약물 치료와<em&gt; 생체</em&gt;은 메다카 물고기 골다공증 모델에서 조골 파골 세포 상호 작용의 영상

요약

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

초록

조골 세포는 골 기질의 회전율을 조정 뼈 재 흡수 파골 세포 상호 작용 및 골 항상성을 제어하는 ​​뼈 형성. 메다카 및 지브라 피쉬 유충 널리 골 형성, 변성 및 수리 동안 골 세포의 행동을 분석하는데 사용된다. 그들의 광학 선명도는 형광 표지 된 뼈 세포와 광물 골격 매트릭스에 결합 된 형광 염료의 시각화 할 수 있습니다. 우리 연구소는 열 충격 유도 성 프로모터의 제어하에 파골 세포 유도 인자 핵 인자 κB 리간드 (RANKL)의 수용체 활성제을 표현 형질 전환 메다카 물고기를 생성했습니다. 카 텝신 K (ctsk) 프로모터의 제어하에 nlGFP 식으로 기자 라인으로 시각화 할 수 있습니다 활성화 된 파골 세포의 과잉 형성 RANKL 결과 자궁외 식입니다. RANKL 유도 및 자궁외 파골 세포 형성이 심한 골다공증과 같은 표현형으로 이어집니다. 복합 형질 전환 메다카 리NES ctsk 표현은 : nlGFP 조기 골아 세포의 osterix (OSX) 프로모터의 제어 하에서 파골 세포뿐만 아니라 mCherry, 두 세포 유형의 상호 작용을 연구하는데 사용될 수있다. 이것은 뼈의 퇴행 및 수리 조건 하에서 세포 행동의 생체의 관찰을 용이하게한다. 여기서, 우리는 일반적으로 인간의 골다공증 치료에 사용되는 약물을 시험하는 라이브 영상을위한 프로토콜을 기술하기 위해이 시스템의 사용을 설명한다. 메다카 모델 세포 배양 및 마우스에서 연구를 보완하고, 골격계 약물 작용의 생체 내 분석을위한 신규 한 시스템을 제공한다.

서문

척추 동물의 골격, 기관에 대한 구조 지원과 보호를 제공 이동성을 허용하고, 칼슘의 공급원 역할을한다. 생활 전반에 걸쳐, 세포 외 골 기질은 지속적으로 뼈의 안정성과 강성을 유지하기 위해 인계된다. 이 과정은 긴밀하게 조율 된 활동과 뼈를 형성하는 조골 세포와 뼈 재 흡수 파골 세포의 상호 작용을 필요로한다. 조골 세포는 다 능성 간엽 전구 세포로부터 유래하고, 유골 뼈 매트릭스 ^(10)의 일부를 형성 단백질 콜라겐이 생성된다. 조골 세포는 골의 항상성 ^(7)를 제어하기 위해 요구되는 세포 유형, 양자의 균형 작업을 달성하는 파골 세포와 상호 작용한다. 때문에 이러한 복잡한 상호 작용을 조절, 약물 치료 및 골 항상성에 대한 반응이 완전히 시험 관내 연구에서 사용하여 검사 할 수 없다. 따라서, 동물 모델에 대한 강한 요구가있다. 세포 배양 설정에 비해 생체 내 모델에 제공 할 수있다골 다세포 환경 내의 네트워크에 대한 통찰력.

