소뇌 대동맥 파열 상해 : 효율적<em&gt; In Vivo</em&gt; 평활근 세포 증식과 내피 기능 모델

요약

심혈관 수술 (바이 패스 수술, 혈관 성형술 또는 스텐트 삽입) 후의 재 협착은 이러한 과정의 내구성을 감소시키는 중요한 문제입니다. 이상적인 치료법은 내피 세포의 재생을 촉진시키면서 평활근 세포 (VSMC)의 증식을 억제합니다. 우리는 생체 내에서 VSMC의 증식과 내피 기능의 동시 평가를위한 모델을 설명합니다.

초록

혈관 성형술이든 우회 수술이든 동맥 재건술은 내피 세포 손상 및 혈관 평활근 세포 증식을 유발하는 의원 성 외상을 포함합니다. 일반적인 쥐 모델은 경동맥과 대퇴 동맥과 같은 작은 혈관을 연구합니다. 여기서 우리는 VSMC 증식과 내피 장벽 기능이 대형 혈관에서 동시에 평가 될 수 있는 생체 내 시스템을 설명한다. 우리는 C57BL / 6 마우스의 손상에 대한 신장 하 대동맥 반응을 연구했습니다. 대동맥은 좌측 신장 정맥에서 대퇴 동맥 분 지로 손상되었는데, 코튼 팁 도포기로 5 초간 30 회 변형시켰다. 형태 학적 변화는 전통적인 조직학으로 평가되었다. 대동맥 벽 두께는 내강 표면에서 외막까지 측정되었다. VSMC 증식을 입증하기 위해 EdU 통합 및 DAPI 및 알파 - 액틴에 의한 카운터 염색을 사용 하였다. ERK1 / 2 (내막 과형성 형성의 알려진 조절 인자)의 활성화가 억제되었다Western blot 분석으로 채취 하였다. 염증의 효과는 B 세포, T 세포 및 대 식세포에 대한 면역 조직 화학 법에 의해 결정되었다 . 내피 세포의 각면을 주사 전자 현미경 (SEM)으로 시각화 하였다. Evans Blue 염색으로 내피 장벽 기능을 측정 하였다. Transmural 손상으로 대동맥 벽이 두꺼워졌다. 이 손상은 손상 후 3 일째에 가장 현저하게 VSMC 증식을 유도하고 ERK1 / 2의 조기 활성화 및 p27 ^kip1 발현을 ^감소 시켰다. 부상으로 혈관벽에 B 세포, T 세포 또는 대 식세포 침윤이 증가하지 않았습니다. 상해로 인해 부분 내피 세포 누출과 세포 - 세포 접촉의 손실이 발생했습니다. 손상으로 인해 7 일 후에 기준선으로 돌아온 내피 장벽 기능이 크게 상실되었습니다. 횡격막 횡격막 둔 상동맥 손상 모델은 대형 선박에서 VSMC 증식과 내피 장벽 기능을 동시에 연구 할 수있는 효율적인 시스템을 제공합니다.

서문

재 협착 심혈관 수술 (바이 패스 수술, 혈관 성형술 또는 스텐트 삽입)은 이러한 과정의 내구성을 감소시키는 중요한 문제입니다. 모든 재 혈관 화 절차는 재협착에 시달립니다. 재 협착 (약물 방출 스텐트 및 약물 코팅 된 풍선)을 방지하는 현재의 전략은 혈관 평활근 세포 (VSMC) 및 내피 세포 증식 (EC)을 억제한다. 결과적으로, 이러한 중재는 VSMC가 중재하는 재 협착을 예방할뿐만 아니라 내피 세포의 재생을 막습니다. 손상되지 않은 내피없이 환자는 출혈 합병증의 위험이있는 현장 혈전증의 위험을 줄이기 위해 강력한 항 혈소판제를 사용해야합니다. 이상적인 치료법은 VSMC의 증식을 억제하면서 내피 세포의 재생을 촉진합니다. 따라서, 생체 내에서 VSMC 증식과 내피 장벽 기능을 동시에 연구 할 필요가있다.

