쥐 동소 이식 방광 종양 모델 및 종양 탐지 시스템

요약

이 프로토콜은 암컷 C57BL / 6J 마우스의 종양 성장을 모니터링 뮤린 동소 방광 종양의 발생을 설명한다.

초록

이 프로토콜은 전립선 특이 항원 (PSA)를 분비하도록 변형 된 뮤린 방광암 세포주 MB49을 사용하여 암컷 C57BL / 6J 마우스에서 방광 종양의 생성을 설명하고, 종양 주입의 확인 절차. 간단히, 마우스는 주사제를 사용하여 마취하고 지느러미 위치에 배치하게된다. 소변은 방광 비게하고 폴리 -L- 라이신 (PLL) 50 μL를 천천히 24 G IV 카테터를 사용하여 10 μL / 20 s의 속도로 주입된다. 이는 카테터 stoppering 20 분 동안 방광에 남아있다. 카테터를 제거하고, PLL은 방광에 부드러운 압력 비게된다. 이는 쥐 방광암 세포주를 10 μL / 20 s의 속도로 (1 × ¹⁰⁵ 세포 / 50 μL)의 점적 따른다. 카테터는 조기 탈출을 방지하는 마개를한다. 1 시간 후, 마우스를 반전 약물 부활되고, 블래 더는 비게된다. 느린 점적 율이 중요이 종양은 상부 요로 및 신장에서 발생 될 수 있습니다 방광 요관 역류를 줄일 수있다. 세포주 잘이 주입 후 종양 크기 불균일을 초래할 수 있기 때문에, 세포의 응집을 감소시키기 위해 재현 탁한다.

이 기술은 고효율 종양을 유도한다. 종양의 성장은 소변 PSA 분비에 의해 감시된다. PSA 마커 모니터링 방광 종양의 존재의 검출을위한 초음파 또는 형광 이미징보다 더 안정적이다. 방치하면 사주 - 마우스의 종양은 일반적으로 약 3가 최대 크기에 부정적인 영향 상태에 도달한다. 종양의 성장을 모니터링하여,이를 성공적으로 종양이 주입되지 않은 것들로부터 경화 된 생쥐를 차별화시킬 수있다. 단지 종점 분석으로, 후자는 실수 요법으로 치료 된 것으로 간주 될 수있다.

서문

이 방법의 목적은 쥐 정위 방광 종양을 생성하기 위해 종양 이식없이 생쥐가 종점 분석에서 경화 된 것으로 생각되지 않도록, 가능한 한 정확하게 주입 된 종양을 모니터하는 것이다. 전반적으로, 상기 방법은 분석을 위해 실험 쥐의 다수의 필요성을 감소 및 치료 학적 성과를 결정하는데 큰 정확성을 보장한다 도시.

이식 종양 세포를 피하 임상 질환의 환경 요점을 되풀이 또는 치료 전략의 개발을 가능하게하지 않기 때문에 암에 대한 동 소성 모델의 개발이 중요하다. 블래 더의 구조는 직접 최소 전신 효과 방광 방광암 치료의 점안을 허용한다. 따라서, 이러한 소성을 모델로이 환경을 요점을 되풀이 동물 모델, 새로운 치료법을 평가하는 것이 중요하다. 모든 실험 장치에서 도출 된 결론은 dependen된다모델의 제한시 t.

몇 가지 기술은 쥐에서 동소 방광 종양의 생산을 위해 개발되었다. 이는 방광의 글리코 사 미노 글리 칸 층을 손상 주입 될 종양 세포 활성화에 의존한다. 사용 된 기술은 블래 ^1,2- 한 부위에서 종양 발생을 선도, 방광 벽에 손상 단일 지점 결과 전기 소를 포함한다. 그러나, 전기 소를 사용하여 종양 이식 성공률 오퍼레이터 의존적 10 변하는 - 90 %, 그리고....

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프로토콜

싱가포르 국립 대학의 동물 사용과 (프로토콜 번호 084/12)를 처리에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 가이드 라인에 부착 된 모든 동물 작동합니다.