수많은 마우스 모델 골다공증 ^(16)를 포함하여 인간 골 질환의 다양한 존재한다. 그러나 크기와 마우스 배아의 접근성 골격 프로세스의 실시간 이미징을위한 상당한 제한을 나타냅니다. 작은 경골 어류, 다른 한편으로는, 생체 내 영상을위한 매력적인 대안으로 작용한다. 제브라 피쉬 (다니오 레 리오)와 송사리 (오리 지 아스 쿠르 latipes)는 지난 20 년 ^{17, 19, 22, 24을} 통해 골격 연구를위한 인기있는 동물 모델이되었다. 경골 어류와 포유류의 뼈 구조와 생리적 수준에서 모두 매우 유사하며, 키 조절 유전자 및 신호 전달 경로의 대부분은 ^3을 보존하고 있습니다. 포유 동물에서와 같이, 경골 어류 신중 골아 세포와 골 형성 및 골 흡수의 균형 ⁽²⁶⁾ 파골 세포의 활성을 조절한다. 파이의 가장 중요한 광학 선명도SH 유충은 골 세포와 살아있는 동물의 세포 과정의 관찰을 용이하게 석회화 골격 매트릭스 ^{8, 9, 12, 21, 23,} 라벨을 형광 리포터의 사용을 허용한다. 또한, 유전 적 도구 일련 물고기 생 의학적으로 중요한 연구를 촉진하기 위해 생성되었다. 특히 송사리, CrispR / Cas9 ^{2, 6을} 추적 세포 혈통 및 사이트 특정 형질 전환 ^(14)가 최근 설립 널리 사용 ^15에있다 된 표적 유전자 돌연변이 방법하십시오.

작은 유생 경골 성공적 여러 약리 관련 약물 ^{1 (18)의} 발견으로 이끄는 화학 스크린에 사용되었다.

물고기 유충 DMSO 저농도 내성이며, 피부를 통해 또는 위장관 ^{1 ~ 5} 중, 그들의 수중 환경에서 화합물을 흡수 할 수있다. 우리 연구실 이전에 담당자다양한 osteoblast- 및 파골 세포 - 특이 적 프로모터의 제어하에 뼈 세포에서 형광 기자를 표현 orted 형질 전환 메다카 라인. ^{20, 21,} 성숙한 조골 세포 (오스테오칼신, OSC) ^(27), 및 파골 세포 (카 텝신 K, ctsk) ^24;이 조기 조골 세포 (osterix, OSX에 콜라겐 10A1, col10a1)를 포함한다. 또한 열 쇼크 - 유도 성 프로모터 ^(24)의 제어 하에서 파골 세포 유도 인자 핵 인자 κB 리간드 (RANKL) 수용체 활성제를 발현하는 형질 전환 라인을 생성.

이 시스템에서 RANKL의 유도 활성 파골 세포의 이소성 형성을 초래한다. 이 추체의 대폭 감소 광물로 증가 골 흡수 및 심한 골다공증 같은 표현형에 이르게. 최근이 모델에서 파골 세포 활성은 비스포스포네이트에 티드로 네이트 및 알렌드로네이트, TW에 의해 차단 될 수 있음을 보여 주었다일반적으로 인간의 골다공증 치료에 사용되는 O 약물, 따라서 골다공증 ^(27)에 적합한 모델 시스템으로 송사리의 유효성을 검사.

많아서 무리 크기 급속한 발전 및 배아의 작은 크기로, 형질 전환 메다카 유충 골다공증 약물의 대규모 스크리닝과 골 세포 거동의 생체 내 분석을 위해 유일하게 적합하다. 송사리의 연구는 따라서 효율적으로 세포 배양과 인간의 뼈 질환에 대한 새로운 치료 목표와 새로운 치료법을 발견 겨냥한 쥐 실험을 보완 할 수 있습니다.

본 연구에서는 일반적인 골다공증 약물, 알렌드로네이트와 송사리 뼈 기자 유충을 치료하는 프로토콜을 설명합니다. 장착 골 기질 및 골 세포의 라이브 영상을위한 제조 방법을 처리 수 유충 또한 상세히 설명한다. 이러한 프로토콜들은 쉽게 다른 작은 화학 화합물에 적용 할 수있는 골 근육 또는 골 흡수 약물로서 어느 작품.

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프로토콜

모든 실험은 싱가포르 국립 대학 (R14-293)의 승인 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 프로토콜에 따라 수행 하였다.