현재,재 협착의 알 마우스 모델 ¹ . 이 모델에는 경동맥 결찰 및 대퇴 동맥 와이어 손상 ^{2가 포함} 됩니다. 대동맥 모델은 스텐트 배치 ³ , 풍선 손상 ⁴ 및 대동맥 동종 이식 ^{5를 포함} 합니다. 현재 모델은 모두 제한되어 있습니다. 경동맥 연결은 혈류가 매개되는 신생 내막 병변을 유발하고 내피 손상을 일으키지 않습니다. 또한 경동맥과 대퇴 동맥은 인간 혈관보다 세포 배양이 훨씬 적어서 병독성이 제한됩니다. 직경 약 1.3 mm 인 마우스 대동맥은 임상 관련 (관상 동맥) 인간 동맥 (3)과 근사하는 유일한 혈관입니다.

질병의 쥐 대동맥 모델의 번역 가능성에도 불구하고, 현재 모델에는 한계가 있습니다. 이러한 모델은 첨단 미세 수술 기술과 혈관 성형 풍선 및 스텐트와 같은 전문 장비가 필요합니다. 여기서, 우리는VSMC의 증식을 동시에 유도하고 내피 장벽 기능을 파괴하는 새로운 재현 가능 기술.

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프로토콜

윤리 성명서 : 동물 취급을위한 프로토콜은 메릴랜드 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) (프로토콜 번호 0416009)의 승인을 받았고 AAALAC-International 표준에 따라 시행되었습니다.

1. 수술 절차

1. 마취 기법
   1. 생존 수술에 사용 된 모든기구를 121 ° C에서 30 분 동안 증기 멸균하여 소독하십시오.
   2. 정밀 증발기 를 통해 전달 되는 100 % O ₂ 및 2.5 % 이소 플루 란 을 포함 하는 유도 탱크를 통해 마취를 유도합니다. 사후 유도, isoflurane을 중단하고 O _2로 챔버를 플러시하십시오. 안면 마스크 를 통한 1.5-2 % isoflurane과 흡입에 의한 1 L / min O2로 마취를 유지하십시오.
   3. 인원을 보호하기 위해 배기 가스 흡착을위한 숯 제거제에 유도 챔버와 안면 마스크를 부착하십시오. 시위로 적절한 마취기를 확보하십시오.유해한 자극 (발가락 핀치)에 대한 반응이 없다는 것.
   4. 등온 패드가있는 수술 트레이로 구성된 수술장을 만들어 수술 중에 열을 받치도록하십시오. 추가적인 등온 패드는 회복 케이지에서 동물에게 열적지지를 제공합니다.
2. 동물 준비
   1. 10-12 주령의 수컷 C57BL / 6 마우스에 대해 다음 조사를 수행하십시오.
   2. 탈모 제 또는 40 번 칼날이 달린 전기 클리퍼로 흉골에서 사타구니 부위까지 동물 복부 복부 표면의 머리카락을 제거합니다.
      1. 탈모제의 경우 2-3 분 동안이 화합물을 수술 부위에 바른 후면으로 제거하십시오. 우리는 상업적으로 이용 가능한 수산화칼슘과 수산화 나트륨 화합물을 사용합니다.
   3. 70 % 알콜로 어깨 부분을 준비하고 25 게이지 또는 더 작은 보어 바늘로 carprofen (5 mg / kg)을 피하 주사하십시오. 이치료는 동물을위한 수술 후 진통제를 제공 할 것입니다.
   4. 외과 분야에 동물을 전송하고 지느러미 응급실에서 위치.
   5. 깨끗한 코튼 어플리케이터 또는면 거즈로 8-12 %의 섭취 된 요오드를 문질러 수술 부위를 준비하십시오. 그런 다음 70 % 알코올로 피부를 두 번 헹굽니다.
   6. 각막 건조의 발병률을 줄이기 위해 안구 윤활제를 양안에 넣으십시오. 멸균 드레이프로 수술 부위를 덮으십시오.
3. 수술 기법
   1. 중간 복부 개복술 절개를 대략 2-2.5 cm 길이로 만들고, 칼피스를 즉시 꼬리뼈 골반쪽으로 가져오고 골반쪽으로 확장합니다.
   2. 소장과 십이지장을 동원하여 오른쪽 옆으로 반사시킵니다. 노출을 향상시키기 위해 내장을 포장 할 수 있도록 주사 용 멸균 식염수로 닦고 닦아 낸 멸균 된면을 겹쳐서 감습니다.
   3. 소장이 오른쪽에 동원되어복강 내막을 노출시키고 복부 대동맥을 좌측 신장 정맥에서 대동맥 분기로 노출시킨다 ( 그림 1 ).
   4. 멸균 된 면봉으로 된 애플리케이터로 각 5 초 동안 30 회 연속 분쇄합니다.
   5. 패킹을 제거하고 내장이 원래 위치로 돌아가도록하십시오.
   6. 실행중인 4-0 흡수 monofilament 봉합사 (polydioxanone)로 근막을 닫으십시오. 피부는 6-0 비 흡착성 모노 필라멘트 봉합사 (나일론)로 막습니다.
4. 복구 및 사후 절차 관리
   1. 절차가 끝나면 등온 패드에 깨끗한 침구가있는 복구 케이지에 동물을 넣어 동물이 정상적으로 보행 할 수있을 때까지 열 지원을 계속하십시오. 흉골의 머리맡을 유지할 수있을 때까지 동물을 방치하지 마십시오.
   2. 수술 후 처음 4 시간 동안 매 시간마다 동물을 관찰하십시오. 동물이 정상적으로 돌아 오는 동안 나는 할당 된 축산 실로 그것이 완전히 회복 될 때까지 동물은 다른 동물의 회사에 수용되지 않을 것입니다.
   3. 수술 후 첫 72 시간 동안은 동물을 하루 두 번, 그 후 일주일에 적어도 3 번은 동물을 관찰하십시오. 모니터링은 일주일에 세 번 동물의 무게를 측정하는 것을 포함합니다.
   4. 수술 후 첫 72 시간 동안 carpofen (5 mg / kg)을 매일 두 번 피하 투여하십시오.