1. 체외에서 MB49-PSA 세포 성장 및 PSA의 분비를 측정

1. 유지 완료 둘 베코 변형 이글 중간 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 (DMEM), 2 밀리몰 / L의 L - 글루타민의 방광암 세포 MB49-PSA ¹⁵ 뮤린 및 인큐베이터 0.05 ㎎ / ㎖ 페니실린 - 스트렙토 마이신 (37)에서 ° C, 5 % CO _2. 200 μg의 / mL의 하이 그로 마이신 B는 PSA 분비 세포의 선택 압력을 유지하기 위해 추가합니다.
2. PSA 분비 판 6 웰 배양 접시에 1 × ¹⁰⁶ 세포를 확인하고 48 시간 동안 5 % CO ₂ 존재 하 37 ℃로 배양.
3. 이틀 후, PSA 측정을위한 뜨는를 수집합니다.
   1. 파스퇴르 피펫을 사용하면은 한모금을 전송15 ML의 원심 분리기 튜브에 ernatant.
   2. 부동 세포와 파편을 제거하기 위해 250 XG에서 5 분 동안 원심 분리기. 1.....

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결과

MB49 세포로부터 PSA 분비가 성장 배지로 변화였다. 이 증가 된 PSA 분비 (도 1a)을 초래하기 때문에 MB49-PSA는 DMEM 배지에서 성장시킨다. 점착성 ELISA 실시간 PCR의 감도를 결정하기 위해, MB49-PSA 분비 세포의 다른 번호 MB49 부모 세포와 혼합 하였다. 실시간 PCR 분석은 100 PSA 분비 세포 / 1 × ¹⁰⁶ 세포 (도 1c)를 검출하면서 PSA ELISA 1 × ^.......

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토론

프로토콜에서 가장 중요한 단계는 1) 성공적 세포주의 발암를 유지하는 단계; 2) 마우스에서 종양 세포의 주입 전에 측정 PSA 분비를 보장; 종양 크기의 변화를 감소 시키도록 3) 주입 한 세포 현탁액을 생성하는 단계; 4) 신장 종양 세포 주입의 결과 방광 요관 역류를 방지하기 위해 느린 속도로 세포를 주입.

체외에서 장시간 통과 한 후, MB49 / MB49-PSA 세포는 쥐에서 종양?.......

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
MB49-PSA cells	N/A	N/A	ref (Wu QH, 2004)
RPMI 1640 media	HyClone	SH30027.01
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) media	Biowest	L0102
Fetal Bovine Serum (FBS) South American	Biowest	S1810
Fetal Bovine Serum (FBS) South American, Premium	Biowest	S181B
Fetal Bovine Serum (FBS)	HyClone	SH30088.03
L-glutamine	Biowest	X0550
Penicillin-Streptomycin	Biowest	L0022
Hygromycin B	Invitrogen	10687-010
free PSA (Human) ELISA kit	Abnova	KA0209
TRIzol Reagent for RNA extraction	Ambion	15596026
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor	Applied Biosystems	4374967
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems	4304437
TaqMan Gene Expression Assay – Mouse Actb	Applied Biosystems	4331182	Mm00607939_s1
TaqMan Gene Expression Assay – Human KLK3	Applied Biosystems	4331182	Hs00426859_g1
C57BL/6J female mice	In Vivos		4 - 6 wk old
Anesthesia (75 mg/kg Ketamine and 1 mg/kg Medetomidine)	Local pharmacy
Reversal drug (1 mg/kg Atipamezole)	Local pharmacy
Ear punch	Electron Microscopy Sciences	72893-01
Hartmann's solution or Compound sodium lactate	B Braun
Ophthalmic ointment - Duratears sterile ocular lubricant ointment	Alcon
Heat pack - HotHands handwarmers	Heatmax Inc
Introcan Certo IV catheter	B Braun	4251300	24 G x 3/4″
Aquagel Lubricating jelly	Local pharmacy
Poly-L-lysine solution, 0.01%,	Sigma	P4707
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693159001
Quantichrom Creatinine Assay Kit	BioAssay Systems	DICT-50
Fluorescent dye - VivoTrack 680	Perkin Elmer	NEV12000
RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition Solution	Ambion	4427575
Name	Company	Catalog number	Comments
Equipment and Software
7500 Realtime PCR System	Applied Biosystems
7500 Software v2.3	Applied Biosystems
Metabolic Cage	Tecniplast	Vertical type rack for 12 cages
BD FACSCanto I system	BD Biosciences
BD FACSDiva software v7	BD Biosciences
IVIS SpectrumCT in vivo imaging system	Caliper Life Sciences
Living Image Software v3.1	Caliper Life Sciences
Vevo 2100 imaging system	VisualSonics