1. 생선 축산 및 태아의 컬렉션

1. 올리 WT, ctsk : nlGFP ^24, RANKL : HSE : CFP ^(24), 및 OSX : 제어 빛 사이클에서 mCherry ⁽²¹⁾ 단일 또는 26 ° C에서 화합물 형질 전환 메다카 물고기 (14 시간 빛, 10 시간 어둠) 산란을 유도합니다.
2. 빛이 켜진 후 매일 산란은 처음 30 분 동안 이루어집니다. 계란은 필라멘트를 통해 함께 스틱과 몇 시간 동안 여성의 복부에 부착합니다. 달걀 클러스터를 들고 여성 성인을 잡기 위해 미세 메쉬 그물을 사용합니다. 물고기가 잠시 그물 휴식 후 조심스럽게 신중하게 여성의 복부에서 수정란 클러스터를 제거 할 수있는 물고기의 복부를 마사지 할 수 있습니다.
   참고 : 건강한 송사리 여성약 5 개월 동안 20 계란 매일 - (10)를 생성 할 수 있습니다.
3. 60 밀리미터 플라스틱 페트리 접시에 계란을 놓습니다. 5 배아를 씻어 플라스틱 피펫을 사용 - 10 ㎖의 0.3 배 Danieau의 솔루션 (생선 매체 (19.3 mM의 염화나트륨, 0.23 밀리미터의 KCl, 0.13 mM의 _황산, 0.2 mM의 칼슘 NO _{3) 2,} 1.7 mM의 HEPES, pH를 7.0). 곰팡이 성장을 방지하기 위해 0.25 %의 1 mL의 물고기 매체의 2.5 L에 (w / v)의 메틸렌 블루 원액을 추가합니다.
4. 부드럽게 부착 필라멘트의 매듭을 형성하도록 달걀 클러스터 롤. 신중 개별 배아 (도 1A)를 획득하기 위해 수정란 클러스터에서 첨부 필라멘트를 제거하는 집게를 사용한다.
5. Iwamatsu 2004 ^(13)에 따라 배아를 무대.
6. 문화 20 - 28 ° C 배양기에서 60mm 플라스틱 페트리 접시 당 30 배아. 태아의 정상적인 발달을 보장하기 위해 매일 매체를 변경합니다.
   참고 : 부화 단계 (8 주위의 시간 - 9 d 개 postfertilization,DPF)는 생존을 위해 특히 중요하다. 깨끗한 미디어를 유지하고 좋은 유충의 생존율을 보장하기 위해 자유 부동 chorions를 제거합니다.