2. 조직 조달

1. 안락사의 방법
   1. 미리 정해진 시간에 동물을 안락사하십시오.
   2. 정밀 증발기를 통해 전달되는 100 % O ₂ 및 2.5 % 이소 플루 란을 포함하는 유도 탱크를 통해 마취를 유도합니다.
      1. 내피의 완전성을 연구하기 위해 Evans Blue 염료를 동물에게 투여하십시오.
         참고 : Evans Blue는 알부민에 대한 결합 친화력이 높은 음전하를 띤 아조 염료이며 손상되지 않은 내피가없는 경우에만 혈관을 염색 할 수 있습니다s = "xref"> 6.
      2. 내피 완전성 연구를 위해, 안락사시, 0.3 % 에반스 블루 (Evans Blue) 염색약 5 mL와 생리 학적 압력 5 mL PBS로 5 분간 동물을 관류시킨다. 동물은 재관류 과정 중에 마취 외과 수술 평면에 유지됩니다.
   3. 깊은 마취기를 마친 후 흉골 절개로 가슴을 엽니 다. 오른쪽 아트리움에서 열혈을하여 동물의 혈액을 배수시키고 21G 주사 바늘로 왼쪽 심실에 액세스하고 오른쪽 심방의 유출액이 깨끗해질 때까지 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)를 주입하십시오.
   4. PBS로 재관류 한 후 정중선 절개를 통해 복부로 들어갑니다.
   5. 다시 한번, 소장을 신장 우측 대동맥을 드러내는 복부의 오른쪽으로 동원시키고, 인접한 조직으로부터 대동맥을 급히 절개하여 왼쪽 신장 혈관에서 대동맥 분기로 절제합니다.
   6. excised 대동맥을 4 % paraformald에 보관하십시오.조직 처리가 발생할 때까지 ehyde 용액.
      1. 내피 완전성 연구를 위해, 대동맥을 세로로 열고 내강 표면 전체를 노출시키는 왁스 시트에 핀을 고정시킵니다. Evans Blue dye ^6로 염색 정도에 따라 혈관 내피의 정성 평가를 수행하십시오.
      2. 다른 조직학 검사의 경우, 대동맥을 횡 방향으로 절개하고 조직 학적 방법에 따라 최적 절개 온도 (OCT) 화합물에 삽입하십시오 ⁷ .

