AbbVie	PZN 10182054 Art.Nr.: B506	Isoflurane
microsurgical clamp	Fine Science Tools	18055-04	Micro-Serrefine - 4 mm
clamp applicator	Fine Science Tools	18056-14
hair removal creme	Rufin cosmetic	27618
Povidone-Iodine	Betadine Purdue Pharma	NDC:67618-152
10-0 Ethilon suture	Ethicon	2814G
5-0 prolene suture	Ethicon	EH7229H
Rimadyl	Pfizer	400684.00.00	Carprofen
Novaminsulfon	Ratiopharm	PZN 03530402	Metamizole
Heparin	Rotexmedica	PZN: 3862340	25.000 I.E./ ml
Xylocain 1%	AstraZeneca	PZN: 1137907	Lidocain
EVICEL	J&J Med.Ethicon Biosur	PZN 7349697 Art. Nr.:EVK01DE	fibrin glue
NaCl 0.9%	B.Braun	PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160
Vevo 770 high-resolution in vivo micro-imaging system	VisualSonics		duplex sonography
Ecogel 100 ultrasound gel	Eco-med	30GB
D-Luciferin Firefly, potassium salt	Biosynth	L-8220
PBS pH 7.4	Gibco	10010023
Xenogen Ivis 200	Perkin Elmer		bioluminescence imaging
Weigerts iron hematoxylin Kit	Merck	1.15973.0002	Trichrome staining
Resorcine-Fuchsine Weigert	Waldeck	2.00E-30	Trichrome staining
Acid Fuchsin	Sigma-Aldrich	F8129-25G	Trichrome staining
Ponceau S solution	Serva Electrophoresis	33427	Trichrome staining
Azophloxin	Waldeck	1B-103	Trichrome staining
Molybdatophosphoric acid hydrate	Merck	1.00532.0100	Trichrome staining
Orange G	Waldeck	1B-221	Trichrome staining
Light Green SF	Waldeck	1B-211	Trichrome staining
Vitro-Clud	Langenbrinck	04-0001
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	537020
37% HCl	Sigma-Aldrich	H1758
Xylene	Th. Geyer	3410
Paraffin	Leica biosystems	REF 39602004
Ethanol absolute	Th. Geyer	2246
Ethanol 96%	Th. Geyer	2295
Ethanol 70%	Th. Geyer	2270
Slide Rack	Ted Pella	21057
Staining dish	Ted Pella	21075
Bepanthen Eye and Nose ointment	Bayer	1578675	Eye ointment