2. 형질 전환 배아 심사

1. 40X 배율을 사용하여, 형광 리포터 유전자 발현의 배아를 선별 형광 이미징 GFP, RFP 및 CFP 필터 수은 램프를 구비 한 입체 현미경을 사용한다.
2. 시각적으로 OSX를 식별 : mCherry 기자의 표현에 의해 mCherry 배아의 초기 형성 후방 헤드 (그림 1B, 화살표) 및 parasphenoid의 양쪽에, 같은 cleithrum 같은 두개골 뼈, 복부 두개골의 중심 위치 ( 그림 1B, 화살표).
   참고 : 기자의 표현은 이후 ²¹ 5 DPF에서 시작됩니다.
3. ctsk를 확인 : 강한 nlGFP 식으로 nlGFP 배아를 머리 (그림 1C, 화살표)와 꼬리 (그림 1C, 화살촉)에서부터6 DPF.
   참고 : 내생 파골 세포는 21 DPF 후 형성한다. 초기 단계 (6 DPF)에서 세포를 nlGFP이 발현하면, 지금까지지지 않은 파골 세포하지만 다른하지 양성 세포 ⁽²⁴⁾ ctsk.
4. RANKL을 확인 : HSE : 유비쿼터스 CFP 식으로 CFP 유전자 변형 배아를 2 DPF에 이상 검사 목적으로 실시 39 ° C에서 20 분 동안 짧은 열 충격 치료 후.
   참고 : RANKL과 CFP 유전자가 같은 양방향 열 충격 요소 (HSE)의 통제하에 있습니다. CFP 표현 성공 RANKL 유도 ^(24)를 나타냅니다.
5. 따라서 골다공증과 같은 표현형 ^(24)에 발생 트렁크 영역에서 이소성 파골 다수의 유도 후 9 DPF에서 2 시간 열 쇼크 치료 또는 - 1.5을 수행한다.
   참고 : 내생 적 트리거되지 않습니다 휴면 파골 세포의 전구 세포의 자궁외 활성화에 9 DPF 결과에 의한 형질 전환 RANKL의 발현21 DPF 전에. 안정 39 ° C의 조건을 획득하기 위해 수조를 사용한다. 페트리 접시 포함 메다카 배아가 물 표면에 떠 보자. 확인 페트리 접시의 뚜껑은 요리의 침몰을 방지하기 위해 건조합니다.
6. 이러한 RANKL 등의 화합물 라인에서 화면 배아 : HSE : CFP / ctsk : nlGFP 이중 형질 전환 및 OSX : mCherry / RANKL : HSE : CFP / ctsk : nlGFP 트리플 형질 전환, 각 유전자의 발현 패턴에 따라.
   참고 : Hemizygous 및 동형 접합 유전자 변형 배아가 리포터 유전자의 서로 다른 형광 수준으로 구분 하였다. 동형 접합성 형질 전환 배아 hemizygous에 비해 두 배 정도 된 형광 강도를 가지고 있었다. HSE : CFP 및 ctsk : 모두 RANKL에 대한 동형 접합이었다 복합 라인 nlGFP 반복 여러 세대에 걸쳐 incrossing에 의해 얻어졌다. mCherry / RANKL : HSE : CFP / ctsk : 트리플 유전자 변형 OSX에 대한 nlGFP 물고기, 동형 접합 RANKL : HSE : CFP / ctsk : mCherry 캐리어 : nlGFP 물고기가 동형 접합 OSX 교차했다. 그 결과 이형 트리플 형질 전환 자손이 제기 RANKL에 대한 동형 접합 배아를 얻기 위해 incrossed했다 : HSE : CFP합니다. RANKL : HSE : CFP 트랜스 자궁외 파골 세포의 효과적인 유도를 얻기 위하여 동형이어야한다.

그림 1 : WT 7 D Postfertilization에서 형질 전환 메다카 배아 (DPF). 를했다. WT 배아는 시야 조명으로 관찰. B. OSX 나타내는 형질 전환 배아 다음 cleithrum (화살표) 및 parasphenoid (화살촉) 주위 mCherry 식을. C. ctsk을 나타내는 형질 전환 배아 : nlGFP 머리 (화살표)의 표현과 꼬리 (화살촉). 스케일 바 : 500 μm의.025 / 55025fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

메다카 애벌레의 3 비스포스포네이트 치료

1. 용량 - 반응 연구를위한 비스포스포네이트 수 (bps)의 여러 농도를 함유 한 용액을 준비한다.
   참고 :이 프로토콜에 사용되는 대표적인 BP는 알렌드로네이트입니다.
   1. 원액을 제조 100 μg / ml의 농도 물고기 매체 알렌드로네이트를 녹인다.
   2. 완전한 용해를 보장하기 위해 볼텍스 믹서를 사용한다. 4 ° C에서 원액을 저장합니다.
   3. 농도의 일련 물고기 배지 원액을 희석하여 다른 작업 용액을 제조 (즉, 25, 37.5, 50, 62.5, 75 μg의 / ㎖).
      참고 : 다른 약물이 송사리 유충 시스템을 사용하여 테스트시 고려되어야 다른 흡수, 분포, 대사, 배설 (ADME) 매개 변수를 가질 수있다. 또한, 약물의 용해도와 안정성이 경우 다를 수 있습니다수용액으로서 도포. 적은 수용성 화합물은 최초의 DMSO 등의 유기 용매에 용해해야 할 수 있습니다. 이 경우, 스톡 용액을 상기 물고기 배지에서 희석하여 DMSO에 준비된다. 물 (생선 배지)에서 작동 용액 몇 WK 동안 냉장고에 저장 될 수 있습니다. 그러나 DMSO를 포함하는 솔루션은 결정화를 방지하기 위해 RT에 저장해야합니다.
2. 여섯 웰 플레이트로 전송 송사리 애벌레 (유충 육 / 웰) 이후 BP (알렌드로네이트) 치료를위한.
3. 조심스럽게 깨끗한 플라스틱 피펫을 사용하여 물고기 매체를 제거하고 잘 각각 알렌드로네이트 용액의 소량 (약. 0.5 ml)에 추가합니다.
4. 덜 집중 알렌드로네이트 솔루션에 특히 중요합니다 추가 BP 솔루션이 희석 될 수 있습니다로 남은 생선 매체를, 피하십시오.
5. 깨끗한 플라스틱 피펫으로 각 우물에서 알렌드로네이트 용액 (0.5 mL의에)의 작은 볼륨을 제거하고 더 큰 volu로 교체알렌드로네이트 용액 날 (4 mL)을 첨가 하였다.
6. 정상 배아 발달을 보장하기 위해 매체 매일 변경합니다.