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결과

OCT에 내장 된 횡단 절제 된 대동맥을 절단하고 hematoxylin과 eosin으로 염색 한 후 Verhoeff-Van Gieson (VVG) 염색으로 반으로 염색하여 내부 및 외부 신축성 층을 확인 하였다. 가식 과정 (개복술과 작은 창자 동원)으로 치료 한 동물의 대동맥에 비해 크러쉬 부상으로 대동맥 벽 비후가 유발되었습니다. 외막에서 내강까지의 거리로 평가 한 벽 두께는 손상 3 일 후 가장 컸다 (42.2 ± 1....

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토론

우리는 내측 과형성 및 내피 장벽 기능 장애를 초래하는 쥐 대동맥 손상 모델의 효과를 특성화했다. 대동맥 내막을 따라 부분적인 EC 분리는 세포 - 세포 접촉의 손실과 세포 돌출의 증가를 수반했다. 따라서, 내피 장벽 기능이 현저히 손상되어 분열 촉진 물질 민감성 신호 전달 경로가 자극되어 VSMC가 증식되고 혈관벽이 두꺼워진다. 이 모델의 강점은 다른 대동맥 질환 모델보다 배우고 실행하는 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ocular lubricant	Dechra	17033-211-38	Pharmaceutical agents
Isoflurane	VetOne	502017	Pharmaceutical agents
Carprofen	Zoetis	26357	Pharmaceutical agents
Precision vaporizer	Summit Medical	10675	Surgical supplies
Charcoal scavenger	Bickford Inc.	80120	Surgical supplies
Isothermal pad	Harvard Apparatus	50-7053-R	Surgical supplies
Sterile cotton-tipped applicator	Fisher Scientific	23-400-124	Surgical supplies
4-0 absorbable monofilament suture	Ethicon, Inc	J310	Surgical supplies
5-0 non-absorbable monofilament suture	Ethicon,Inc	1666	Surgical supplies
21-gauge x 1 inch needle	BD Biosciences	305165	Surgical supplies
25-gauge x 1 inch  needle	BD Biosciences	305125	Surgical supplies
Dry sterilizer	Cellpoint	7770	Surgical supplies
Fine scissors	Fine Science Tools	14058-09	Surgical instruments
Adson forceps	Fine Science Tools	11006-12	Surgical instruments
Dumont #5 fine forceps	Fine Science Tools	11254-20	Surgical instruments
Vannas Spring Scissors 3 mm cutting edge	Fine Science Tools	15000-00	Surgical instruments
Needle driver	Fine Science Tools	91201-13	Surgical instruments
Scalpel handle #4	Fine Science Tools	10004-13	Surgical instruments
Scalpel blades #10	Fine Science Tools	10010-00	Surgical instruments
PBS	Lonza	17-516F	Reagents for tissue processing
Evans Blue	Sigma-Aldrich	E2129	Reagents for tissue processing
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Reagents for tissue processing
Modeling wax	Bego	40001	Reagents for tissue processing
OCT compound	Tissue-Tek Sakura	4583	Reagents for tissue processing
Mayer's hematoxylin solution	Sigma-Aldrich	MHS16	Reagents for immunohistological analysis
Eosin Y solution alcoholic	Sigma-Aldrich	HT110316	Reagents for immunohistological analysis
Elastin stain kit	Sigma-Aldrich	HT25A	Reagents for immunohistological analysis
Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit	Invitrogen	C10337	Reagents for immunohistological analysis
Anti-Erk1/2 antibody	Cell Signaling Technology	4695	Reagents for immunohistological analysis
Anti-phospho-Erk1/2 antibody	Cell Signaling Technology	4370	Reagents for immunohistological analysis
Anti-p27kip1 antibody	Cell Signaling Technology	3698	Reagents for immunohistological analysis
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	T9159	Reagents for immunohistological analysis