광물 - 뼈 매트릭스 4. 라이브 염색

1. 각각 1 %, 0.1 % 스톡 용액을 준비 생선 배지 50ml에 칼 세인 0.05 g (알리자린 -3- 카복실산 methyliminodiacetic ALC) 알리자린 complexone 0.5 g을 녹인다. 완전한 용해를 보장하기 위해 볼텍스 믹서를 사용한다.
   주 : 메틸렌 블루의 첨가없이 생선 ​​매질이 사용되며 후속 단계는 유충의 형광도를 감소.
2. 얼룩 솔루션을 필터링하는 주사기 및 일회용 필터 (0.2 μm의)를 사용합니다. 실온에서 어둠 속에서 필터링 솔루션을 저장합니다.
   참고 : 필터링 된 깨끗한 ALC 염색 액의 색은 오렌지에 노란색 어둡습니다. 필터링 분명 칼 세인 용액의 색은 밝은 노란색이다. 해법은 몇 달 동안 사용될 수있다.
3. 물고기 매체에 여과 ALC 또는 칼 세인의 재고 솔루션 1:10 희석애벌레 9 내지 17 DPF를 사용하는 경우 28 ° C 배양기에서 2.5 시간 (0.01 %의 칼 세인 용액) - 2 시간 (0.1 % ALC 용액) 2 - 1.5에 대한 송사리 애벌레를 품어. 어둠 속에서 샘플을 보관하십시오.
4. 깨끗한 플라스틱 피펫을 사용하여 신선한 생선 매체에 애벌레를 전송합니다.
5. 깨끗한 플라스틱 피펫 물고기 매체를 제거하고 신선한 생선 매체를 추가 할 수 있습니다. 3에 대해이 단계를 반복 - (각각, ALC 또는 칼 세인) 더 빨강 - 또는 노란색 염색 솔루션까지 4 시간이 남아있다. 매체에서 표면 형광을 피하기 위해 이미징을 설치하기 전에 60 분 - 30 물고기 매체에 애벌레를 남겨주세요.
   참고 : 0.1 % ALC 염색 솔루션은 확장 노출 시간에 대한 송사리의 유충에 유해한입니다. 이상 2 시간의 배양 시간은 유충의 생존에 영향을 미칩니다. 염색 농도와 시간에 따라서 최적의 배아 생존 염색 결과를 달성하기 위해서 다른 단계를 위해 최적화 될 필요가있다.

5. 라이브 형광 이미징 P>

1. 물고기 배지에서 0.01 % Tricaine (에틸 3- 아미노 벤조 에이트 메탄)와 송사리 애벌레를 마취.
   참고 : 마취 유충은 5 후 고정되기 - Tricaine 용액에 10 분, 보통 측면 또는 뒤에 하나를 누워있다.
2. 관심 영역에 따라 유충을 찾으시는 플라스틱 microloader를 사용합니다. 이 프로토콜에서 사용하는 유충의 횡 방향이다.
3. 이미징을위한 형광 조명 실체 현미경을 사용합니다. 유충 (머리 앞쪽 트렁크, 후방 트렁크, 꼬리)의 다른 부분에 초점을 맞춘 이미지를 촬영할 때 높은 배율을 사용합니다. 적절한 이미지 처리 소프트웨어 (그림 3G에서 세트)를 사용하여 중복 영역에서 함께 개별 이미지를 스티치.
   주 :이 정확한 초점 평면의 모든 중요한 신체 부위의 화질을 개선하는 데 도움이.
4. 이미징 후 복구를 위해 물고기 매체에 애벌레를 돌려줍니다.

TLE "> 6. 라이브 공 촛점 이미징

1. 그들이 고정화 될 때까지 10 분 - 5 물고기 배지에서 0.01 % Tricaine와 애벌레를 마취.
2. 전자 레인지에서 가열함으로써 어류 매체 1.5 %로 아가로 저 융점 녹인다. 쿨 약 30 ° C이 솔루션입니다.
3. 유리 바닥 페트리 접시에 생선 매체에 아가로 오스 액체 1.5 % 저 융점의 1 mL의 - 0.5을 추가합니다. 깨끗한 플라스틱 피펫을 사용하여 솔루션에 마취 유충을 전송합니다.
   참고 : 액체 저 융점 아가로 오스의 온도가 애벌레 해를 끼치 지 충분히 낮다는 특별한주의하십시오.
4. 아가로 오스 고형화 전에 배양 접시의 바닥에 유충 밀어 플라스틱 microloader를 사용하여 관심 영역에있어서 유충 배향. 이 프로토콜에서 사용하는 유충의 횡 방향이다.
   참고 : 아가로 오스가 완전히 굳은 후에 샘플 공 촛점 라이브 이미징을위한 준비가되어 있습니다.
5. ACQ하는 공 초점 현미경을 사용하여uire 이미지.
6. mCherry와 ALC 염색 분석을위한 543 nm의 레이저 라인을 사용합니다. nlGFP에 대한 488 nm의 레이저 라인을 사용하고 칼 세인 염색 분석.
7. 촬영 후, 페트리 접시에 생선 매체를 추가하고 조심스럽게 아가로 오스에서 유충을 제거하는 미세 주사기 바늘 (27 G의 X 1.5 ") 한 쌍을 사용합니다. residually 복구 물고기 매체와 페트리 접시에 아가로 오스 부착와 애벌레로 이동 .
8. 이미지 분석 소프트웨어 ^(27)를 이용하여 이미지를 처리.

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결과

풍부한 달걀 번호뿐만 아니라 유충의 작은 크기는 송사리 약물 스크리닝에 대한 우수한 모델을 만든다. 단일 여섯 웰 플레이트는 통계적으로 유의 한 데이터를 제공하기에 충분 하였다 (36) 애벌레까지 배양 하였다. 골격 분석을 위해 물고기를 사용하는 또 다른 큰 장점은 라이브 영상을 수행의 가능성이다. 물고기 유충의 투명도는 골 세포뿐만 아니라 광물을 시각화하기 위해서는 골 기질에 결합...

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토론

프로토콜 내에서 중요한 단계

다른 샘플을 비교할 때 열 충격 처리를위한 조건이 일치하고 안정한 것이 중요하다. 안정한 온도 조건은 ctsk 스크리닝에 의해 확인 될 수있다 결과적으로, 비교 파골 세포 형성을 형질 전환 유충에서 RANKL 유도 비슷한 수준을 보장하고 : nlGFP 식. 궁극적으로,이 ALC 염색에 의해 검증으로 유도 이소성 골 흡수와 골다공증 병변의 유사한 정도에 ...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alendronate	Sigma	A4978
alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone	Sigma	A3882
Calcein	Sigma	C0875
ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)	Sigma	A5040
ImageJ (1.4.3.67)	National Institute of Health (NIH)		https://imagej.nih.gov/ij/
LSM 510 Meta confocal	Zeiss
LSM Image Browser (4.2.0.121)	Zeiss		http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html
Micro-loader	Eppendorf	5242956003	Eppendorf ep T.I.P.S 20 μL
NIS-Elements BR 3.0 software	Nikon
Photoshop CS6 (13.0.0.0)	Adobe
SMZ1000 stereomicroscope	Nikon